王俊杰 何振宇 段仁慧

肺癌是對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。目前肺腺癌的發(fā)病率已經(jīng)占據(jù)所有肺癌病理類型之首。在全球范圍內(nèi)肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，國(guó)內(nèi)外有關(guān)肺癌預(yù)防和治療的方法也層出不窮。但是早期的診斷和治療及預(yù)后未能顯著的提高并解除人類的困擾。一般認(rèn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的增殖遷移等行為相關(guān)聯(lián)[2]。ASPM基因是果蠅異常紡錘體的人類直系同源基因，也是最常見(jiàn)的常染色體隱性小頭畸形的突變基因。目前的研究發(fā)現(xiàn)ASPM在細(xì)胞的周期過(guò)程中發(fā)揮重要作用，文獻(xiàn)[3]報(bào)道，ASPM過(guò)表達(dá)于惡性腫瘤。本文我們主要是通過(guò)文獻(xiàn)檢索、臨床資料的收集及免疫組化等方法。確定ASPM在肺腺癌中的相關(guān)性及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 本研究所用的肺腺癌組織和正常肺組織均來(lái)源于河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的患者。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)過(guò)了新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，而且患者本人具有知情同意權(quán)。所有的組織都是經(jīng)手術(shù)取下來(lái)立刻放入液氮中，并且采用專業(yè)組織凍存管快速轉(zhuǎn)移至負(fù)八十度冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)所有的組織均是由固定的兩位專業(yè)病理科醫(yī)師證實(shí)為肺腺癌，本研究基于患者入院病歷收集患者相關(guān)情況，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)包含患者的一般情況：年齡、性別和患者最終病理類型：腫瘤病理類型、腫瘤病理分級(jí)分期、腫瘤位置、腫瘤數(shù)目及大小等，并且對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪，關(guān)注患者的復(fù)發(fā)和進(jìn)展預(yù)后情況。

1.2 主要試劑 通用性（小鼠/兔聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）PV-6000二步法檢測(cè)試劑盒（PV-6000，中杉金橋生物有限公司，北京，中國(guó)），濃縮DAB顯色試劑盒（ZLI-9018優(yōu)寧維生物科技股份有限公司 上海 中國(guó)），PBS粉（P80316，百泰克生物科技有限公司，北京，中國(guó)），蘇木素（G1080，百泰克生物科技有限公司，北京，中國(guó)），ASPM兔抗人單克隆抗體（ab238106，Abcam，美國(guó)），TRIzol試劑（Thermo, USA），RIPA（R0020，Solaibio，北京，中國(guó)），ASPM primer：5′-GGGAAAGGCAAATGGAAAAC-3′，5′-C C C A A G G C C A T A C A A G T G T T-3′。GAPDH，5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′（上海生工，中國(guó)）等。

1.3 免疫組化操作方法及實(shí)驗(yàn)主要步驟 首先組織放置于10%的福爾馬林固定4 h，之后包埋制作蠟塊，蠟塊制備完成后放置-20oC冰箱1 h左右，然后使用石蠟切片機(jī)（LEIZI/515，德國(guó)）切片5 μm厚度。切好放置70oC烤箱加熱約50 min，組織脫蠟二甲苯20 min，無(wú)水乙醇10 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，最后切片放置于流水下洗去殘留乙醇。PBS洗3遍每次3 min，用枸櫞酸鈉溶液抗原修復(fù)切片高火5 min，中低火8 min-10 min，室溫放涼約1 h。PBS再洗3遍每次3 min，3%的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑每片約40 μL 20 min，PBS再洗3遍每次3 min，在濕盒孵育一抗（1:100），4oC，過(guò)夜。次日切片恢復(fù)室溫約30 min，PBS洗3遍每次3 min，室溫條件下濕盒內(nèi)孵育二抗約1 h，PBS洗3遍每次3 min，DAB染色1 min左右，自來(lái)水終止染色。蘇木素復(fù)染約15 s。自來(lái)水洗終止染色，脫水、透明：75%乙醇浸泡1 min，85%乙醇1 min，95%乙醇1 min，無(wú)水乙醇3 min，二甲苯10 min，最后中性樹(shù)膠封片，封片后置于通風(fēng)安全櫥晾干約1 h，隨后顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.4 結(jié)果評(píng)定 所有免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由認(rèn)證專業(yè)的2位病理學(xué)醫(yī)師雙盲條件下進(jìn)行評(píng)估，并進(jìn)行圖像采集。ASPM的陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈淡黃色，黃色或棕黃色。將陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色效果的強(qiáng)度確定染色結(jié)果：遵循隨機(jī)化原則，以200×放大率捕獲10個(gè)隨機(jī)區(qū)域或3個(gè)代表區(qū)域，并計(jì)算每個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞。百分比取平均值。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)定為0分，10%-49%評(píng)為1分，50%-74%為2分，≥75%為3分。相同的著色強(qiáng)度也評(píng)定為0分-3分，無(wú)色評(píng)級(jí)為0分，灰黃色評(píng)級(jí)為1分，金黃色評(píng)級(jí)為2分，棕黃色評(píng)級(jí)為3分ASPM的ICH評(píng)分通過(guò)加入強(qiáng)度評(píng)分和染色程度評(píng)分。通過(guò)評(píng)分作為觀察指數(shù)的指標(biāo)來(lái)評(píng)估切片上ASPM表達(dá)的水平（總分≤3即為低表達(dá)，總分＞3即為高表達(dá)）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（real-time quantity polymerase chain reaction, RT-qPCR） 使用TRIzol試劑（T h e r m o, U S A）按照制造商的說(shuō)明提組織總m R N A。R N A 是反向轉(zhuǎn)錄c D N A 使用c D N A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（T h e r m o, U S A）。采用7 9 0 0 實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行m R N A 定量P C R（T h e r m o Scientific, Waltham, MA, USA）。目標(biāo)基因ASPM pr imer：5′-G G G A A AG G C A A ATG G A A A AC-3′，5′-CCCA AGGCCATACA AGTGTT-3′。G APDH，5′-G A G T C A A C G G A T T T G G T C G T-3′，5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′（上海生工，中國(guó)）。

1.6 蛋白印跡法（Western blot） 使用RIPA（R0020 Solaibio，北京，中國(guó)）提取組織中的蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)量蛋白濃度，95 °C 5 min變性，-20 °C保存。10% SDS PAGE 90 v電泳約2 h，PVDF膜電轉(zhuǎn)200 mA約2 h，TBST溶液洗3次，每次約10 min，5%脫脂奶粉溶液封閉室溫?fù)u床約1 h。TBST溶液洗三次每次約10 min，4 °C搖床孵育一抗（1:1,000）過(guò)夜。第二天TBST溶液洗3次每次約10 min，孵育二抗（1:1,000）室溫?fù)u床約1 h，TBST溶液洗3次，每次約10 min。ECL曝光并且采集照片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行分析，肺腺癌組織及肺部正常組織中的ASPM表達(dá)水平和肺腺癌之間不同分期的ASPM表達(dá)水平均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，并采用卡方檢驗(yàn)分析其表達(dá)差異情況。應(yīng)用Kaplan-Meier 分析ASPM表達(dá)水平與肺腺癌總生存率和無(wú)進(jìn)展生存比率的相關(guān)性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中不同組織間的ASPM表達(dá)情況 圖1A中高表達(dá)組的組織來(lái)源于III期-IV期患者，低表達(dá)組的組織來(lái)源于I期-II期患者。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示III期-IV期組的ASPM表達(dá)水平均顯著高于I期-II期組。并且ASPM是定位于肺腺癌組織中的細(xì)胞核并著色表達(dá)。圖1B組織是來(lái)源于肺部良性病變，免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ASPM在肺部良性病變中表達(dá)為陰性即不著色。

2.2 ASPM在肺腺癌中的表達(dá)上調(diào) 為了研究ASPM在肺腺癌中的表達(dá)，研究小組收集了12對(duì)肺腺癌和癌旁組織。我們首先利用RT-qPCR檢測(cè)上述樣本中ASPM的mRNA表達(dá)水平（圖2A），發(fā)現(xiàn)12對(duì)樣本中，肺腺癌組織中ASPM的mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織。隨后，我們檢測(cè)12對(duì)組織中ASPM的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，ASPM蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織（圖2B）。結(jié)果表明，ASPM在肺腺癌中的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)水平均升高。

2.3 分析ASPM表達(dá)水平與肺腺癌總生存率和無(wú)進(jìn)展生存比率的相關(guān)性 圖1C是對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行隨訪時(shí)間100個(gè)月，并統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)資料。應(yīng)用Kaplan-Meier分析ASPM表達(dá)水平與肺腺癌總生存率和無(wú)進(jìn)展生存比率的相關(guān)性。結(jié)果顯示ASPM表達(dá)水平在高表達(dá)組的肺腺癌患者總生存率遠(yuǎn)低于低表達(dá)組，并ASPM表達(dá)水平在高表達(dá)組的無(wú)進(jìn)展生存比率顯著低于低表達(dá)組。

2.4 90例肺腺癌患者的臨床病理特征與ASPM的關(guān)系 表1基于患者入院病歷收集患者相關(guān)情況，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)包含患者的一般情況：年齡、性別和患者抽煙情況及腫瘤病理分級(jí)分期、腫瘤大小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等的詳細(xì)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示II期-IV期患者的ASPM表達(dá)水平均顯著高于I期-II期（P=0.021）。腫瘤大小≥4 cm的ASPM表達(dá)水平均顯著高于腫瘤大小＜4 cm （P=0.024）。ASPM與肺腺癌患者的的病理分期及腫瘤的大小均有顯著差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是，本研究中患者的抽煙情況、年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與ASPM（P值分別為：0.247、0.248、0.478、0.324）的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的過(guò)程。主要包括細(xì)胞的異常增殖、侵襲遷移、循環(huán)擴(kuò)散、血管的生成及遠(yuǎn)處的克隆等。細(xì)胞周期的改變是眾多因素的關(guān)鍵步驟之一，只有突破對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控才能更有效的抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。肺癌不論是在國(guó)外還是在中國(guó)，不論是在城市還是在農(nóng)村，肺癌均為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[4]。而且近年來(lái)肺癌的發(fā)生發(fā)展呈不斷上升的趨勢(shì)，而肺腺癌的發(fā)生率已經(jīng)超出其他病理類型的肺癌，比如鱗癌、腺鱗癌、小細(xì)胞型肺癌等。 目前，人類對(duì)于腫瘤的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究的研究領(lǐng)域主要包括細(xì)胞周期調(diào)控、miRNA、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[5]。

圖 1 免疫組化檢測(cè)ASPM在肺腺癌組織（A）和正常肺組織（B）中的表達(dá)情況（×100 和×200）。C：Kaplan-Meier累計(jì)總生存率和無(wú)進(jìn)展生存比率曲線分析ASPM高低表達(dá)間的差異。Fig 1 Immunohistochemistry to detect the expression of ASPM in lung adenocarcinoma (A) and normal lung (B) (×100 and ×200). C: Kaplan-Meier cumulative total survival and progression-free survival ratio curves were used to analyze the difference between high and low expression of ASPM.

圖 2 ASPM在肺腺癌組織中上調(diào)。A：采用qRT-PCR檢測(cè)腫瘤患者手術(shù)新鮮標(biāo)本及其鄰近組織中ASPM mRNA的表達(dá)水平；B：Western blot檢測(cè)上述標(biāo)本中ASPM蛋白表達(dá)水平。Fig 2 ASPM is upregulated in lung adenocarcinoma tissues. A: qRT-PCR was used to detect the expression level of ASPM mRNA in surgical specimens of lung adenocarcinoma and its adjacent tissues from tumour patients; B: Western blot was used to detect the protein expression level of ASPM in the abovementioned specimens.

表 1 90例肺腺癌患者的臨床病理特征與ASPM的關(guān)系Tab 1 Relationships of ASPM and clinicopathological characteristics in 90 patients with lung adenocarcinoma

隨著蛋白組學(xué)及基因?qū)W和一些測(cè)序及芯片的發(fā)展，生物標(biāo)志物（biomarker）已經(jīng)成為近幾十年來(lái)生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，大家對(duì)于肺癌相關(guān)基因及蛋白質(zhì)有了深刻認(rèn)識(shí)，許多基因及被編碼的蛋白（如P21、P27、p53、ras、erbB、hTERT、thymosinp-4、MCM2等）的改變已經(jīng)被研究發(fā)現(xiàn)有利于預(yù)測(cè)肺癌的預(yù)后，并有希望成為肺癌早期診斷的有效方法[6]。

ASPM基因位于1q31.3上，跨度在62.567 Mb左右，其最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物是由28個(gè)外顯子組成并編碼翻譯3,477個(gè)氨基酸大的蛋白質(zhì)[7]。其產(chǎn)物定位于紡錘體極和中心體，包含2個(gè)高度保守的N-末端ASNP重復(fù)序列、1個(gè)氨基酸末端微管結(jié)合區(qū)、2個(gè)同源性鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)域及1個(gè)羧基末端。ASPM主要功能是正確引導(dǎo)又是分裂中紡錘體向兩級(jí)運(yùn)動(dòng)和維持細(xì)胞質(zhì)的均等分裂等。ASPM被認(rèn)為在有絲分裂紡錘體調(diào)節(jié)和有絲分裂過(guò)程的協(xié)調(diào)中發(fā)揮作用。它被認(rèn)為與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生有關(guān)。ASPM突變可能導(dǎo)致小頭畸形原發(fā)性5型（MCPH5）。小頭畸形定義為頭圍比年齡相關(guān)的平均值低3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。雖然腦重量和腦皮質(zhì)體積明顯變小，但無(wú)明顯的神經(jīng)功能缺損。ASPM的突變會(huì)導(dǎo)致常染色體隱性原發(fā)性小頭畸形（MCPH）[8,9]。有研究[10-12]發(fā)現(xiàn)ASPM在大腦發(fā)育中的神經(jīng)上皮細(xì)胞的均等增殖分裂起著關(guān)鍵因素作用。而ASPM敲低之后NE祖細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這一發(fā)現(xiàn)提示MPCH的發(fā)生是因?yàn)锳SPM突變導(dǎo)致有絲分裂調(diào)節(jié)受損的結(jié)果。通過(guò)共表達(dá)分析，ASPM可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)的磷酸化作用或者非炎癥因子的磷酸化作用而與HCV肝硬化的進(jìn)展相關(guān)，尤其是在癌變過(guò)程中。這與我們下一步課題開(kāi)展提供了新思路。有研究[13]發(fā)現(xiàn)ASPM在卵巢癌、膀胱癌、肝癌中表達(dá)水平上調(diào)，和我們免疫組化得出的結(jié)果一致，ASPM在肺腺癌中也是表達(dá)水平上調(diào)而且與腫瘤的發(fā)生、侵襲、復(fù)發(fā)及不良預(yù)后相關(guān)且呈正相關(guān)性。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺癌中ASPM的表達(dá)水平與腫瘤病理分級(jí)臨床分期密切相關(guān)聯(lián)[14]。這與我們組織化學(xué)和臨床資料分析出的結(jié)果相似，肺腺癌中ASPM的表達(dá)水平與腫瘤病理分級(jí)臨床分期緊密相關(guān)。

ASPM可能是一種新的含氧干細(xì)胞/祖細(xì)胞標(biāo)志物，可能參與正常胃生理和胃癌的發(fā)生。此外，ASPM表達(dá)與多發(fā)癌臨床預(yù)后不良有關(guān)[15]。在肝細(xì)胞癌，ASPM表達(dá)與血清AFP水平密切相關(guān)。盡管ASPM在一些非腫瘤性疾病中發(fā)揮重要作用，但尚無(wú)研究闡明ASPM在肺腺癌發(fā)生與進(jìn)展中的作用[16-18]。目前ASPM在腫瘤中的生物分子機(jī)制尚不清楚。在本課題中，我們采用免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)肺腺癌組織與正常肺組織中ASPM的表達(dá)水平和臨床分期及患者預(yù)后的情況。本研究顯示癌組織中的ASPM表達(dá)水平高于正常組織且隨著臨床分期的增高，發(fā)現(xiàn)ASPM的表達(dá)水平也隨之增高。最后通過(guò)生存分析曲線顯示高表達(dá)組的ASPM是肺腺癌患者生化復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，且與總生存率緊密相關(guān)。

但是我們的研究中所納入的病例數(shù)量少的原因可能存在一些因素統(tǒng)計(jì)差異并且未進(jìn)一步研究ASPM在mRNA水平的變化是否與現(xiàn)已經(jīng)得出的研究結(jié)果一致且同樣反映肺腺癌的臨床分期及不良預(yù)后等。與此同時(shí)，我們通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到ASPM和（有爪蟾蜍驅(qū)動(dòng)蛋白2的靶向蛋白）TPX2的表達(dá)都與有絲分裂的紡錘體有關(guān)。有研究[19]發(fā)現(xiàn)TPX2在膀胱癌中是激活P53的合成，是通過(guò)TPX2-Aurora A復(fù)合體調(diào)節(jié)P53的磷酸化。此外，有研究[20,21]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中敲除TPX2能誘導(dǎo)細(xì)胞周期靜止和凋亡、降低細(xì)胞的侵襲能力和抑制細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)ASPM與TPX2、BUB1等之間存在極強(qiáng)的相關(guān)性，但是它們之間的關(guān)系還是空白，因?yàn)锳SPM在細(xì)胞有絲分裂中還可能與某些分子有關(guān)聯(lián)且影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，所以我們需要進(jìn)一步增加納入病例數(shù)量并豐富相關(guān)患者臨床病理特征資料及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法深入研究。

綜上所述，我們證明了ASPM在肺腺癌中高表達(dá)且與臨床分期及患者預(yù)后相關(guān)并對(duì)生存期有一定的影響，而ASPM可能是肺腺癌的一項(xiàng)新的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。因此，通過(guò)檢測(cè)ASPM的表達(dá)可以更好的判斷肺腺癌的預(yù)后和惡性程度。設(shè)想通過(guò)抑制ASPM的表達(dá)，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，改善肺腺癌的不良預(yù)后，為腫瘤的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。為腫瘤發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

Author contributions

Wang JJ carried out the experiment of molecular biology and drafted the manuscript. He ZY participated in the design of the study and performed the statistical analysis. Duan RH conceived of the study, and coordination and helped to revise the manuscript.