王俐鈞，孫建光

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250014 ；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟南 250014）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）指除過量飲酒外其他因素引發(fā)的肝細(xì)胞脂肪變和脂質(zhì)蓄積為特征的病理綜合征，失治、誤治則可能發(fā)展為肝炎、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌。非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尚未明確，目前普遍認(rèn)可的是“二次打擊”學(xué)說，即肥胖、胰島素抵抗導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷，細(xì)胞因子釋放炎癥介質(zhì)。中醫(yī)認(rèn)為本病多由飲食不節(jié)、過度肥胖、情志失調(diào)等導(dǎo)致肝失疏泄、脾失健運，腎失氣化，濕熱、痰濁、瘀血叢生，膏脂堆積，阻滯肝絡(luò)而成。研究[1]發(fā)現(xiàn)，NAFLD 與肥胖、脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病等代謝綜合征相關(guān)。近年來，隨著生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖人口迅速增加，與肥胖相關(guān)的NAFLD 發(fā)生率明顯上升。他汀類藥物如辛伐他汀在降低總膽固醇、三酰甘油方面顯示出良好效果，但因其存在肌肉溶解、肝臟功損害、胃腸道不適等不良反應(yīng)[2]。茵杞調(diào)脂飲系孫建光教授根據(jù)臨床經(jīng)驗創(chuàng)制，前期研究[3-5]表明其在治療NAFLD 方面有獨特優(yōu)勢，但機制未明。本研究擬通過高脂飲食復(fù)制NAFLD 大鼠模型，探討茵杞調(diào)脂飲作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量150～190 g，由濟南朋悅實驗動物中心提供（合格證號：SCXK<魯>2014-0007）。

1.2 藥品及飼料 茵杞調(diào)脂飲方藥組成：茵陳15 g，枸杞15 g，決明子15 g，生山楂15 g，瓜萎15 g，蒼術(shù)12 g，薏米30 g，橘皮9 g，佩蘭葉9 g，小薊15 g，熟大黃3 g，生甘草6 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院煎藥室水提、醇沉濃縮而成；辛伐他汀膠囊購自齊魯制藥有限公司，批號：S14200263233。高脂飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司配置，參照本課題之前研究[6]成果，組成：基礎(chǔ)飼料88%，豬油10%，膽固醇1.4%，膽鹽0.6%。

1.3 檢測試劑 三酰甘油測試盒等由上海茁彩生物科技有限公司提供；總膽固醇測定試劑盒等由南京建成生物工程研究所提供；RT-PCR 試劑盒由美國NEB 公司提供；Trizol 試劑由美國 Promega 公司提供。

1.4 方法

1.4.1 飼養(yǎng)條件 大鼠飼養(yǎng)于山東省千佛山醫(yī)院實驗室，室溫（22±2）℃，濕度（55±5）%，自由飲水和進(jìn)食。

1.4.2 造模及分組給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機分為6 組，正常組、模型組、茵杞調(diào)脂飲高、中、低劑量組及辛伐他汀陽性對照組，每組8 只。正常組給予普通飼料，余5 組給予高脂飼料。12 周后，正常組與模型組中分別選取1只，進(jìn)行肝組織病理切片掃描，證實NAFLD 模型建成。茵杞調(diào)脂飲高、中、低劑量組分別按33.12 g/kg、16.56 g/kg、8.28 g/kg 的體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)灌胃（按成人用藥每日159 g/60 kg 折算），西藥組給予辛伐他汀以2.08 mg/kg 進(jìn)行灌胃；正常組與模型組給予等量生理鹽水，按1 mL/100 g 體質(zhì)量計算。上述用藥及生理鹽水均1 次/d，治療8 周。每周稱1 次體質(zhì)量，調(diào)整藥量。

1.4.3 標(biāo)本采集 用藥8 周后，大鼠禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，抽取腹主動脈血5 mL，離心10 min，測肝功、血脂等指標(biāo)。摘取肝臟，取右葉新鮮組織，浸泡10%福爾馬林固定液中，用于蘇木精-伊紅（HE）染色和油紅O 染色；剩余部分置于于Ep 管中，-80 ℃超低溫冰箱保存，用于檢測肝組織指標(biāo)。

1.5 檢測方法 血清指標(biāo)測定：采用全自動生化分析儀檢測，此部分由山東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)學(xué)院檢驗科協(xié)助完成。病理學(xué)檢測：福爾馬林浸泡、固定肝臟標(biāo)本，石蠟包埋、切片，行HE 染色、油紅O 染色，在光鏡下觀察肝組織病變情況、脂肪含量及分布。肝組織指標(biāo)測定：取肝組織100 mg，制成10%勻漿，離心，取上清液。嚴(yán)格按照說明書用RT-PCR 法檢測肝組織LXRα、CYP7A1mRNA 表達(dá)。引物序列：GAPDH 上游5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'，138 bp；LXRα 上 游5'-CGAGCTATGCAGTGTATGTGGG-3'，下游5'-ACACTCCTCCCTCATGCCTG-3'，217bp；CYP7A1 上游5'-GGCATCTCAAGCAAACACCAT-3'，下游5'-GCTGTGCGGATATTCAAGGAT-3'，246 bp。擴增條件：95 ℃，15 s，40 個循環(huán)，60 ℃，60 s。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用獨立配對t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗中茵杞調(diào)脂飲低劑量組大鼠死亡1 只，余正常。正常組大鼠體質(zhì)量正常增長，皮毛整齊、光澤，精神狀態(tài)佳，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠體質(zhì)量增長較快，呈腹型肥胖體態(tài)，毛色泛黃、欠光澤，精神欠佳，反應(yīng)遲鈍；與模型組比較，用藥組大鼠毛色、精神、體力均有所改善。

2.2 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較 見表1。

表1 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較（） mmol/L

表1 各組大鼠血清TG、TC 水平變化比較（） mmol/L

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.3 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較 見表2。

2.4 對大鼠肝臟病理學(xué)的影響 HE 染色：空白組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝竇正常，細(xì)胞核大而圓，位于中央，胞質(zhì)均勻，未見脂肪空泡，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇狹窄，細(xì)胞核居邊，細(xì)胞腫脹，呈氣球樣變，胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，大量炎細(xì)胞浸潤。各用藥組肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組改善，肝細(xì)胞變性、壞死、炎細(xì)胞浸潤改善。其中以中藥高劑量組改善最為明顯，肝小葉輪廓略顯清晰，細(xì)胞核形態(tài)基本規(guī)則，細(xì)胞數(shù)目增多，見圖1。油紅O 染色：正常組肝細(xì)胞內(nèi)未見染紅的脂肪沉積。模型組肝細(xì)胞內(nèi)見大而圓的紅色脂滴，分布密集，著色較重，部分脂滴連成片狀。各用藥組脂肪染色面積及濃度不同程度減輕，尤以中藥高劑量組和辛伐他汀組變化最為顯著，見圖2。

2.5 對肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織LXRα mRNA 表達(dá)明顯升高，CYP7A1 mRNA 表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠肝組織LXRα 表達(dá)降低，CYP7A1 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）；與辛伐他汀組比較，中藥高劑量組LXRα mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見圖3，圖4 和表3。

表2 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較（） mmol/L

表2 各組大鼠血清HDL-C、LDL-C、FFA 測定結(jié)果比較（） mmol/L

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P＜0.05

圖1 茵杞調(diào)脂飲對NAFLD 大鼠肝組織HE 染色的影響（HE，×200）

圖2 茵杞調(diào)脂飲對NAFLD 大鼠肝組織脂肪染色的影響（油紅O，×200）

圖3 各組大鼠肝組織LXRα 表達(dá)柱狀圖

圖4 各組大鼠肝組織CYP7A1 mRNA 表達(dá)柱狀圖

表3 各組大鼠肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 相對表達(dá)量（）

表3 各組大鼠肝組織LXRα、CYP7A1 mRNA 相對表達(dá)量（）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與辛伐他汀組比較，▲P＜0.05

3 討論

茵杞調(diào)脂飲由12 味中藥組成，方中茵陳、枸杞滋腎疏肝，以求治本；決明子、蒼術(shù)、薏米消痰祛濁，山楂、小薊、瓜蔞散滯行瘀，共治其標(biāo)；加佩蘭、橘皮芳香化濕理脾，大黃導(dǎo)濕熱瘀濁從大便而出，生甘草解毒兼調(diào)和諸藥。諸藥合用，痰熱瘀并治、脾肝腎同調(diào)，契合病機，故能奏效。

膽固醇7a-羥化酶（cholesterol 7-alpha hydroxylase，CYP7A1）屬肝臟特異性微粒體細(xì)胞色素P450酶系，是膽汁酸合成代謝經(jīng)典途徑的限速酶，體內(nèi)近50%的膽固醇通過CYP7AI 的催化轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外[7]，其表達(dá)水平的高低反映出膽汁酸合成的快慢及機體清除膽固醇的能力。研究[8]發(fā)現(xiàn)給予7 周齡SD雄性大鼠乳酸發(fā)酵豆?jié){5 周，其肝組織CYP7A1mRNA表達(dá)較對照組顯著增加（P＜0.001），血清膽固醇水平顯著降低（P＜0.001）。當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時，肝非實質(zhì)細(xì)胞如肝巨噬細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞可向肝細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子IL-6 等，這些細(xì)胞因子正是通過抑制CYP7A1 轉(zhuǎn)錄來抑制膽汁酸合成[9]。

LXRα 被稱為膽固醇的感受器，可被特定的膽固醇氧化衍生物如22（R）-羥化膽固醇、24（S）-羥化膽固醇等激活[10]，參與調(diào)控膽固醇逆轉(zhuǎn)運。LXRα在脂肪的生成、氧化及炎癥因子的產(chǎn)生等多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，因其結(jié)合于不同的靶基因上，可表現(xiàn)為相反的結(jié)果。它既可上調(diào)SREBP-1c、FAS 等基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的從頭合成，加重肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積；又可上調(diào)CYP7A1、LPL 等基因表達(dá)，調(diào)節(jié)膽固醇代謝平衡，防止脂肪肝的進(jìn)一步發(fā)展[11]。膽固醇轉(zhuǎn)變成膽汁酸是體內(nèi)膽固醇的主要清除途徑，研究[12-13]表明當(dāng)膽固醇及其代謝物在機體中累積，LXRα 被激活，誘導(dǎo)CYP7A1的表達(dá)。研究[14]認(rèn)為中藥復(fù)方可抑制NAFLD 動物模型中LXRα 的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)靶基因SREBP-1c、FAS，阻止脂質(zhì)沉積。此外，LXRα 被認(rèn)為是抗炎因子，可以抑制炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α、MCP-1 等的表達(dá)，在炎癥調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[15]。

本實驗中，NAFLD 模型組大鼠病理組織學(xué)顯示脂肪變性及大量染紅的脂肪沉積，血清TC、TG、LDL-C、FFA 及肝組織TC、TG、LXRαmRNA 升高，HDL-C、CYP7A1mRNA 表達(dá)降低，與正常組比較差異顯著（P＜0.01）。大鼠血清FFA 過多，吸收入肝的脂類增加，肝細(xì)胞TC、TG 蓄積，脂質(zhì)代謝紊亂，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)引發(fā)肝臟損傷。肝臟的應(yīng)激作用刺激氧固醇受體LXRα，在一定程度上提高CYP7A1活性[16]，有利于膽固醇穩(wěn)態(tài)的維持。但長期喂食高脂飲食，大鼠肝內(nèi)膽固醇聚集、內(nèi)源性膽汁酸堆積，對CYP7A1表現(xiàn)出負(fù)反饋調(diào)節(jié)，使CYP7A1 表達(dá)出現(xiàn)抑制而不是上調(diào)[17-18]，膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸的能力削弱，肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸淤積，肝細(xì)胞損傷。與此同時，脂肪酸合成過多但氧化不足、載脂蛋白代謝障礙，LXRα 代償性增加，激活相應(yīng)靶基因，生成大量脂肪酸[19]，引起肝細(xì)胞脂肪變性，出現(xiàn)LXRα 和CYP7A1 mRNA 表達(dá)出現(xiàn)分離的狀態(tài)。服用不同濃度的茵杞調(diào)脂飲之后，肝組織LXRα mRNA 表達(dá)有所降低，CYP7A1 mRNA 表達(dá)有所升高，結(jié)合血脂、肝脂指標(biāo)的改善，說明在藥物的調(diào)治作用下，LXRα、CYP7A1 mRNA 表達(dá)水平逐漸恢復(fù)，二者的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系重新趨于正常，激活下游與膽固醇和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因，降低脂代謝相關(guān)蛋白酶活性，LDL-C 降低，體內(nèi)運輸至肝臟的膽固醇減少[20]，HDL-C 升高，將肝臟中的磷脂和膽固醇轉(zhuǎn)運出去，阻止脂質(zhì)的沉積,抑制線粒體功能紊亂及胰島素抵抗而對肝臟起保護作用，肝細(xì)胞得以修復(fù)，TC、TG 水平幾近正常。

綜上所述，茵杞調(diào)脂飲通過調(diào)節(jié)LXRα、CYP7A1 mRNA 表達(dá)，可調(diào)控體內(nèi)脂肪合成，改善血脂、肝脂及肝組織病理變化，緩解NAFLD 進(jìn)展。茵杞調(diào)脂飲具有中醫(yī)調(diào)理的特色和優(yōu)勢，可整體治療、標(biāo)本兼治，臨床療效優(yōu)于單純降脂藥物，該藥應(yīng)用安全性高，具有較好的應(yīng)用前景。但其具體作用機制仍需進(jìn)一步研究。