劉盼興，王 旭

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110032）

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease,AD）又名老年性癡呆，是危害人類健康的一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為認(rèn)知、記憶、智力、日常生活能力等方面的退化及改變[1]。該病病因復(fù)雜，醫(yī)家對其病因病機(jī)進(jìn)行研究探索中認(rèn)為腎虛髓虧、瘀血阻絡(luò)為該病的主要病因病機(jī)。從而，通過補(bǔ)腎活血法治療AD 成為中醫(yī)界的探究熱點(diǎn)[2]。2009 年－2011 年期間，我院王恩龍教授[3]觀察補(bǔ)腎活血中藥對40 例老年性癡呆患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥可以改善老年性癡呆患者的認(rèn)知能力，提高患者的生活質(zhì)量，但其中的作用機(jī)制卻不甚了解。Iba1蛋白是小膠質(zhì)細(xì)胞中的鈣結(jié)合蛋白，該抗體已被廣泛用作小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物；GFAP 蛋白是星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)絲的主要成分，該抗體是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白[4]，它們二者是促炎因子和氧化應(yīng)激的重要來源，可分泌大量的促炎因子[5-6]，而炎性因子的增加，導(dǎo)致海馬介導(dǎo)的認(rèn)知功能破壞[7]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。所以我們采用水迷宮實驗、免疫組化實驗及Western blot 實驗來探究補(bǔ)腎活血方治療AD 的機(jī)制是否與其可以抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 將24 只7 月齡的SPF 級的SAMP8雄性鼠隨機(jī)分為3 組，分別為模型組、鹽酸多奈哌齊西藥組和補(bǔ)腎活血方中藥組，另外將8 只7 月齡的SPF 級的SAMR1 鼠作為正常對照組。造模時正常組和模型組小鼠按體質(zhì)量給予生理鹽水灌胃，西藥組給予鹽酸多奈哌齊灌胃，灌胃劑量為3 mg/（kg·d），中藥組給予補(bǔ)腎活血方進(jìn)行灌胃6 g/（kg·d），灌胃時間為4 周。

1.2 實驗器材及實驗動物灌胃藥物的制備 檢測試劑與儀器：兔多克隆GFAP 抗體（Abcam，美國），兔多克隆Iba1 抗體（Abcam，美國），β-actin 抗體（sigma，美國），組織蛋白裂解液、BCA 工作液等（碧云天生物技術(shù)有限公司）。Mirror 水迷宮自動實驗記錄儀，BIO-RAD 凝膠圖像分析系統(tǒng)，電泳儀，電泳槽，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜槽，脫色搖床，Leica 石蠟切片機(jī)，超速冷凍離心機(jī)，Olympus 光學(xué)顯微鏡，電子天平，微波爐，恒溫水浴箱。補(bǔ)腎活血方藥物組成：丹參 20 g，川芎20 g，山藥 15 g，熟地黃10 g，鹿角膠 10 g，枸杞子15 g，牛膝 15 g，菟絲子10 g，山茱萸 10 g。用藥物總體積的4 倍量水浸泡2 h，沸后改文火煎，煎煮1 h 后倒出藥液；繼用藥物體積2 倍量水，再煎2 次，合并3 次藥液。濾過，濾液用文火濃縮至流浸膏，水浴繼續(xù)濃縮至稠浸膏，真空干燥（80 ℃）得干浸膏。將干浸膏無菌條件裝瓶，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸多奈哌齊的制備：將鹽酸多奈哌齊片（成人劑量為5 mg/d）置于純凈水中，經(jīng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)制成濃度為4 mg/mL 的混懸液，藥物配制后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前搖勻。

1.3 Morris 水迷宮實驗 灌胃28 d 后進(jìn)行水迷宮適應(yīng)訓(xùn)練，首先練習(xí)站臺，可將小鼠放于平臺上1 min，然后開始入水訓(xùn)練，每只小鼠訓(xùn)練2 次，從不同象限入水，1 min/次，如果找不到站臺，應(yīng)予以引導(dǎo)至站臺，停留1 min。定位航行試驗為期5 d，平臺置于第三象限中心，小鼠分別于上午和下午各進(jìn)行1 次試驗，每次試驗時間1 min，第一象限池壁的中點(diǎn)作為入水點(diǎn)，但放置平臺的第三象限不作為入水點(diǎn)，上午和下午的入水順序相同。如果大鼠在1 min 內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引至平臺，讓其在平臺上停留1 min，再放回籠內(nèi)。以小鼠入水后到找到平臺的游泳時間即逃避潛伏期做為觀測指標(biāo)，60 s 內(nèi)未找到平臺的記為60 s。空間探索試驗于定位航行結(jié)束后次日上午撤除平臺，在原平臺象限的對側(cè)象限即第一象限入水，記錄的游泳軌跡，測量內(nèi)小鼠在原平臺象限停留時間并進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)搜集和處理由軟件完成。

1.4 動物取材 待小鼠Morris 水迷宮實驗結(jié)束后，將4 組小鼠置于乙醚罐中進(jìn)行麻醉，待鼠深度麻醉后行斷頭處死，在冰盒內(nèi)剝離小鼠的大腦，從中間矢狀縫切開，將小鼠的大腦左半球置于4%多聚甲醛溶液中，進(jìn)行固定，脫水、透明、浸蠟后常規(guī)制備石蠟切片，供免疫組織化學(xué)染色使用；小鼠大腦右半球仔細(xì)分離出海馬和皮層，置于-80℃進(jìn)行深度冰凍，供western blot 實驗備用。

1.5 免疫組化實驗 將鼠的大腦左半球制成石蠟切片后，進(jìn)行免疫組化實驗。將石蠟切片于烤箱內(nèi)烤片1 h 后，進(jìn)行脫蠟操作，然后PBS 液沖洗，之后檸檬酸緩沖液中微波修復(fù)，再次PBS 液沖洗后行山羊血清封閉0.5 h，滴加一抗，4℃過夜，PBS 液沖洗后再滴加二抗，PBS 沖洗后滴加三抗，PBS 沖洗，然后進(jìn)行DAB 顯色、核復(fù)染、脫水等操作，最后用中性樹膠封片觀察。

1.6 Western blot 實驗 將鼠右腦的海馬組織進(jìn)行勻漿后行Western blot 實驗。首先配膠，按照各比例備好膠板后，將其置于電泳槽中進(jìn)行加樣、預(yù)電泳和電泳操作，電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)印2 h，結(jié)束后棄膠，將膜取下置于麗春紅染液后進(jìn)行裁膜，然后用TBST 液洗膜，洗膜后開始滴加一抗，牛奶封閉，4℃過夜，再次用TBST 液洗膜，然后滴加二抗，再次用TBST液洗膜，最后進(jìn)行曝光觀察，圖像采集及數(shù)據(jù)分析均由軟件完成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示各定量指標(biāo)的平均值和分散程度。多樣本均數(shù)的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 及Dunnett’sT 3 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較 見表1。

表1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較（）s

表1 定位航行實驗各組小鼠潛伏期用時比較（）s

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

2.2 補(bǔ)腎活血方對各組小鼠大腦海馬區(qū)Iba1 表達(dá)的影響 免疫組化的結(jié)果顯示，正常組SAMR1 鼠大腦海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，排列有序，無明顯Iba1 陽性染色；與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 鼠陽性細(xì)胞染色加深，Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)量增多，對陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組SAMP8 小鼠比較，中藥組與西藥組SAMP8 鼠的陽性細(xì)胞染色淺，Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)量有不同程度減少，對陽性細(xì)胞所占比例統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、圖2）。采用western blot 法檢測各組小鼠大腦海馬內(nèi)Iba1 蛋白（圖3）。統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 小鼠Iba1 蛋白含量明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)中藥與西藥處理后，與模型組小鼠比較，Iba1 蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組小鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）（圖4）。

圖1 免疫組化法檢測各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)Iba1 的分布（scale bar=20 μm）

圖2 各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)Iba1 染色陽性細(xì)胞數(shù)量所占比例的差異比較

2.3 補(bǔ)腎活血方對各組小鼠大腦海馬區(qū)GFAP 表達(dá)的影響 采用免疫組化法觀察各組小鼠大腦海馬區(qū)GFAP 的分布與表達(dá)，結(jié)果顯示：正常組SAMR1 鼠大腦海馬CA1 區(qū)無明顯GFAP 陽性染色細(xì)胞；與正常組SAMR1 小鼠比較，模型組SAMP8 鼠陽性細(xì)胞胞體增大，突起增粗增長，染色加深，呈棕黃色，GFAP 陽性染色細(xì)胞數(shù)量增多，其陽性細(xì)胞所占比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組SAMP8小鼠比較，中藥組與西藥組SAMP8 鼠的陽性染色細(xì)胞多呈不規(guī)則、扁平的多角形狀，胞體及突起角纖細(xì)，染色淺，數(shù)量有不同程度減少，陽性細(xì)胞所占比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5、圖6）。采用western blot 實驗方法來檢測各組小鼠大腦海馬內(nèi)GFAP蛋白（圖7），統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，與正常鼠比較，模型組小鼠GFAP 蛋白含量明顯較高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)中藥與西藥處理后，與模型組小鼠比較，中藥組與西藥組小鼠大腦海馬內(nèi)GFAP蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組小鼠比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）（圖8）。

圖3 western blot 檢測各組小鼠海馬內(nèi)Iba1 蛋白水平的表達(dá)比較

圖4 各組小鼠大腦海馬內(nèi)Iba1 蛋白的相對值比較

圖5 免疫組化法檢測各組小鼠大腦海馬CA1 區(qū)GFAP 的分布（scale bar=20 μm）

圖6 各組小鼠海馬CA1 區(qū)GFAP 染色陽性細(xì)胞數(shù)量所占比例的差異比較

圖7 western blot 檢測各組小鼠海馬GFAP 蛋白水平的表達(dá)比較

圖8 各組小鼠大腦海馬內(nèi)GFAP 蛋白的相對值比較

3 討論

阿爾茨海默?。╝lzheimer’s disease,AD）是一種與增齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[8]。在中醫(yī)學(xué)中一直認(rèn)為“腎藏精生髓通腦”，腎與腦功能的關(guān)系密切。AD 的臨床表現(xiàn)多與腦功能的缺失有關(guān)，但從臟腑理論中追其溯源，其發(fā)病之根本在于腎。各醫(yī)家對AD病因病機(jī)的研究探討大多從虛、實兩端入手[9]。許多醫(yī)家[10-12]認(rèn)為腎虛髓虧、瘀血阻絡(luò)為AD 形成的基本病機(jī)[13]。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，水迷宮實驗中，與模型組SAMP8 鼠相比，正常對照組鼠在第3 天的逃避潛伏期明顯縮短，說明正常組鼠經(jīng)過2 天的實驗適應(yīng)，對水迷宮的內(nèi)部環(huán)境更為熟悉，符合實驗對正常組的要求。與模型組SAMP8 鼠相比，中藥組和西藥組SAMP8 鼠在第三天的逃避潛伏期亦縮短，而模型組鼠的逃避潛伏期卻無明顯變化，說明經(jīng)過實驗訓(xùn)練學(xué)習(xí)，中藥組與西藥組鼠能比模型組鼠更早的適應(yīng)水迷宮的內(nèi)部環(huán)境，較模型組鼠有更強(qiáng)的學(xué)習(xí)能力。另外，與模型組SAMP8 鼠相比，中藥組、西藥組的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），說明中藥組與西藥組SAMP8 鼠在西藥與補(bǔ)腎活血方的治療后，憑借水迷宮實驗獲取的記憶能力，能在更短的時間內(nèi)找到并登上平臺。免疫組化實驗中，由GFAP 抗體與Iba1 抗體標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞在正常組SAMR1 鼠的海馬CA1 區(qū)少有表達(dá)；與正常組SAMR1 小鼠相比，模型組小鼠海馬CA1 區(qū)的兩種染色陽性細(xì)胞有更為明顯的表達(dá)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），該兩種陽性細(xì)胞胞體增大，突起增粗增長，染色加深，呈棕黃色；而與模型組小鼠相比，中藥組與西藥組小鼠海馬CA1 區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯較少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且該兩種陽性細(xì)胞多呈不規(guī)則、扁平的多角形形狀，胞體及突起角纖細(xì)，染色淺；在Western blot 實驗中發(fā)現(xiàn)，與模型組小鼠相比，中藥組與西藥組小鼠的Iba1 與GFAP 蛋白含量均明顯較少，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而中藥組與西藥組小鼠兩種蛋白含量相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。通過免疫組化實驗與Western blot實驗可以得知補(bǔ)腎活血方可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度表達(dá)，從而阻礙了該兩種膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，保護(hù)了機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，臨床上對AD 有一定的治療作用。

經(jīng)理論研究及實驗探索結(jié)果表明，補(bǔ)腎活血方可以通過間接抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥反應(yīng)發(fā)生以改善SAMP8 小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知及記憶能力，保護(hù)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能運(yùn)行，從而對AD 起到治療作用。但僅依靠免疫組化實驗與Western blot實驗得到的結(jié)果，無法探究補(bǔ)腎活血方除可以通過抑制神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生這一機(jī)制治療AD 之外，是否還有其他的作用機(jī)制，為解決這一問題，仍需我們進(jìn)行更多更深一步的實驗研究與探索。