陳家君 馮凈凈 施天昀 陳鴻軍 揭志軍△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 上海 200240；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 上海 200241）

支氣管哮喘發(fā)病率高，病毒感染可導(dǎo)致哮喘的急性發(fā)作，如鼻病毒（rhinovirus，RV）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）、流感病毒（influenza，F(xiàn)LU）等，但病毒感染導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的機(jī)制目前仍不清楚［1］。IL-33是新近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，能作用于IL-1受體家族孤兒受體ST2而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［2］。無(wú)過(guò)敏源刺激的情況下，激動(dòng)哮喘易感基因，可觀察到誘導(dǎo)性IL-33升高和后續(xù)肺內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils，EOS）的聚集［3］。IL-33可通過(guò)誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞2（T helper 2，Th2）型細(xì)胞因子，啟動(dòng)Th2型免疫反應(yīng)，從而介導(dǎo)哮喘等異質(zhì)性疾?。?-7］。呼吸道病毒感染也可導(dǎo)致機(jī)體分泌IL-33增加，推測(cè)阻斷IL-33可作為呼吸道病毒感染誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作的治療策略［8］。Saravia等［9］在RSV急性感染新生小鼠模型中檢測(cè)到肺內(nèi)2型固有淋巴細(xì)胞（type 2 innate lymphoid cell，ILC2）增多、肺勻漿IL-33蛋白分泌增加，UV-RSV感染小鼠或RSV感染成年小鼠（6～8周齡）均未觀察到肺內(nèi)ILC2及肺勻漿IL-33蛋白的變化。FLU急性感染小鼠中也可檢測(cè)到IL-33及ILC2顯著升高，并觀察到IL-33結(jié)合ILC2表達(dá)的ST2，進(jìn)而刺激ILC2釋放Th2型細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5及IL-13），誘導(dǎo)EOS聚集、氣道高反應(yīng)性等［10］。IL-33在呼吸道病毒感染導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作的作用機(jī)制目前仍不清楚。本研究采用一定濃度的RSV急性感染卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠，建立哮喘急性發(fā)作小鼠模型，并分析IL-33在其中的作用。

材料和方法

主要試劑及設(shè)備PBS液、鋁佐劑50 mL（美國(guó)Thermo公司），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司），OVA（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco公 司），RNA抽提試劑盒RNeasy Mini Kit（50）（德國(guó)QIGEN公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA合成試劑盒（天根生化科技有限公司），real-time PCR試劑盒AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），小鼠IgE ELISA Ready-SET-Go、小鼠IL-33 ELISA Ready-SET-Go（美國(guó)eBioscience公司）。Applied Biosystem 7500熒光定量PCR儀、酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Thermo公司），霧化器（日本OMRON公司），TXD3細(xì)胞甩片離心機(jī)（湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器公司）。

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京梅里亞-維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人喉癌上皮細(xì)胞系（Hep-2細(xì)胞）由上海市公共衛(wèi)生臨床中心提供。RSV A2 LONG株（來(lái)源ATCC）由上海公共衛(wèi)生中心提供。

RSV擴(kuò)增于37 ℃、5% CO2的孵箱中用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，將RSV接種于Hep-2細(xì)胞，在含2%FBS的DMEM維持液中繼續(xù)培養(yǎng)。3～5天細(xì)胞可出現(xiàn)病變，待病變達(dá)到80%時(shí)收獲病毒，測(cè)得50%組織細(xì)胞感染濃度（TCID 50）為4.65×106/mL，將病毒凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將24只3周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為PBS組、RSV組、OVA組 和OVA/RSV組，每組6只。第0天腹腔注射含1%OVA 5 μL及鋁佐劑50 μL的PBS 125 μL或等體積PBS；第7～13天連續(xù)7天予以1% OVA或PBS霧化30 min；第14天（即霧化激發(fā)結(jié)束后第1天）用含5×105PFU的RSV病毒懸液50 μL或等體積PBS滴鼻小鼠；第15天（即RSV感染后第1天）用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，心臟取血，處死小鼠（圖1）。取血清測(cè)定總IgE蛋白含量；氣管插管進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，BALF于4 ℃下500×g離心5 min，取上清測(cè)定IL-33蛋白，重懸細(xì)胞沉淀后進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及各分類細(xì)胞計(jì)數(shù)；剪取左下肺行病理切片及HE染色；剩余肺組織勻漿后，取100 μL抽提RNA，用real-time PCR檢測(cè)Th2型細(xì)胞因子（IL-5、IL-13）、IL-33及ST2的mRNA表達(dá)；取100 μL肺組織勻漿，ELISA法測(cè)定IL-33蛋白含量。

BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及染色氣管插管行支氣管肺泡灌洗。BALF離心（條件同前），收集上清液置于-80 ℃，用于IL-33蛋白質(zhì)檢測(cè)。重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)細(xì)胞總數(shù)。吸取剩余細(xì)胞懸液至甩片機(jī)收集孔中，離心即可把細(xì)胞轉(zhuǎn)移至玻片上。行瑞氏/吉姆薩染色，根據(jù)細(xì)胞大小、形態(tài)及細(xì)胞核的形態(tài)，將細(xì)胞分成中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、EOS和淋巴細(xì)胞，計(jì)算1個(gè)高倍鏡視野下各細(xì)胞比例，再根據(jù)細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出BALF中各細(xì)胞數(shù)目。

real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子按說(shuō)明書(shū)抽提肺組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系為20 μL（表1），包 括2×AceQ PCR SYBR Green Master Mix 10 μL、ROX Reference Dye 2 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL和cDNA模板2 μL。采用熒光定量PCR儀擴(kuò)增（型號(hào)：Applied Biosystem 7500）。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95℃15 s，60 ℃45 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95℃15 s，60 ℃15 s。

表1 real-time PCR引物序列Tab 1 Primer sequence of real-time PCR

ELISA法測(cè)蛋白用ELISA試劑盒分別檢測(cè)小鼠血清總IgE水平、肺組織及BALF中IL-33蛋白水平。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 6處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)形式表示為，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

血清總IgE水平應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清總IgE，比較各組小鼠的變化。第14天，與PBS組相比，RSV組IgE水 平未見(jiàn)明顯升高，OVA組IgE水平明顯升高［（1 565±230.5）ng/mL，P＜0.05］，OVA/RSV組［（1 496±202.7）ng/mL］與OVA組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

BALF中細(xì)胞總數(shù)及各細(xì)胞分類計(jì)數(shù)通過(guò)離心收集BALF中的細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，瑞氏/吉姆薩染色后各細(xì)胞分別計(jì)數(shù)。與PBS組相比，RSV組BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯增加（P＜0.05），未見(jiàn)EOS數(shù)顯著升高，而巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度升高；OVA組BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著增加（P＜0.05），以EOS、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞升高尤其明顯。與OVA組相比，OVA/RSV組主要表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加（P＜0.05），而EOS和淋巴細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化，提示巨噬細(xì)胞或中性粒細(xì)胞在RSV誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作中起重要作用。與RSV組和OVA組相比，OVA/RSV組中細(xì)胞總數(shù)均有顯著增加（P＜0.05）。

小鼠肺組織病理切片和HE染色取小鼠左下肺病理切片行HE染色，于正置熒光顯微鏡下觀察到：PBS組小鼠肺間質(zhì)基本無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁較光滑，RSV組和OVA組均可見(jiàn)小氣道周圍大量不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，OVA組還可見(jiàn)杯狀細(xì)胞增生。RSV感染OVA誘導(dǎo)哮喘的小鼠小氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，甚至可見(jiàn)氣道上皮脫落，符合哮喘急性發(fā)作時(shí)肺組織病理學(xué)改變。

小鼠肺組織中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)變化realtime PCR檢測(cè)各組小鼠肺勻漿中細(xì)胞因子及ST2 mRNA相對(duì)于內(nèi)參β-actin mRNA表達(dá)的變化。與PBS組相比，RSV組和OVA組IL-5、IL-13及IL-33 mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05），但ST2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯增加。與RSV組相比，OVA/RSV組小鼠各基因均表達(dá)上調(diào)。與OVA組相比，OVA/RSV組中IL-13和IL-33 mRNA表達(dá)增加更加明顯（P＜0.05），IL-5和ST2 mRNA表達(dá)有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子升高提示RSV感染OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠中Th2型免疫反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)，符合哮喘急性發(fā)作特征。

小鼠肺組織及BALF中IL-33蛋白水平ELISA法檢測(cè)各組小鼠肺組織勻漿及BALF中IL-33蛋白水平，肺組織中IL-33蛋白質(zhì)水平已校正為全肺水平。與PBS組相比，RSV組和OVA組小鼠肺勻漿及BALF中的IL-33蛋白質(zhì)水平均顯著升高（P＜0.05）。與RSV組相比，OVA/RSV組小鼠肺勻漿及BALF中的IL-33蛋白質(zhì)水平均升高。與OVA組相比，OVA/RSV組小鼠肺組織勻漿中IL-33增高更加顯著（P＜0.05），BALF中IL-33有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠肺組織中IL-33 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平基本呈平行趨勢(shì)。

討 論

呼吸道病毒感染誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作，進(jìn)一步損害肺功能及加速疾病進(jìn)展。哮喘穩(wěn)定期用藥（如吸入性激素、長(zhǎng)效β 受體激動(dòng)劑等）對(duì)病毒感染誘導(dǎo)的急性發(fā)作常常效果不佳。加快對(duì)呼吸道病毒感染所致哮喘急性發(fā)作機(jī)制的了解與研究，尤其是提供新的治療策略，既是迫切需要也是重大挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)在前期OVA哮喘模型基礎(chǔ)上［11］，再應(yīng)用RSV感染，觀察到BALF中細(xì)胞總數(shù)進(jìn)一步升高，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯，Th2型細(xì)胞因子進(jìn)一步升高，表明RSV感染致哮喘急性發(fā)作小鼠模型成功建立。

第0天腹腔注射OVA致敏小鼠，然后在第7～13天連續(xù)1周進(jìn)行霧化OVA激發(fā)，相較于僅PBS致敏激發(fā)的空白對(duì)照小鼠，血清總IgE水平顯著升高。第14天RSV急性感染OVA致敏激發(fā)的小鼠血清總IgE水平未見(jiàn)進(jìn)一步升高。推測(cè)此模型中IgE作為過(guò)敏性疾病的特征，并不能反映病毒感染致哮喘急性發(fā)作的程度，提示哮喘急性發(fā)作可能并不依賴IgE水平［12］。在BALF中，OVA組 較PBS組細(xì)胞總數(shù)升高，OVA/RSV組小鼠可見(jiàn)細(xì)胞總數(shù)再次升高。BALF中細(xì)胞總數(shù)升高預(yù)示炎癥加重，Mahmutovic等［13］通過(guò)屋塵螨致敏激發(fā)建立哮喘模型，并以不同濃度RV替代物雙鏈RNA急性感染，觀察到BALF中細(xì)胞總數(shù)水平升高，濃度越高的雙鏈RNA可檢測(cè)到的細(xì)胞總數(shù)水平越高。比較BALF中的各組分類細(xì)胞計(jì)數(shù)，OVA組以EOS升高為主，提示OVA誘導(dǎo)的哮喘模型以EOS炎癥為主；RSV組中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)均有不同程度升高；OVA/RSV組較OVA組主要表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增加，推斷病毒感染可誘導(dǎo)以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主的炎癥，而非以EOS炎癥為主。這與臨床上難治性哮喘以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主相符合［14］，可為研究難治性哮喘提供思路。Nguyen等［15］在RSV感 染OVA誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作小鼠模型中觀察到，以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞滲出為主，這與本研究觀察結(jié)果一致。Nguyen等［15］還觀察到地塞米松可以完全抑制OVA致敏激發(fā)的哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和EOS聚集，但不能抑制RSV急性感染OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘急性發(fā)作時(shí)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的炎癥滲出。病理切片結(jié)果顯示，OVA組和RSV單獨(dú)感染組均見(jiàn)到小氣道周圍不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；在OVA組還可觀察到杯狀細(xì)胞增生，這可導(dǎo)致哮喘小鼠氣道重構(gòu)以及分泌更多黏液。RSV急性感染OVA誘導(dǎo)哮喘的小鼠，小氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更加明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，甚至可見(jiàn)氣道上皮的脫落。Mahmutovic-Persson等［16］觀察到RV替代物雙鏈RNA感染OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠，有更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及更高的炎癥評(píng)分。綜合上述特點(diǎn)，本研究成功建立了RSV感染OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠急性發(fā)作模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下一定基礎(chǔ)。

為了進(jìn)一步探究呼吸道病毒感染誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作的機(jī)制，我們分析了Th2型細(xì)胞因子、IL-33和ST2的變化。本研究觀察到OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠仍然有較高的IL-5和IL-13基因表達(dá)水平，這符合哮喘以Th2型免疫反應(yīng)為主的特征。在RSV感染OVA誘導(dǎo)哮喘的小鼠中，僅觀察到IL-13表達(dá)進(jìn)一步升高，IL-5無(wú)明顯升高趨勢(shì)，且RSV單獨(dú)感染小鼠的IL-13水平也較OVA哮喘小鼠有所升高，推測(cè)RSV感染致哮喘急性發(fā)作可能依賴于IL-13的表達(dá)。RSV單獨(dú)感染小鼠可觀察到Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)增加，這與Zeng等［17］的研究結(jié)果一致。IL-33作為新 近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族 成員［2］，在RV急性 感染誘導(dǎo) 哮喘加重小鼠模 型中起重 要作用［13，18］。Saglani等［19］觀察到激素耐藥的難治性哮喘患者中IL-33表達(dá)升高，IL-33在介導(dǎo)氣道重構(gòu)中起重要作用，并通過(guò)ST2缺失小鼠進(jìn)一步證實(shí)IL-33作為激素耐藥介質(zhì)可促進(jìn)難治性哮喘的氣道重構(gòu)，提出IL-33可作為難治性哮喘重要的治療靶點(diǎn)。本研究中，IL-33 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠及RSV單獨(dú)感染小鼠均上調(diào)，而其受體ST2 mRNA表達(dá)卻無(wú)明顯升高。與哮喘小鼠相比，RSV感染OVA誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作小鼠中IL-33 mRNA及蛋白質(zhì)水平均顯著增加。

綜上，IL-33可能參與RSV感染OVA誘導(dǎo)哮喘急性發(fā)作的過(guò)程。本研究有助于闡明RSV感染介導(dǎo)哮喘急性發(fā)作的機(jī)制。IL-33/ST2信號(hào)通路在此模型的具體作用機(jī)制及阻斷IL-33/ST2信號(hào)通路是否對(duì)RSV感染致哮喘急性發(fā)作有效，還有待進(jìn)一步探討。