于慧輝 詹延霞 季麗莉 李 煬 孫麗華 程韻楓， 化范例△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院血液科 上海 201508；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科 上海 201700；3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科 上海 200032）

原發(fā)性免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是臨床常見的獲得性自身免疫性出血性疾病，由于免疫紊亂導(dǎo)致血小板及巨核細(xì)胞破壞增加和/或生成減少。原發(fā)性ITP患者體內(nèi)存在多種免疫細(xì)胞亞群數(shù)量和功能異常［1］，Th1/Th2顯著失衡，目前公認(rèn)原發(fā)性ITP為Th1優(yōu)勢自身免疫性疾?。?］。部分B細(xì)胞可以通過分泌IL-10而影響T細(xì)胞亞群（如Th1、Th17等）的分化和功能，其中CD5+B細(xì)胞是產(chǎn)生IL-10的重 要B細(xì)胞 亞群［3-4］，多種具有免疫調(diào)節(jié)功能的B細(xì)胞亞群都表達CD5分子標(biāo)志物［5-7］。我們發(fā)現(xiàn)原發(fā)性ITP患者CD5+B細(xì)胞存在數(shù)量及分泌IL-10能力的異常［8-9］，提示在原發(fā)性ITP患者中CD5+B細(xì)胞對T細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)功能可能存在缺陷。原發(fā)性ITP的一線治療藥物為糖皮質(zhì)激素，首選大劑量地塞米松（highdose dexamethasone，HD-DXM）沖擊治療［10］。本研究通過觀察原發(fā)性ITP患者CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌Th1和Th2型代表性細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-4的調(diào)節(jié)作用，以及經(jīng)過HD-DXM治療后CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的變化，探討CD5+B細(xì)胞在原發(fā)性ITP患者Th1/Th2失衡中的作用。

資料和方法

研究對象所有研究對象均符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016年版）》［11］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。收集2018年2月至6月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院血液科病房ITP患者共5例（男1例、女4例），中位年齡49（35～62）歲。招募健康對照者5例（男2例、女3例），中位年齡35（28～46）歲。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

HD-DXM沖擊治療方案患者起始血小板計數(shù)＜30×109/L和/或有出血表現(xiàn)，接受HD-DXM沖擊治療：口服地塞米松40 mg/d×4天，重癥患者同時給予靜脈注射丙種球蛋白0.4 g·kg?1·d?1×5天和/或血小板輸注和/或重組人血小板生成素；4天后停藥，若血小板穩(wěn)定，則不再用藥；若血小板下降至＜50×109/L，則重復(fù)給藥1次，然后以潑尼松15 mg/d維持。療效評估參照文獻［11］。

淋巴細(xì)胞分選ITP患者接受HD-DXM治療前、后均采集外周靜脈血20 mL，EDTA-K2抗凝；健康對照者采集外周靜脈血20 mL。采用Ficoll密度梯度離心法獲得外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。分選CD4+T細(xì)胞：1×107PBMC重懸于80 μL分選緩沖液中，加入20 μL CD4磁珠，置于4 ℃冰箱孵育15 min；洗滌重懸后過柱，獲得陽性細(xì)胞（純度＞99%）。分選CD19+CD5+B細(xì)胞和CD19+CD5-B細(xì)胞：1×107PBMC重懸于80 μL分選緩沖液中，加入20 μL CD19磁珠，置于4 ℃冰箱孵育15 min，后10 min加入CD5-Biotin抗體10 μL；洗滌后過柱，分選獲得CD19+B細(xì)胞；1 mL CD19+細(xì)胞中加入20 μL酶切試劑，4 ℃孵育10 min，洗滌后重懸于50 μL緩沖液；加入30 μL終止液；加入20 μL Biotin磁珠，4 ℃孵育15 min；洗滌重懸后過柱，分選獲得CD19+CD5+B細(xì)胞（純度＞90%），其余為CD19+CD5-B細(xì)胞（純度＞98%）。

淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)CD4+T細(xì)胞（2×105/mL）與完全RPMI 1640培養(yǎng)基混合，接種于預(yù)包被CD3 mAb的96孔培養(yǎng)板，在2.5 μg/mL CD28 mAb和10 ng/mL IL-2的條件下，磁珠純化出的CD19+CD5+B細(xì)胞或CD19+CD5?B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞按1∶9、1∶5、1∶3、1∶1，混合培養(yǎng)72 h或144 h。

ELISA檢測IFN-γ 和IL-4水平取上述細(xì)胞共培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書檢測IFN-γ 和IL-4水平，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)3個復(fù)孔，酶標(biāo)儀讀取波長450 nm處的吸光度（D）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IFN-γ 和IL-4含 量。所用ELISA試劑盒IFN-γ 和IL-4的最低檢測濃度分別為5 pg/mL和0.5 pg/mL。

統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS 16.0和GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，多組間計量資料比較采用雙因素ANOVA檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

健康對照組CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響共培養(yǎng)72 h，健康對照組CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例在1∶3時，CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ濃度明顯下降，與T細(xì)胞單獨培養(yǎng)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義［（2 427.99±632.62）pg/mLvs.（1 109.25±338.10）pg/mL，P=0.001 2］。CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì) 胞比例增加至1∶1時，CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ 濃度下降至（395.22±136.54）pg/mL（P＜0.001）。共培養(yǎng)144 h得到相似的結(jié)果，但培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度較共培養(yǎng)72 h高出數(shù)倍。

共培養(yǎng)72 h，各濃度梯度下CD5CD5?BB細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度均未見明顯影響（P均＞0.05）；當(dāng)CD5-B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例增加至1∶1時，IFN-γ 濃度有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。共培養(yǎng)144 h，CD5?B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例為1∶9時表現(xiàn)為促進IFN-γ的 分泌，而B與T細(xì)胞比例增加至1∶3時對IFN-γ的分泌才產(chǎn)生抑制作用，較T細(xì)胞單獨培養(yǎng)時IFN-γ濃度顯著下降（P均＜0.01，圖1、表1）。

表1 健康對照組CD5+/CD5-B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度Tab1 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells in healthy control group ［（），pg/mL］

表1 健康對照組CD5+/CD5-B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度Tab1 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cells in healthy control group ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，P＜0.01.T：T cell；B：B cell.

ITP患者CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響共培養(yǎng)72 h，ITP患者CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例增至3∶1時，較T細(xì)胞單獨培養(yǎng)時IFN-γ的分泌顯著下降［（3 060.02±493.98）pg/mLvs.（1 769.45±634.73）pg/mL，P=0.000 3］。共培養(yǎng)144 h，ITP患者CD5+B細(xì)胞有輕度抑制CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

共培養(yǎng)72 h，ITP患者CD5?B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例為1∶1時，CD5-B細(xì)胞促進CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，與T細(xì)胞單獨培養(yǎng)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.029 1）。共培養(yǎng)144 h，ITP患者CD5?B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ幾乎沒有影響（P均＞0.05，圖1、表2）。

表2 原發(fā)性ITP患者HD-DXM治療前CD5+和CD5-B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度Tab 2 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cellsof primary ITP patients before HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

表2 原發(fā)性ITP患者HD-DXM治療前CD5+和CD5-B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中IFN-γ 濃度Tab 2 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+T cells cocultured with CD5+/CD5-B cellsof primary ITP patients before HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，（1）P＜0.05；（2）P＜0.01.T cell；B：B cell.

ITP患者HD-DXM治療后CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響經(jīng)HD-DXM治療后ITP患者均獲得完全或部分反應(yīng)。共培養(yǎng)72 h，CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例為1∶1時，即表現(xiàn)出對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的抑制作用［（3 600.02±838.00）pg/mLvs.（1 157.97±383.20）pg/mL，P＜0.000 1］；當(dāng)比例增加至3∶1時，CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ 濃度進一步下降至（829.67±314.25）pg/mL（P＜0.000 1）。共培養(yǎng)144 h的結(jié)果同樣顯示，經(jīng)過HD-DXM有效治療后，CD5+B細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞比例 為1∶3時，表 現(xiàn)出對CD4+T細(xì)胞 分泌IFN-γ的抑制作用［（11 543.53±3 541.90）pg/mLvs.（5 102.81±1 734.33）pg/mL，P=0.002 9］；當(dāng)比例增至1∶1和3∶1時，CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的濃度隨著B∶T細(xì)胞比例的增加進一步下降（P均＜0.000 1，表3）。

表3 原發(fā)性ITP患者HD-DXM治療后CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Tab 3 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+Tcells cocultured with CD5+B cells of primary ITP patients after HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

表3 原發(fā)性ITP患者HD-DXM治療后CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響Tab 3 The concentration of IFN-γ in supernatant of CD4+Tcells cocultured with CD5+B cells of primary ITP patients after HD-DXM treatment ［（），pg/mL］

（1）vs.T cell culture alone，P＜0.01.T：T cell；B：B cell.

健康對照者及ITP患者的CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IL-4的影響在健康對照者和ITP患者中，CD5+B細(xì)胞以不同比例與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，無論72 h還是144 h，培養(yǎng)上清中IL-4的濃度變化與T細(xì)胞單獨培養(yǎng)時比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。CD5-B細(xì)胞以不同比例與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，同樣對IL-4的濃度無明顯影響。

討 論

CD5+B細(xì)胞具有分泌IL-10的能力，其免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)在動物實驗中得到證實：體外誘導(dǎo)擴增的CD5+B細(xì)胞回輸小鼠體內(nèi)可以緩解實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎疾病，而CD5-B細(xì)胞則不具備這種免疫調(diào)節(jié)功能［12］。本研究證實，健康對照組共培養(yǎng)72 h時CD5+B細(xì)胞具有抑制CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的作用，提示CD5+B細(xì)胞影響Th1細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子分泌，并在維持Th1/Th2平衡中起到重要作用。

我們發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性ITP患者中CD5+B細(xì)胞存在數(shù)量及分泌IL-10能力的異常［8-9］，這提示在ITP患者中CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能可能存在缺陷。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于健康對照組，CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ（Th1型代表性細(xì)胞因子）有顯著抑制作用，ITP患者中CD5+B細(xì)胞抑制IFN-γ分泌的能力明顯受損，CD5+B細(xì)胞在更高的比例下才表現(xiàn)出對CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的抑制作用，而且在相同的B：T細(xì)胞比例下，IFN-γ 分泌受抑制的程度遠低于健康對照組。說明在ITP患者中CD5+B細(xì)胞調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的功能存在缺陷。CD5+B細(xì)胞主要通過分泌IL-10發(fā)揮免疫抑制功能，本研究結(jié)果也與我們之前發(fā)現(xiàn)的ITP患者CD5+B細(xì)胞存在分泌IL-10能力異常相一致。B細(xì)胞分泌IL-10主要由Toll樣受體及其下游的MyD88通路所介導(dǎo)，針對ITP患者CD5+B細(xì)胞，我們運用PCR Array方法對TLRs/MyD88信號傳導(dǎo)通路中的相關(guān)分子進行初步探索，篩選出一些重要的差異表達分子，如FOS、JUN、IRF3等［13］，為后續(xù)機制研究提供了方向。

另一方面，健康對照者和原發(fā)性ITP患者的CD5+B細(xì)胞對Th2型代表性細(xì)胞因子IL-4的分泌均無明顯影響。CD5+B細(xì)胞可以下調(diào)Th1/Th2型細(xì)胞因子的比例，但在ITP患者中由于CD5+B細(xì)胞抑制IFN-γ 分泌的能力明顯受損，可能造成Th1/Th2失衡和Th1型細(xì)胞因子優(yōu)勢。ITP是一種典型的Th1優(yōu)勢的自身免疫性疾病，Th1/Th2失衡在ITP的發(fā)病機制中起到重要作用［14-16］。本研究結(jié)果提示，CD5+B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能缺陷參與了ITP患者形成Th1優(yōu)勢和Th1/Th2失衡的過程。

HD-DXM治療療效好、療程短、不良反應(yīng)小，故推薦作為ITP的一線治療［10］，但其作用機制尚不完全清楚。與治療前相比，在HD-DXM治療有效的ITP患者中觀察到Th1/Th2失衡可被糾正［17］及Treg數(shù)量增加［18］等免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的變化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ITP患者CD5+B細(xì)胞的IL-10分泌障礙可以被HD-DXM修復(fù)［8］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，患者接受HD-DXM治療后，CD5+B細(xì)胞抑制IFN-γ 分泌的能力部分恢復(fù)，提示CD5+B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的恢復(fù)可能也是HD-DXM的作用機制之一。功能部分恢復(fù)的CD5+B細(xì)胞對IFN-γ 分泌的抑制程度仍顯著低于健康對照者，這說明經(jīng)過HD-DXM治療，患者的血小板計數(shù)升高到相對安全的范圍，但其CD5+B細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能尚未完全恢復(fù)，患者仍處于免疫失衡狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的原因之一。本研究中有2例患者同時使用具有免疫調(diào)節(jié)功能的丙種球蛋白，其對T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響尚無明確定論，丙種球蛋白聯(lián)合地塞米松對T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子方式的影響及其臨床意義值得進一步探討。

本研究還比較了CD5-B細(xì)胞與CD5+B細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)功能上的差異。無論是在健康對照者還是ITP患者中，共培養(yǎng)72 h，CD5-B細(xì)胞均不能抑制CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，在ITP患者中隨著CD5-B細(xì)胞比例的增加，反而有促進CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的趨勢。共培養(yǎng)時間延長至144 h，健康對照組中隨著CD5-B細(xì)胞比例的增加，表現(xiàn)出對IFN-γ的分泌有一定的抑制作用，而ITP患者中CD5-B細(xì)胞對IFN-γ的分泌幾乎不產(chǎn)生影響。Lemoine等［19］研究認(rèn)為，在T細(xì)胞與B細(xì)胞相互作用的過程中，B細(xì)胞可上調(diào)CD5的表達并獲得抑制T細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。ITP患者中B細(xì)胞的異常表現(xiàn)提示其獲得免疫抑制功能的通路受阻，但具體機制有待深入研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性ITP患者CD5+B細(xì)胞抑制CD4+T細(xì)胞分泌Th1型代表性細(xì)胞因子IFNγ的能力明顯受損，但是對Th2型代表性細(xì)胞因子IL-4的分泌無明顯影響。HD-DXM治療有效的ITP患者中，CD5+B細(xì)胞抑制IFN-γ 分 泌的能力可部分恢復(fù)。本研究一方面揭示了CD5+B細(xì)胞在ITP疾病發(fā)生發(fā)展尤其是Th1/Th2失衡中可能發(fā)揮的作用，另一方面也為ITP患者B細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能缺陷制定相應(yīng)的治療策略提供了實驗基礎(chǔ)。