宋衛(wèi)娜，趙森森，武明珠，王根發(fā)，羅朝鵬，王 晨，李澤鋒，楊 軍，王 中*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道100號(hào) 450001

3.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)第三大街9號(hào) 450000

植物TALE（Three amino-acid loop extension）基因家族編碼一類包含同源異型盒結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，其DNA結(jié)合域由63個(gè)氨基酸組成，形成2個(gè)螺旋與3個(gè)額外氨基酸（P-Y-P）的非典型結(jié)構(gòu)［1-2］。根據(jù)序列和進(jìn)化上的差異，植物TALE基因家族可進(jìn)一步被分為BELL（BEL1-like homeodomain）和KNOX（KNOTTED1-like homeobox）兩個(gè)亞家族。KNOX基因主要參與細(xì)胞分化和莖尖分生組織的維持［3-4］，而B(niǎo)ELL基因在胚珠發(fā)育、葉狀體發(fā)育、干細(xì)胞維持和分化中起著重要作用［5-7］。

BELL基因家族存在于所有生物體中，但不同植物中該基因家族成員數(shù)目不同。例如，苔蘚基因組中有 4個(gè)BELLs基因［8］，擬南芥有13個(gè)［5］，玉米有15個(gè)［9］，而水稻和土豆各有14個(gè)［10-11］。雖然BELL基因家族的數(shù)目不同，但其編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，都包含SKY、BEL和HD功能域［12］。這3個(gè)功能域的高度保守對(duì)維持植物BELL的功能具有重要意義。研究表明，SKY和BEL功能域能夠與KNOX蛋白的MEINOX結(jié)構(gòu)域進(jìn)行特異性識(shí)別和結(jié)合，從而形成BELL-KNOX異源二聚體蛋白［13］，這種結(jié)合對(duì)兩種轉(zhuǎn)錄因子蛋白的核定位和結(jié)合靶基因序列的活性至關(guān)重要［14-16］。BELL-KNOX二聚體形成后會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，隨后兩個(gè)蛋白的HD功能域識(shí)別并特異結(jié)合到各自的靶基因序列上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)下游靶基因表達(dá)水平的調(diào)控［2，17］。與此同時(shí)，BELL-KNOX二聚體蛋白還能與其他轉(zhuǎn)錄因子互作。例如，與MADS-Box轉(zhuǎn)錄因子和SPOROCYTELESS蛋白結(jié)合，共同調(diào)控胚珠的發(fā)育［18-19］；與OVATE蛋白結(jié)合后，BELL-KNOX二聚體蛋白能夠從細(xì)胞核反向轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中［20］。多種具有不同活性的異源BELL-KNOX二聚體組合參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，包括莖尖分生組織及其邊界的維持、葉片發(fā)育、開(kāi)花等［20-23］。在擬南芥中，BELL家族的BLH1蛋白能夠與KNOX家族的KNAT3蛋白結(jié)合形成BLH1-KNAT3二聚體，通過(guò)調(diào)控脫落酸（ABA）信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)而影響種子的發(fā)芽和生長(zhǎng)［14，20］。BELL 家族的ATH1蛋白與 KNOX 家族STM蛋白形成的二聚體能夠調(diào)控植物頂端分生組織的發(fā)育［15］，而ATH1蛋白和KNAT2蛋白形成的二聚體則調(diào)控植物花序組織的發(fā)育［24］。

雖然已在多種植物中鑒定出了BELL基因，但大多數(shù)基因的功能仍未十分明確。目前，關(guān)于BELL基因功能的研究主要集中在模式植物擬南芥中，鮮見(jiàn)煙草BELL（NtBELL）基因的報(bào)道。根據(jù)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的方法，通過(guò)檢索SKY、BEL和HD功能域鑒定出煙草基因組中的BELL基因后，對(duì)煙草BELL家族成員的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步研究煙草BELL基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

供試材料為普通栽培煙草紅花大金元（Nicotiana tabacum L.）。煙草種子于2017年3月播種于MS培養(yǎng)基上，待幼苗長(zhǎng)至4片真葉時(shí)，移栽到小盆缽中。移栽后的幼苗種植在國(guó)家煙草基因研究中心溫室，溫室條件為28℃光照16 h，23℃黑暗8 h。待煙苗長(zhǎng)至盛花期，分別收集根、莖、葉、頂芽、花蕾和花等樣品，經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存。

TransTaq?高保真Taq酶試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）；植物多酚RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和凝膠回收試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶（大連寶生物工程有限責(zé)任公司）。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

MM400混合型碾磨儀（德國(guó)Retsch公司）；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司）；C1000TMThermal Cycler熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 干旱和鹽脅迫處理

煙草幼苗在MS培養(yǎng)基上長(zhǎng)至4片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別移入含有0、1%和3%（質(zhì)量體積比）NaCl的MS培養(yǎng)基上。正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)1周，收取全株幼苗，液氮速凍后用于總RNA的提取。將幼苗從MS培養(yǎng)基移栽到盆缽中，溫室中生長(zhǎng)，每周澆2次水，每次300 mL。待煙苗長(zhǎng)至8片真葉時(shí)進(jìn)行干旱處理，分別采集斷水后0、2、4和6 d的煙草葉片［25-26］，液氮速凍后用于總RNA的提取。

1.2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用植物多酚RNA提取試劑盒提取煙草各組織RNA，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在提取過(guò)程中，加入RNase-free DNase I消化可能殘留的基因組DNA。提取完成后，各RNA樣品的濃度和質(zhì)量分別用Nanodrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。選擇質(zhì)量檢測(cè)合格且濃度較高的RNA樣品用于cDNA第一鏈的合成，合成過(guò)程參照Gene Star M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)。cDNA樣品的濃度經(jīng)Nanodrop 2000檢測(cè)后，用ddH2O統(tǒng)一稀釋至40 ng/μL，-20 ℃保存。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

以BEL1-like homeodomain protein為關(guān)鍵詞在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)V4.0中進(jìn)行檢索，獲得所有普通煙草中的候選BELLs基因。隨后將所有候選基因編碼的蛋白序列導(dǎo)入到Pfam軟件（http：//pfam.xfam.org/search）中進(jìn)行功能域分析，選擇同時(shí)包含SKY、BEL和HD功能域的基因作為煙草BELL家族基因。提取各NtBELLs基因的序列、染色體位置、外顯子個(gè)數(shù)、核苷酸長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、蛋白分子量、等電點(diǎn)等信息。利用DNAMAN V6.0比對(duì)煙草BELLs基因編碼蛋白的氨基酸序列，再利用 MEME 軟件（http：//meme-suite.org/）確定煙草BELLs基因3個(gè)保守功能域的氨基酸序列，用GSDS軟件（http：//gsds.cbi.p-ku.edu.cn/）分析基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并繪圖。

根據(jù)NtBELLs基因在煙草染色體上的位置信息，利用MapInsect軟件進(jìn)行染色體定位和圖譜的繪制。用Clustal X軟件比對(duì)不同物種中BELLs基因編碼的氨基酸序列，比對(duì)完成后將結(jié)果導(dǎo)入MEGA5軟件中，用Neighbor-joining方法構(gòu)建BELLs基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。本研究中，用到其他物種的BELLs基因分別來(lái)自擬南芥（AtBEL10/AT1G19700、AtBLH5/AT2G27220、AtBLH3/AT1G75410、tBLH6/AT4G34610、AtBLH7/AT2G16400、AtBLH11/AT1G 75430、AtBEL1/AT5G41410、AtBLH4/AT2G23760、AtBLH2/AT4G36870、AtBLH1/AT2G35940、AtBLH8/AT2G27990、AtBLH9/AT5G02030、AtATH1/AT4G32 980）和馬鈴薯（StBLH5/PGSC0003DMP400010515、StBEL29/PGSC0003DMP400036956、StBEL11/PGSC 0003DMP400034115、StBEL13/PGSC0003DMP4000 17878、StBEL14/PGSC0003DMP400021824、StBEL22/PGSC0003DMP400038077、StBEL30/PGSC0003DMP 400053924、StBEL32/PGSC0003DMP400006695、StBE L33/PGSC0003DMP400041981、StBEL34/PGSC0003 DMP400014183、StBEL35/PGSC0003DMP400033253、StBEL6/PGSC0003DMP400052181、StBEL31/PGSC 0003DMP400006694）。

1.2.4 基因表達(dá)分析

利用熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)煙草NtBELLs基因在根、莖、葉等不同組織和脅迫條件下的表達(dá)，引物見(jiàn)表1。在冰上配制qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green Master、3 μL cDNA 模板（40 ng/μL）、上 下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL、5 μLddH2O，充分混勻后瞬時(shí)離心。qRT-PCR反應(yīng)程序采用兩步法，即95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃30 s，信號(hào)采集，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后運(yùn)行溶解曲線程序（65～95℃）。以3株長(zhǎng)勢(shì)相近的煙草葉片作為1個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)組織共設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。qRT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔCT或 2-ΔΔCT方法計(jì)算NtBELLs基因的相對(duì)表達(dá)量［27］。

表1 NtBELLs基因引物Tab.1 Primers of NtBELL genes

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草BELLs基因的鑒定

在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)V4.0中，用BEL1-like homeodomain protein作為關(guān)鍵字進(jìn)行檢索后，共獲得28個(gè)可能的BELLs基因。通過(guò)Pfam功能域分析發(fā)現(xiàn)，28個(gè)煙草BELLs基因均包含典型的SKY、BEL和HD結(jié)構(gòu)域，屬于BELL基因家族成員。由表2可知，NtBELLs基因含有3～8個(gè)外顯子，大多數(shù)含有4個(gè)。NtBELL基因的編碼區(qū)在1 299～2 289 bp之間，編碼432～762個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量在48.81～82.99 kDa之間，等電點(diǎn)為4.88～9.15。

兩兩比對(duì)NtBELLs基因編碼區(qū)序列和氨基酸序列的相似性（表3），根據(jù)相似性的高低，將NtBELLs基因分為15組，分別命名為NtBELL1～NtBELL15。其中，NtBELL7和NtBELL15各有1個(gè)拷貝，而其他NtBELLs基因都有兩個(gè)相似性很高的拷貝。

2.2 煙草NtBELLs基因的染色體定位及進(jìn)化分析

由圖1可知，除3個(gè)定位在scaffold上的NtBELLs基因（Ntab0312290、Ntab0471080和 Ntab0547850）外，其余25個(gè)煙草NtBELLs基因分別分布在15條不同的染色體上。其中，7和22號(hào)染色體上分布的BELLs基因最多，各有3個(gè)。NtBELL8基因的兩個(gè)拷貝（Ntab0734150和Ntab0815520）都分布在10號(hào)染色體上，而且二者序列相似性為100%，推測(cè)可能由染色體復(fù)制產(chǎn)生。NtBELL4和NtBELL5基因的兩個(gè)拷貝都分別分布在5和22號(hào)染色體上，且相鄰在一起，表明二者之間可能存在一定的連鎖性。

表2 普通煙草中BELLs的基因信息Tab.2 Information of BELL genes in Nicotiana tabacum

圖1 NtBELLs基因在染色體上的分布Fig.1 Chromosome location of NtBELL genes

為進(jìn)一步明確煙草BELL基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系和可能的生物學(xué)功能，根據(jù)煙草、擬南芥和馬鈴薯BELLs基因編碼的氨基酸序列，構(gòu)建BELL基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖2可知，BELL基因家族被分為4個(gè)組，即BELL-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。煙草NtBELL基因在4個(gè)組上的分布較為均勻，如BELL-Ⅰ和Ⅲ各有6個(gè)NtBELLs基因，BELL-Ⅱ有9個(gè)，BELL-Ⅳ有7個(gè)。擬南芥、馬鈴薯已有的BELLs基因功能研究結(jié)果表明，不同組的BELLs基因可能具有不同的生物學(xué)功能［11，13-15］。推測(cè) BELL-Ⅰ組中的NtBELL1、NtBELL4和NtBELL5蛋白可能主要作為OVATE家族蛋白的伴侶發(fā)揮功能；BELL-Ⅱ組中NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL7和 NtBE LL8蛋白主要參與根的生長(zhǎng)；BELL-Ⅲ組中的BELLs蛋白主要參與分生組織的發(fā)育；BELL-Ⅳ組中的NtBELL14和NtBELL15蛋白可能參與調(diào)控胚珠的形態(tài)發(fā)育，而NtBELL11和NtBELL12蛋白則可能參與葉片的形態(tài)發(fā)育［1，11，15，28-29］。

2.3 煙草NtBELLs基因的結(jié)構(gòu)及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

圖2 BELL基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of BELL gene families in plants

煙草28個(gè)NtBELLs基因的長(zhǎng)度差異非常大，最長(zhǎng)的基因（Ntab0312290）有11 259 bp，而最短的基因（Ntab0844240）只有1 786 bp，大多數(shù)基因的長(zhǎng)度在3～5 kb之間（圖3）。典型的煙草NtBELLs基因由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成，且外顯子的長(zhǎng)度（尤其是第2和第3個(gè)外顯子）比較保守。NtBELL1、NtBELL2、NtBELL5、NtBELL8～NtBELL13 基因均包含4個(gè)外顯子，其中第2個(gè)外顯子的長(zhǎng)度在322～400 bp之間，第3個(gè)外顯子長(zhǎng)度在61 bp左右。其他NtBELLs基因的結(jié)構(gòu)則是在此基礎(chǔ)上發(fā)生了內(nèi)含子的插入，形成更多的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)。例如，NtBELL3基因的第1、2和4號(hào)外顯子中間分別插入了1個(gè)內(nèi)含子，形成了6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子的結(jié)構(gòu)。不同NtBELLs基因同一內(nèi)含子的長(zhǎng)度差異很大，同一NtBELL基因的不同內(nèi)含子長(zhǎng)度也有較大的差異。不同NtBELLs基因中，第1個(gè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度為300～3 000 bp；NtBELL14基因所有內(nèi)含子的長(zhǎng)度在92～4 700 bp之間。NtBELLs基因內(nèi)含子長(zhǎng)度的差異可能與基因的選擇性剪切有關(guān)。

比對(duì)煙草NtBELLs蛋白的氨基酸序列后發(fā)現(xiàn)，有兩個(gè)保守性很高的區(qū)域（圖4A），分析發(fā)現(xiàn)其分別包含BELLs蛋白的3個(gè)典型功能域，即SKY、BEL和HD。用MEME軟件進(jìn)一步分析這3個(gè)功能域在所有煙草NtBELLs蛋白中的保守氨基酸（圖4B），發(fā)現(xiàn)保守性最高的是HD功能域。3個(gè)功能域在NtBELLs基因上的分布位置也非常保守，SKY分布在第1和第2個(gè)外顯子上，BEL和HD功能域連在一起，分布在第2、3和4個(gè)外顯子上。

2.4 煙草NtBELLs基因的表達(dá)模式分析

檢測(cè)了NtBELLs基因在普通煙草盛花期根、莖、葉、花蕾、花和果實(shí)中的表達(dá)水平（圖5）。幾乎每個(gè)NtBELLs基因都有兩個(gè)拷貝（除NtBELL7和NtBELL15），引物設(shè)計(jì)時(shí)很難將同一基因的不同拷貝區(qū)分開(kāi)，因此選擇在基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)兩個(gè)拷貝的通用引物。在煙草根、莖、葉、花蕾、花和果實(shí)等組織中都能檢測(cè)到NtBELLs基因的表達(dá)，但是不同組織中NtBELLs基因的表達(dá)量有明顯差異。在根中，NtBELL2、NtBELL3和NtBELL7基因的表達(dá)水平明顯高于其他NtBELLs基因；在莖中，表達(dá)量最高是 NtBELL1、NtBELL2、NtBELL8和 NtBELL13基因；在葉中表達(dá)量最高的是NtBELL11和NtBELL12基因；在花中，NtBELL5、NtBELL6、NtBELL11 和NtBELL12基因的表達(dá)水平均較高；而在果實(shí)中表達(dá)水平最高的是NtBELL14和NtBELL15基因?；虮磉_(dá)水平的巨大差異預(yù)示著不同的NtBELLs基因可能在煙草各個(gè)組織發(fā)育中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。

圖3 煙草NtBELLs基因的外顯子和內(nèi)含子Fig.3 Exons and introns of NtBELL genes

圖4 煙草NtBELLs蛋白功能域分析Fig.4 Functional domain analysis of NtBELL proteins

圖5 不同組織中NtBELLs基因的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of NtBELL genes in different tobacco tissues

為探究NtBELLs基因在煙草抵御環(huán)境脅迫過(guò)程中的功能，分別檢測(cè)了NtBELLs基因在干旱和鹽脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)水平。如圖6所示，大多數(shù)NtBELLs基因的表達(dá)水平在干旱條件下沒(méi)有明顯變化。與0 d相比，NtBELL2基因的表達(dá)水平在干旱處理2 d時(shí)升高了兩倍，隨后一直保持在兩倍以 上 的 水 平 。 NtBELL4、NtBELL8、NtBELL10和NtBELL13基因的表達(dá)水平都是在干旱處理4 d時(shí)開(kāi)始升高，6 d時(shí)達(dá)到更高的水平。其中，NtBELL8基因的表達(dá)水平在6 d升高了3倍，是所有基因中變化量最大的。干旱脅迫誘導(dǎo)NtBELL8基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明其可能參與了煙草的抗旱過(guò)程。

NaCl脅迫處理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度NaCl對(duì)煙草NtBELLs基因表達(dá)水平的影響不同。1%NaCl脅迫處理下，所有NtBELLs基因的表達(dá)水平都沒(méi)有明 顯 變 化 ，但 是 NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL13和NtBELL15基因的表達(dá)水平在3%NaCl處理?xiàng)l件下被明顯上調(diào)（圖7），尤其是NtBELL6基因的表達(dá)水平被上調(diào)了3倍。

3 討論

圖6 干旱條件下煙草NtBELLs基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression levels of NtBELL genes under drought treatment

圖7 NaCl脅迫下煙草NtBELL基因的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of NtBELL genes under NaCl stress

研究表明，多基因家族各成員之間的功能往往會(huì)發(fā)生明顯的分化，系統(tǒng)分析基因家族各成員的序列特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式等可為研究其功能提供指導(dǎo)［30-32］。AtBELLs各成員分別參與了不同組織器官的分化。如AtBLH2（AT4G36870）和AtBLH4（AT2G23760）在擬南芥的葉片、莖、花藥等多個(gè)組織中表達(dá)，在atblh2atblh4的雙突變體中，KNOX家族的BP（BREVIPEDICELLUS）基因異位表達(dá)，導(dǎo)致突變體葉片呈現(xiàn)卷曲的鋸齒狀［5，33］。而AtBLH8（AT2G27990）和AtBLH9基因（AT5G02030）的突變體表現(xiàn)出花序節(jié)間異常，角果畸形簇生，表明二者能夠調(diào)控?cái)M南芥花序原基的生長(zhǎng)［17，34］。根據(jù)擬南芥［13-15］、玉米［9］、馬鈴薯［11］等已有的同源基因研究信息，本研究中對(duì)煙草NtBELLs各成員的功能進(jìn)行了初步的劃分（圖2）。NtBELL9、NtBELL10和NtBELL13基因與擬南芥AtBLH8和AtBLH9基因的親緣關(guān)系較近，推測(cè)NtBELL9、NtBELL10和NtBELL13基因可能參與調(diào)控?zé)煵莘稚M織；NtBELL11和NtBELL12基因與AtBLH2和AtBLH4基因聚類在一起，表明可能與煙草葉片發(fā)育有關(guān)；NtBELL2、NtBELL3、NtBELL6、NtBELL7和 NtBELL8基因與ATBLH、StBELL5、StBELL11等基因的同源性較高，表明可能參與根的生長(zhǎng)及通過(guò)調(diào)控ABA信號(hào)影響種子萌發(fā)和幼苗的形態(tài)建成［11，14］；NtBELL14和NtBELL15基因與擬南芥AtBEL1基因的親緣關(guān)系很近，后者被證實(shí)能夠通過(guò)調(diào)控激素信號(hào)影響擬南芥胚珠的發(fā)育［19，35］。隨后，基因的表達(dá)模式分析也在一定程度上證實(shí)了NtBELLs基因功能的同源預(yù)測(cè)。例如，與葉片發(fā)育有關(guān)的NtBELL11和NtBELL12基因在葉片中的表達(dá)水平最高，與根生長(zhǎng)相關(guān)的NtBELL2、NtBELL3和NtBELL7基因在根中的表達(dá)水平明顯高于其他基因，而與胚珠發(fā)育相關(guān)的NtBELL14和NtBELL15基因則只在果實(shí)中有較高表達(dá)。因此，結(jié)合同源基因比較和基因表達(dá)模式分析，初步確定了煙草各NtBELLs基因的功能，為后續(xù)研究NtBELLs調(diào)控?zé)煵葜仓臧l(fā)育提供參考和依據(jù)。

同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)干旱和NaCl脅迫能夠顯著誘導(dǎo)部分NtBELLs基因的表達(dá)，表明該基因家族可能參與了植物抵御非生物脅迫的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，玉米中一些脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)可能分別受多個(gè)ZmBELLs的調(diào)控［9］，但目前尚沒(méi)有BELLs基因改變植物抗性的報(bào)道。因此，NtBELLs基因調(diào)控?zé)煵萁M織發(fā)育和抗性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)同源比對(duì)和功能域分析，從普通煙草基因組中共鑒定出28個(gè)BELLs基因，根據(jù)其序列相似性及進(jìn)化關(guān)系，分別將其命名為NtBELL1～NtBELL15。所有NtBELLs基因編碼的蛋白都包含SKY、BEL和HD功能域，3個(gè)功能域的序列及在基因上的分布位置都高度保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，煙草NtBELLs基因被明顯分為4組，每組中的NtBELLs參與了煙草不同的發(fā)育過(guò)程。NtBELLs基因在不同煙草組織中的表達(dá)模式與基因功能預(yù)測(cè)基本一致。部分NtBELLs基因的表達(dá)水平受干旱和NaCl脅迫誘導(dǎo)，表明BELL基因家族可能在煙草抵御非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。