許 濛 , 黃 文 , 劉文廣 , 潘肖蘭 , 劉惠茹 , 何毛賢

(1. 中國科學(xué)院 南海海洋研究所, 熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中國科學(xué)院 南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院, 廣東 廣州 510301)

近年來, 人工養(yǎng)殖的馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)存在生長過緩、死亡率高、珍珠品質(zhì)退化等問題[1], 定向人工選育有助于貝的遺傳性狀改良[2]和種質(zhì)資源保護(hù)。我國目前以生長為主要選育目標(biāo)的馬氏珠母貝新品種已培育出4個(“海優(yōu)1號”[3]、“海選1號”[4]、“南科1號”[5]和“南珍1號”[6])。馬氏珠母貝具有紅色[7-9]、白色[10-11]、黃色[12-14]、褐色[10-11,14]和黑色[9,14-15]等殼色, 除生長性狀外, 對于殼色的選育也有報道, 如Wada 和Komaru通過選育實驗發(fā)現(xiàn)馬氏珠母貝的白殼色相對常見褐殼色是隱性純合子[16], 白殼自交系相比褐色-白色雜交系體重增長和存活率較差[10], 但白殼貝作為供體小片產(chǎn)生黃色珍珠的概率顯著低于褐殼貝[11]。類似地, 馬氏珠母貝黃殼色性狀會影響珍珠質(zhì)量[17], 而且與生長性狀存在關(guān)聯(lián)[13,18-20], 我們在前期工作中也從馬氏珠母貝野生群體中發(fā)現(xiàn)了極少量的黃殼色個體, 并構(gòu)建了黃殼家系, 但目前對黃殼性狀的殼色分離還未有報道。

有報道指出貝類的淺色類型存在生活力劣勢[16,21], 黃殼色馬氏珠母貝是否也是如此還不明確?？寡趸芰?total antioxidant capacity, TAC)是評估生物體免疫水平和環(huán)境污染程度的重要指標(biāo), 鐵離子還原法(ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)是測定TAC的常用方法, 在中草藥植物[22]、人體[23]、鹿角珊瑚[24]和海洋貝類[25]中均有報道, Zheng等[26]通過FRAP法評價華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)的TAC, 認(rèn)為橙色扇貝相比褐色扇貝的卵巢中TCC和TAC含量更高。馬氏珠母貝抗氧化性、抗逆性與殼色的關(guān)系目前已有少量報道, 白成等[15]認(rèn)為馬氏珠母貝的黑殼貝在溫度、鹽度脅迫下抗逆能力優(yōu)于黃殼、紅殼、白殼貝, 孟子豪等[27]認(rèn)為高溫脅迫下合浦珠母貝(Pinctada fucata)的總類胡蘿卜素含量(TCC)與總抗氧化能力正相關(guān), 但高TCC家系的抗氧化酶如SOD、CAT活性以及丙二醛含量均顯著低于低TCC家系。

殼色作為易于觀測的表型性狀, 對殼色和生長性狀進(jìn)行協(xié)同選擇和定向選育, 有助于培育易于鑒別的優(yōu)良品種。本文擬研究馬氏珠母貝黃殼色家系殼色遺傳分離、生長及TAC含量, 以期為馬氏珠母貝殼色品種的選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 第一代黃殼家系的構(gòu)建

第一代黃殼家系(F1)屬于父本半同胞家系, 父本和母本均來源于深圳野生群體, 黃殼色個體外面觀為黃色底色, 常見褐殼色個體外面觀為褐色底色(圖1)。1-3號家系是同一只黃殼色父本, 4-6號家系是另一只黃殼色父本, 母本是同一野生群體的黃殼色/褐殼色個體(交配組合見圖2)。同時構(gòu)建的還有35個褐殼家系, 親本均為褐殼。

圖1 馬氏珠母貝黃殼家系中黃殼色(上方兩排)和褐殼色個體(下方兩排) Fig. 1 Yellow individuals (upper two rows) and brown individuals (lower two rows) in yellow shell families of Pinctada fucata martensii

圖2 第二代家系構(gòu)建示意圖 Fig. 2 Progeny tree of the established F2 families

1.2 第二代黃殼家系構(gòu)建

第二代家系(F2)是以F1代2號家系中的黃殼、 褐殼色個體為親本進(jìn)行構(gòu)建。第一組黃殼色父本(♂)2個, 黃殼、褐殼色母本各1個; 其余4個雙列雜交組, 每組包含黃殼雌雄親本各1個, 褐殼雌雄親本各1個, 共構(gòu)建20個家系。培育成功的家系有11個, 分別是黃×黃家系, 編號1、3、9; 黃×褐家系, 編號7、11、15; 褐×黃家系, 編號2、6、14; 褐×褐家系, 編號12、20(見圖2)。

1.3 養(yǎng)殖及數(shù)據(jù)測量

所有家系的授精、孵化、育苗和養(yǎng)成在中國科學(xué)院大亞灣海洋生物綜合實驗站(深圳)進(jìn)行, 期間的光照、水溫、海區(qū)和養(yǎng)殖管理等相同, 不同家系嚴(yán)格隔離、分開籠養(yǎng)。分別在5月齡、7月齡、11月齡、14月齡、20月齡時, 測量F1黃殼家系和其他褐殼色家系(每個家系n=50)的4個生長性狀, 用游標(biāo)卡尺測量殼長、殼高、殼寬(精度為±0.01 mm), 電子天平測量總質(zhì)量(精度為±0.01 g), 比較家系間生長差異; 另外, 在7月齡測定時, 對F1黃殼家系(n=50, 其中5號家系n=47)中黃殼、褐殼個體進(jìn)行區(qū)分, 比較家系內(nèi)不同殼色個體的4個生長性狀。在F1、F2的5月齡時, 對家系所有個體的殼色進(jìn)行統(tǒng)計。

1.4 FRAP法測定黃殼、褐殼貝不同組織的總抗氧化能力(TAC)

根據(jù)鐵離子氧化還原能力(ferric reducing antioxidant power, FRAP) 評價馬氏珠母貝不同組織的抗氧化能力[28], 操作按照試劑盒(碧云天S0116, 中國)說明書進(jìn)行。首先配制FRAP工作液, 并在37℃孵育; 其次取F3代18月齡黃殼、褐殼色成貝各7只, 取鰓、足、心、閉殼肌、外套膜、消化腺、性腺這7個組織樣, 加入500 μL預(yù)冷的PBS溶液并進(jìn)行勻漿處理, 以充分破碎組織并釋放其中的抗氧化物, 4℃下12 000g 離心10 min, 收集上清液, 5倍稀釋后, 用96孔板在酶標(biāo)儀(Tecan infinite 200Pro, 瑞士)上進(jìn)行測定, 每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù); 再次, 所有上清液稀釋5倍后, 用BCA法(生工C503051, 中國)測定各組織中總蛋白含量, 以牛血清白蛋白(BSA, 0.025~1 g/L)作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 在562 nm下測定標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的吸光度值Cp。最后, 另取一個96孔板, 加入上清和FRAP工作液37℃孵育5 min, 以梯度稀釋(0.15~2 mmol/L)的FeSO4·7H2O作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 在593 nm下測定吸光度值Ct。TAC(單位蛋白濃度下鐵離子氧化還原能力)按照以下公式進(jìn)行計算[26,28]:

1.5 數(shù)據(jù)分析

家系的生長指標(biāo)通過SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析和t-檢驗, 殼色分離比采用卡方檢驗, 顯著性水平包括差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

2 實驗結(jié)果

2.1 F1黃殼家系與褐殼色家系的生長性狀比較

F1黃殼家系和對照組褐殼家系的4個生長性狀的均值見表1。第一代黃殼家系(F1)5、7月齡貝僅殼寬值顯著小于褐殼家系 (P<0.05), 殼高、殼長、總質(zhì)量差異不顯著, 11月齡貝僅殼長和殼寬值顯著小于褐殼家系, 14、20月齡貝殼高、殼長、殼寬、總質(zhì)量這4個生長性狀數(shù)值均極顯著小于褐殼家系(P<0.01), 見表1。

2.2 F1黃殼家系中黃殼、褐殼個體的生長性狀比較

7月齡F1黃殼家系內(nèi)黃殼個體和褐殼個體的生長指標(biāo)見表2。經(jīng)統(tǒng)計檢驗, F1代6個黃殼家系內(nèi)黃殼個體與褐殼個體在殼高、殼長、殼寬和總質(zhì)量上差異都不顯著(P>0.05)。

2.3 F1黃殼家系殼色性狀分離情況統(tǒng)計

在這6個F1家系中, 親本之一為黃殼色, 則后代中會出現(xiàn)黃殼色貝, 黃殼貝的比例為42.11%～76.80%, 平均57.63%; 兩個親本為黃殼色, 后代中出現(xiàn)了黃、褐殼色, 即黃殼色性狀發(fā)生了分離(表3)。第一代所有褐殼家系未產(chǎn)生黃殼色子代(數(shù)據(jù)未展示)。1、2、6號家系子代殼色分離實際比例不等于預(yù)測比例, 卡方適合性檢驗統(tǒng)計值P<0.01, 認(rèn)為偏離孟德爾遺傳分離定律, 而3、4、5號家系子代殼色實際比例接近預(yù)測比例, 認(rèn)為符合分離定律。

2.4 F2家系殼色性狀分離情況統(tǒng)計

在F2家系中, 親本均為褐殼色的兩個家系(編號12、20)沒有產(chǎn)生黃殼色的子代, 推測褐殼色為純合子; 親本均為黃殼色的家系(編號1、3、9), 其子代呈現(xiàn)了黃、褐兩種殼色, 即發(fā)生了殼色分離; 親本為黃殼色和褐殼色的家系(編號2、6、14、7、11、15), 其子代也呈現(xiàn)了黃、褐兩種殼色。除3、6、11號F2家系偏離孟德爾遺傳分離定律外(P<0.01), 其他5個家系的殼色遺傳符合孟德爾分離定律(表4)。 黃殼貝的比例為48.54%～98.88%, 平均70.22%。

表1 第一代黃殼家系與褐殼家系4個生長性狀的統(tǒng)計學(xué)分析 Tab. 1 Statistical analysis of the four growth traits between the F1 yellow shell families and brown shell families

表2 F1黃殼家系中黃殼、褐殼色個體的生長統(tǒng)計學(xué)分析 Tab. 2 Statistical analysis of the four growth traits between yellow and brown individuals in the F1 yellow shell families

表3 F1黃殼家系殼色性狀分離情況統(tǒng)計 Tab. 3 Statistical analysis of shell color segregation in the F1 yellow shell families

表4 F2家系殼色性狀分離情況統(tǒng)計 Tab. 4 Statistical analysis of shell color segregation in the F2 families

2.5 黃殼家系內(nèi)黃殼、褐殼個體不同組織的抗氧化能力比較

兩標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出的線性回歸方程見圖3, R2值均不小于0.99。測定不同組織中單位蛋白含量的鐵離子氧化還原能力后發(fā)現(xiàn), 黃色殼馬氏珠母貝在鰓和閉殼肌組織中TAC值較高。在足、心、性腺組織中黃殼貝TAC顯著低于褐殼貝(P<0.05), 在鰓、閉殼肌、消化腺組織中黃殼貝TAC高于褐殼貝, 在外套膜組織中黃殼貝低于褐殼貝, 但差異都不顯著(見圖4)。

3 分析與討論

3.1 馬氏珠母貝黃殼色和褐殼色家系及個體的生長比較分析

馬氏珠母貝殼色與生長的關(guān)聯(lián)分析已有報道, 王慶恒等[18]、鄧岳文等[13]、朱曉聞等[19]發(fā)現(xiàn)黃殼選育系生長性狀均顯著小于褐殼貝。本文中F1代6個黃殼家系, 在5、7月齡貝僅殼寬值顯著小于褐殼家系(P<0.05), 11月齡貝僅殼長和殼寬值顯著偏小, 14、20月齡貝的殼高、殼長、殼寬、總質(zhì)量這4個生長性狀均極顯著偏小(P<0.01), 這一結(jié)果與鄧岳文等[13,18]黃殼選育系F1情況類似。稚貝發(fā)育至成貝過程中, 黃殼家系和褐殼家系的差異也愈加顯著, 可能是黃殼色對貝的生長影響存在累積效應(yīng)。另外, 本文F1代 6個父本半同胞家系內(nèi), 黃殼、褐殼個體生長差異并不顯著, 這一結(jié)果表明在親本相同、且養(yǎng)殖環(huán)境、密度等條件一致的前提下, 黃殼個體具有與褐殼個體近似的生長性能。

馬氏珠母貝中發(fā)現(xiàn)白色貝類[16]具有生活力劣勢, 本文中F1代黃殼家系相比褐殼家系存在生長劣勢, 但親本相同時黃殼貝相比褐殼貝未見生長劣勢, 可能是家系選育剛剛開始, 純化不夠。這一結(jié)果反映黃殼色親本的引入, 會對全部不同殼色子代的生長性狀產(chǎn)生影響, 再次證明黃殼色與生長性狀緊密關(guān)聯(lián)。

圖3 測定組織總蛋白含量繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線 (左), 測定鐵離子總抗氧化活性繪制FeSO4.7H2O標(biāo)準(zhǔn)曲線(右) Fig. 3 BSA standard curve for the determination of total protein content in tissues (left); FeSO4.7H2O standard curve for the determination of ferric ion reducing antioxidant power (right)

圖4 馬氏珠母貝黃殼、褐殼貝不同組織的總抗氧化能力比較 Fig. 4 Comparison of total antioxidant capacity in different tissues of yellow and brown oysters of Pinctada fucata martensii

3.2 馬氏珠母貝黃殼色的遺傳與分離

本文中, 從兩種殼色的正反交殼色分離結(jié)果可認(rèn)為黃殼色不存在伴性遺傳現(xiàn)象。F1和F2中褐×褐家系殼色不分離, 推測褐殼色是隱性純合子; F1代5個褐×黃家系子代均有褐殼個體產(chǎn)生, 推測半同胞家系中的2個黃殼父本都是雜合子。11個F2代家系中, 2個褐×褐家系(編號12、20))殼色不分離, 3個黃×黃家系有1個(編號3)偏離孟德爾遺傳定律, 6個黃×褐(或褐×黃)家系有2個家系(編號6、11)偏離。F2代有5個家系的殼色分離可采用“單位點二等位基因”模型解釋, 即黃殼色與褐殼色由單基因控制, 且黃殼色對褐殼色具有顯性效應(yīng)。

貝類殼色遺傳存在不同的遺傳模式, Ge等[21,29]發(fā)現(xiàn)長牡蠣(Crassostrea gigas)殼色遺傳也遵循“單位點二等位基因”模型, 金黃色作為背景色對白色背景色為顯性。Zheng等[30]研究了華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)橙色、橙紫色、紫色和棕色四種殼色遺傳規(guī)律時, 認(rèn)為其殼色遺傳符合“單位點三等位基因”的遺傳模式, 橙色可以遮蓋其他三種顏色, 橙紫色對棕色和紫色為顯性, 紫色對棕色為顯性。Winkler等[31]研究了智利扇貝(Argopecten purpuratus)的殼色遺傳模式, 認(rèn)為殼背景色由一個基因控制, 而白色放射帶由另一個隱性等位基因控制。Ky等[32-33]認(rèn)為珠母貝(Pinctada margaritifera)的黑殼、紅殼、白殼色符合“單位點三等位基因”遺傳模式, 肉色是不同于殼色的另一性狀。Kozminskii 等[34]發(fā)現(xiàn)單基因遺傳假說不足以解釋濱螺(Littorina obtusata)的殼色遺傳規(guī)律, 提出了“兩位點二等位基因”假說。

本文中F1代和F2代均有3個家系偏離孟德爾遺傳定律, 可能原因是貝的黃殼色是多個性狀綜合作用的結(jié)果, 需要對黃殼色個體進(jìn)一步區(qū)分為黃殼色有/無放射線等類型; 偏離家系還可能與顯性上位作用相關(guān); 家系子代死亡率差異也可能對殼色分離比統(tǒng)計有所影響。對于殼色偏分離需更細(xì)致深入的研究。

3.3 馬氏珠母貝黃殼色和褐殼色個體的總抗氧化能力比較

張博等[25]通過FRAP法測定櫛江珧(Atrina pectinata)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、臺灣日月貝(Amusium japonicum taiwanicum)、菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)中鰓、閉殼肌、外套膜3種組織的TAC差異發(fā)現(xiàn), 這4種貝均為鰓最高、閉殼肌次之、外套膜最低。本文測定了黃殼貝和黑殼貝不同組織中的TAC值, 也是黃殼貝鰓和閉殼肌的TAC值較高, 這與張博等[25]的報道基本吻合。在足、心、性腺組織中黃殼貝TAC顯著低于褐殼貝(P<0.05); 在鰓、閉殼肌、消化腺組織中黃殼貝TAC高于褐殼貝, 在外套膜組織中黃殼貝低于褐殼貝但差異不顯著。Xu等[35]測定了馬氏珠母貝不同組織的總類胡蘿卜素含量(TCC), 鰓、閉殼肌組織中黃殼貝TCC和TAC含量均高于褐殼貝, 但足和性腺中TCC和TAC的趨勢相反, 推測可能是TAC不僅與總類胡蘿卜素相關(guān), 還可能與抗氧化酶、自由基、脂質(zhì)等因素相關(guān)。