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        基于碳點的適配體熒光傳感器檢測農(nóng)藥樂果

        2020-02-06 03:48:57陸婷婷王金龍詹相強吳遠根
        分析化學 2020年1期

        陸婷婷 王金龍 詹相強 吳遠根

        摘 要 構(gòu)建了一種基于核酸適配體調(diào)控碳點熒光強度的農(nóng)藥樂果適配體熒光傳感器。在樂果存在下,適配體SS24-S-35可改變納米銀(AgNPs)對檸檬酸-乙二胺碳點熒光的猝滅作用,且碳點的熒光猝滅程度與樂果濃度成正比,由此建立了一種樂果的適配體熒光檢測方法。對熒光猝滅機制進行了探討,對碳點種類、AgNPs濃度等影響因素進行了考察。在最優(yōu)條件下,檢測樂果的線性范圍為6~200 μg/L (R2=0.984),檢出限為2.24 μg/L (3σ/S)。此傳感器特異性良好,其它農(nóng)藥對樂果的檢測無明顯干擾。將此適配體熒光傳感器應用于實際農(nóng)產(chǎn)品中樂果農(nóng)藥檢測,回收率為85.1%~105.0%,表明在農(nóng)藥殘留檢測中具有潛在應用價值。

        關(guān)鍵詞 農(nóng)藥檢測; 適配體; 納米銀; 碳點; 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

        1 引 言

        樂果(Dimethoate) 是應用較為廣泛的有機磷農(nóng)藥之一,其快速殺蟲殺螨效果良好,多應用于果蔬、棉花等作物。 在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時,樂果本身及其殘留也會對環(huán)境造成污染,威脅人類的健康。樂果可通過皮膚接觸等途徑進入人體,造成急性或慢性中毒,嚴重時可致人死亡[1]。因此,研究高效靈敏的樂果農(nóng)藥殘留檢測方法具有重要意義。傳統(tǒng)的樂果檢測方法,如氣相色譜[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[3]等方法雖靈敏度高、結(jié)果可靠,但多需借助大型儀器和專業(yè)技術(shù)人員,而且預處理過程繁瑣,不適用于現(xiàn)場快速檢測。而比色法[4]、紅外光譜法[5]等樂果快速檢測方法相對簡單方便,但檢測結(jié)果易受環(huán)境因素影響。

        與傳統(tǒng)方法和比色法等相比,熒光檢測法具有背景信號低、靈敏度高、操作簡單等特點[6],近年來受到研究者的關(guān)注。傳統(tǒng)熒光檢測方法一般采用對某些物質(zhì)具有特異性識別的熒光染料分子[7]或量子點材料[8]作為熒光元件。熒光染料分子多為有機分子,光穩(wěn)定性較差且合成較難。量子點是一類具有良好光穩(wěn)定性的金屬半導體納米晶體,但多數(shù)量子點含有重金屬,其生物毒性限制了其應用與發(fā)展[7,8]。研究者致力于開發(fā)具有更穩(wěn)定光學特性及低毒的物質(zhì)作為熒光探針。熒光碳量子點又稱碳點(Carbon dots) [9],具有獨特的發(fā)光性能、良好的生物相容性、化學穩(wěn)定性、低毒性、易合成等特點,近年來廣泛用于生物成像、免疫分析、小分子檢測與分析等研究中[10]。利用碳點建立的熒光傳感器具有快速靈敏等優(yōu)點,但仍易受其它物質(zhì)的干擾[11]。

        為了克服這些問題,研究者將具有高特異性識別的核酸適配體(Aptamer)引入熒光檢測方法中,使其具有更高的靈敏度和更好的特異性。核酸適配體是一類能特異性識別靶物質(zhì)的功能性單鏈DNA或者RNA[12],具有化學穩(wěn)定性好且易修飾等優(yōu)點,可作為識別元件應用于多個檢測領(lǐng)域[13,14]。最近,本研究組利用核酸適配體對靶物質(zhì)良好的識別性能,并結(jié)合碳點優(yōu)異的熒光特性,構(gòu)建了高效快速檢測食品中啶蟲脒農(nóng)藥殘留的適配體熒光傳感器[15]。然而,目前還未有利用適配體碳點熒光傳感器檢測樂果農(nóng)藥的報道。分散狀態(tài)的納米銀(Silver nanoparticles, AgNPs)具有良好的消光能力[16],可通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)效應顯著猝滅檸檬酸-乙二胺碳點的熒光信號。本研究以核酸適配體SS24-S-35序列為樂果農(nóng)藥的識別分子,結(jié)合熒光碳點, 通過樂果農(nóng)藥與適配體的相互作用,調(diào)控AgNPs對碳點熒光的猝滅性能,在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建可特異性檢測樂果的適配體熒光傳感器,并對其檢測性能和實際應用性能進行了評價。

        2 實驗部分

        2.1 儀器與試劑

        F-4600型熒光分光光度計、透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司); UV-2700型紫外分光光度計(日本Shimadzu公司); 振蕩型恒溫金屬?。ㄉ虾R缓憧萍加邢薰荆?。

        有機磷農(nóng)藥核酸適配體(SS24-S-35)[17]序列為: 5'-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAG AGCT-3',由上海生工生物工程股份有限公司合成與純化; AgNO3、NaBH4、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙二胺(EDA)、 H3PO4、 碳二亞胺(EDC)、甲酰胺、樂果、丙溴磷等購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 其它試劑均為市售分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

        2.2 碳點的制備

        根據(jù)文獻報道,采用水熱合成法制備了3種熒光碳點。

        檸檬酸-乙二胺碳點(CD-1)的制備[15]: 將1.26 g檸檬酸和1608 μl EDA加入30 mL雙蒸水中,轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中,180℃反應5 h。所得產(chǎn)物用截留分子量為300 Da的透析袋透析純化, 4℃下保存。

        檸檬酸-磷酸碳點(CD-2)的制備[18]: 稱取1.5 g檸檬酸溶于10 mL水中,加入10 mL H3PO4、1 mL EDA、0.01 mg EDC,混合均勻后轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中,于250℃反應2 h。所得產(chǎn)物于11200 r/min下離心10 min,沉淀溶于乙醇中,再重復離心3次,所得產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后分散于水中,于4℃保存。

        檸檬酸-甲酰胺碳點(CD-3)的制備: 將0.6 g檸檬酸和2 mL甲酰胺加入18 mL水中,轉(zhuǎn)移至反應釜中,于190℃反應3 h。所得產(chǎn)物用截留分子量為300 Da的透析袋透析純化, 4℃下保存。

        2.3 納米銀制備[19]

        將5 mL AgNO3 (10 mmol/L)和5 mL檸檬酸鈉(10 mmol/L)加入89 mL水中反應20 min,在磁力攪拌條件下快速加入8.8 mg NaBH4,繼續(xù)攪拌反應2 h,得到穩(wěn)定的黃色AgNPs溶膠溶液。于4℃保存。

        2.4 樂果的檢測

        首先將SS24-S-35序列 (3 μmol/L)置于振蕩型恒溫金屬浴中,在95℃、800 r/min條件下變性5 min。取5 μL SS24-S-35序列與5 μL不同濃度的樂果混合均勻,于30℃孵育10 min。 加入150 μL AgNPs (1.27 nmol/L),繼續(xù)于30℃條件下反應10 min。最后加入5 μL CD-1 (0.5 mg/mL)、25 μL NaCl (300 mmol/L),再加水定容至500 μL, 30℃下反應30 min。使用1 cm石英熒光比色皿,設置激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為10 nm,激發(fā)波長為360 nm,發(fā)射波長為440 nm,測定樣品的熒光光譜。再以水代替樂果作為空白對照,并測定其熒光強度(F0)。計算空白體系(F0)與樣品檢測體系(F)在440 nm處的熒光強度差值(F0-F)。

        2.5 實際樣品分析方法

        小麥、蘋果、辣椒、西紅柿等農(nóng)產(chǎn)品均為市售商品,按文獻[20\]的方法進行預處理。取不同濃度的樂果標準品均勻噴涂在徹底清洗干凈的樣品表面,自然風干。取20 g樣品加入100 mL 20%甲醇中,靜置萃取30 min,然后用0.22 μm濾膜過濾,得到最終樣品處理液。將所得樣品處理液加入檢測體系中,采用本方法進行檢測。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 碳點的表征

        本研究制備了3種碳點,并進行了表征。以CD-1為例,由透射電鏡圖(圖1A)可知,CD-1為均勻球形結(jié)構(gòu),具有良好的分散性,平均粒徑約為10 nm (圖1B),與文獻[15\]一致。CD-1的紫外-可見(UV)吸收光譜和熒光(FL)光譜如圖1C所示。在日光燈照射下,碳點的水溶液呈淡黃色,而在紫外燈的照射下發(fā)出強烈的藍色熒光。碳點CD-1在340 nm處有強烈的紫外吸收峰,這可能與n-π*(CO)躍遷有關(guān)[15,21]。此碳點的最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為360和440 nm,Stokes位移較大(80 nm),表明此碳點能發(fā)射強烈而穩(wěn)定的熒光[22]。由圖1D可知,CD-1的最大發(fā)射波長不隨激發(fā)波長的移動而發(fā)生變化,說明此碳點的熒光發(fā)射波長無激發(fā)光依賴性,其發(fā)光機理是基于表面缺陷, 而不是基于尺寸依賴的帶隙躍遷[21]。根據(jù)本研究組之前的研究結(jié)果[15],CD-1表面帶有NH2、OH、COOH,這賦予了CD-1良好的熒光性能和親水性能[21,23]。

        3.2 實驗原理與驗證

        AgNPs溶膠體系猝滅碳點熒光性能與其分散形態(tài)有關(guān),不同粒徑AgNPs的最大紫外吸收波長不同[16]。由圖1C可知,制備的AgNPs溶膠在320~500 nm范圍內(nèi)有很強的吸收,最大吸收峰位于390 nm處,與CD-1的熒光發(fā)射光譜部分重疊。CD-1表面含有大量的NH2, 能與AgNPs表面的COOH產(chǎn)生靜電作用,從而拉近二者的距離[24]。因此,AgNPs可能通過FRET作用猝滅CD-1的熒光信號[25]。AgNPs表面覆蓋有檸檬酸,其顆粒之間可通過負電荷羧基的靜電排斥作用,保持AgNPs溶膠的穩(wěn)定存在[19]。如果向溶膠體系中加入高濃度NaCl,可通過靜電屏蔽作用破壞AgNPs的穩(wěn)定性,使其產(chǎn)生凝聚 [26],導致AgNPs在390 nm處吸收峰降低,甚至消失,而聚集的AgNPs無法猝滅CD-1熒光信號。

        本研究通過核酸適配體調(diào)控AgNPs在高濃度鹽溶液中的分散形態(tài),實現(xiàn)碳點熒光信號的可控猝滅,在此基礎(chǔ)上建立用于樂果檢測的適配體熒光傳感器,檢測原理如圖2A所示。適配體SS24-S-35序列由于與AgNPs相互作用較弱[27],因而在高濃度NaCl條件下,AgNPs會產(chǎn)生聚集現(xiàn)象,無法再猝滅后續(xù)加入的碳點熒光,此時體系在440 nm處展現(xiàn)藍色熒光。當向檢測體系中加入樂果時,適配體SS24-S-35序列能特異性結(jié)合樂果農(nóng)藥[28],而樂果分子中OCN鍵的O和N可提供孤電子對,與AgNPs表面的Ag原子形成配位鍵[29],從而進一步增強AgNPs表面的電負性,使其在高濃度NaCl體系中可穩(wěn)定存在。此時,分散狀態(tài)的AgNPs可通過FRET猝滅碳點熒光信號。

        通過測定碳點溶液加入樂果、適配體、NaCl前后的熒光光譜,進一步考察適配體熒光傳感器檢測樂果的可行性。由圖2B可知,純CD-1溶液發(fā)出明亮的藍色熒光,在440 nm處有強的熒光發(fā)射峰。當加入AgNPs時,CD-1熒光信號被顯著猝滅(圖2B-b),說明AgNPs能有效猝滅碳點熒光。當AgNPs先后與適配體和NaCl孵育一定時間,再加入碳點,此時碳點溶液仍然發(fā)出很強的藍色熒光(圖2B-c)。這可能是核酸適配體與AgNPs之間的相互作用力較弱[27],加入高濃度NaCl后,導致AgNPs聚集,而聚集的AgNPs無法再猝滅碳點熒光。當AgNPs先后與樂果和NaCl孵育一定時間,此時碳點溶液依然發(fā)出很強的藍色熒光(圖2B-d)。推測其原因可能是樂果不會改變AgNPs表面的電負性,說明樂果本身不會干擾NaCl對AgNPs的聚集及其對碳點的作用。當向檢測體系加入樂果后,碳點熒光被逐漸猝滅(圖2B-e~g),且其猝滅程度與樂果農(nóng)藥的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。上述結(jié)果說明,樂果可與適配體和AgNPs形成復合物,使AgNPs表面的負電荷增加[27],因而后續(xù)加入高濃度NaCl后,AgNPs仍會保持分散狀態(tài),可有效猝滅傳感體系中碳點的熒光。

        3.3 實驗參數(shù)的優(yōu)化

        3.3.1 不同碳點體系對樂果檢測的影響 碳點作為適配體熒光傳感器的熒光信號元件,其熒光特性與其尺寸和表面性質(zhì)有關(guān)[21]。為了考察不同熒光碳點材料對樂果檢測的影響,本實驗制備了3種碳點熒光材料,進一步評價其在加入AgNPs和適配體前后的熒光信號,結(jié)果如圖3A所示。所制備的3種碳點表面都摻雜了豐富的N元素,可賦予其良好的熒光性能[15,18,30]。加入AgNPs后,CD-1和CD-3的熒光被顯著猝滅,熒光猝滅率分別達到68%和70%,而CD-2的熒光猝滅效果不明顯。這是因為CD-1的最大激發(fā)波長為360 nm[15],與分散狀態(tài)AgNPs的最大吸收峰(390 nm)[19]波長相差較小,兩者之間的FRET效應較強,所以CD-1的熒光被顯著猝滅。而CD-2的最大熒光激發(fā)波長(340 nm)[18]與分散狀態(tài)AgNPs的最大紫外吸收波長相距較遠,二者之間無法發(fā)生有效的FRET效應,因此AgNPs對CD-2的熒光猝滅效果不明顯。導致CD-3的熒光被猝滅的原因可能是AgNPs表面的Ag+與CD-3發(fā)生不可逆的靜態(tài)猝滅作用[21,31]。當AgNPs與適配體作用后,在高濃度NaCl存在條件下,只有CD-1的熒光明顯增強。當向傳感溶液中加入農(nóng)藥樂果,此時CD-1的熒光又被顯著猝滅,而CD-2和CD-3的熒光無明顯變化,表明CD-2和CD-3無法構(gòu)建適配體熒光傳感體系。因此,本實驗選用CD-1作為檢測樂果的適配體熒光傳感器的信號元件。

        3.3.2 AgNPs濃度對樂果檢測的影響 考察了AgNPs濃度對樂果檢測的影響,結(jié)果如圖3B所示。隨AgNPs濃度增加,傳感體系的熒光信號變化逐漸增大。當AgNPs濃度為0.38 nmol/L時,體系的熒光淬滅(F0-F)達到最大。當AgNPs濃度過高時, NaCl只能誘導部分AgNPs聚集,導致空白實驗組的碳點熒光信號過低。因此,后續(xù)實驗選取熒光猝滅劑AgNPs濃度為0.38 nmol/L。

        3.3.3 NaCl濃度對樂果檢測的影響 本傳感體系中,NaCl通過調(diào)控AgNPs的分散狀態(tài)影響碳點的熒光強度??疾炝薔aCl濃度對樂果檢測的影響,結(jié)果如圖3C所示。適配體熒光傳感器的(F0-F)值隨NaCl濃度的增加而增大,在15 mmol/L時達到最大值。因此,本研究選取NaCl濃度為15 mmol/L。

        3.3.4 核酸適配體濃度對樂果檢測的影響 適配體SS24-S-35序列可調(diào)控AgNPs表面的電荷密度,從而影響其在高濃度NaCl中的分散狀態(tài)??疾炝诉m配體濃度對樂果檢測的影響,結(jié)果見圖3D。傳感體系的(F0-F)值與適配體濃度成正相關(guān),適配體濃度大于30 nmol/L時,(F0-F)值趨于穩(wěn)定。因此,選擇本傳感體系中適配體的最佳濃度為30 nmol/L。

        3.4 方法的分析性能

        在優(yōu)化的條件下,向適配體熒光傳感器中加入不同濃度的樂果(6~650 μg/L),測定其熒光光譜。從圖4A可知,隨著樂果濃度的增加,傳感體系的熒光逐漸被猝滅。當樂果濃度大于40 μg/L時,其與空白實驗組的熒光強度有顯著差異,因而本方法裸眼檢測的最低濃度為40 μg/L。圖4B的熒光光譜顯示,隨樂果濃度增加,傳感體系中的熒光強度逐漸降低。由圖4C可知,傳感體系的(F0-F)值隨著樂果濃度的增加而不斷增大。傳感體系(F0-F)值與樂果濃度在6~200 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性方程為Y= 2.027X + 0.558 (R2=0.984),檢出限為2.24 μg/L(3σ/S)[32~34],此值遠低于中國農(nóng)業(yè)部制定的農(nóng)產(chǎn)品中樂果殘留最大限量標準(50 μg/L) [35]。將此方法與現(xiàn)有的樂果農(nóng)藥快速檢測方法進行了對比(表1)。電化學法有較高的檢測靈敏度,但其需要修飾電極以及專業(yè)的操作儀器; 比色檢測法大多用生物酶作為傳感元件,對周圍環(huán)境較敏感, 容易導致檢測結(jié)果不準確。而現(xiàn)有的熒光檢測方法多利用重金屬量子點作為傳感元件,易造成二次環(huán)境污染。本傳感體系采用環(huán)境友好且易制備的熒光碳點作為傳感元件,利用特異性高的適配體作為農(nóng)藥識別分子,所建立的檢測方法具有快速、靈敏、綠色環(huán)保、低成本等優(yōu)點。

        考察了本方法檢測樂果的特異性。如圖5所示,向熒光檢測體系中加入相同濃度(200 μg/L)的不同種類農(nóng)藥,只有樂果農(nóng)藥樣品組的熒光被顯著猝滅。當向傳感體系中同時加入樂果和其它農(nóng)藥時,其對應傳感體系的(F0-F)值和同濃度的樂果樣品組無明顯差異,說明其它農(nóng)藥的存在對傳感體系檢測樂果無明顯干擾。值得注意的是,氧化樂果的化學結(jié)構(gòu)與樂果農(nóng)藥相似,且適配體SS24-S-35序列也能識別氧化樂果[17],但傳感體系加入氧化樂果后的熒光強度并沒有發(fā)生較為明顯的變化。推測其原因是氧化樂果分子在AgNPs表面的吸附過程緩慢,且會受到傳感體系中Cl空間位阻的影響,導致其很難吸附到AgNPs表面[44\] 。所以當向傳感體系中加入氧化樂果時,傳感體系的熒光無法被猝滅。

        3.5 實際樣品分析

        取本地市售的小麥、蘋果、辣椒、西紅柿樣品,按2.5節(jié)的方法處理,用建立的適配體熒光傳感體系進行檢測,結(jié)果見表2。樂果的加標回收率在85.1%~105.0%之間,相對標準偏差(RSD)在1.1%~90%之間,表明此傳感方法可應用于實際農(nóng)產(chǎn)品中的樂果農(nóng)藥檢測。

        4 結(jié) 論

        利用AgNPs與檸檬酸-乙二胺碳點之間的FRET效應,結(jié)合核酸適配體特異性識別樂果的特性,建立了一種適用于樂果農(nóng)藥檢測的適配體熒光傳感器。此適配體熒光傳感器對樂果具有高選擇性,可實現(xiàn)對樂果農(nóng)藥的高靈敏度定量檢測和可視化定性檢測, 對樂果的檢出限為2.24 μg/L,裸眼檢出限為40 μg/L。將此適配體熒光傳感器用于實際樣品中樂果的檢測,加標回收率為85.1%~105.0%。與傳統(tǒng)的熒光適配體傳感器相比,此傳感器成本低、制作簡單、靈敏度高,對食品中樂果農(nóng)藥的檢測具有潛在的應用價值。

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        Abstract A fluorescent aptasensor for detection of dimethoate pesticide based on aptamer regulated carbon dots was fabricated. In the presence of dimethoate, SS24-S-35 aptamer could alter the quenching efficiency of silver nanoparticles (AgNPs) on the fluorescence of carbon dots prepared from ethylenediamine and citric acid, and the degree of fluorescence quenching was proportional to the concentration of dimethoate molecules. Therefore, this strategy used the proposed aptasensor to quantitatively detect dimethoate pesticide by fluorescent assay. To improve the detection performance of the as-prepared aptasensor, the fluorescence quenching mechanism of AgNPs on carbon dots was fully discussed, and some parameters such as the types of carbon dots and the amount of AgNPs were investigated. Under optimal conditions, the aptasensor could detect dimethoate in a linear range from 6 μg/L to 200 μg/L (R2=0.984), with a limit of detection (LOD) as low as 2.24 μg/L (3σ/S). Moreover, the further studies confirmed that other pesticides had negligible effect on detection of dimethoate, indicating the excellent specificity of aptasensor for dimethoate detection. The aptasensor was succesfully used in detection of dimethoate pesticide in real agriculture products with recovery of 85.1%-105.0%, which indicated that the proposed aptasensor had potential application in the detection of pesticide residues.

        Keywords Pesticides detection; Aptamer; Silver nanoparticles; Carbon dots; Fluorescence resonance energy transfer

        (Received 25 July 2019; accepted 15 November 2019)

        This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.21565009, 31760486), the Natural Science Foundation of Guizhou Province (No. [2016\]1403), the Science and Technology Support Program of Guizhou Province for Social Development (No. [2018\]2795), and the Foundation of Key Laboratory of Wuliangye-flavor Liquor Solid-state Fermentation (No. 2018JJ002), China National Light Industry.

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