陳蜜　岳仁葉　李智　王剛林　馬楠

摘 要 MicroRNA（miRNA）的檢測在癌癥診斷和治療中具有重要意義。本研究設(shè)計了DNA序列，組裝了3組金納米粒子-量子點復合物， 基于此疊加構(gòu)建了以熵驅(qū)動催化循環(huán)為模型的單重、雙重和多重循環(huán)放大的3種納米傳感器。疊加的傳感器中，上層復合物催化循環(huán)解組裝輸出的產(chǎn)物作為下層復合物的催化鏈，引發(fā)其解組裝，釋放更多熒光信號，實現(xiàn)了多重放大。傳感器中每疊加一個核酸催化循環(huán)體系，檢測限降低一個數(shù)量級，最終構(gòu)建的傳感器的檢測限達到fmol/L級。本研究通過串聯(lián)熵驅(qū)動的核酸催化循環(huán)體系，構(gòu)建了動態(tài)可調(diào)的、可定量檢測細胞中不同表達水平miRNA的新型納米傳感器。

關(guān)鍵詞 miRNA; 金納米粒子; 量子點; 核酸循環(huán); 熒光檢測

1 引 言

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性的小尺寸的非編碼RNA分子，長度約為18～25個核苷酸[1～4]。miRNA主要通過與靶基因mRNA配對引導沉默復合體，降解mRNA或阻礙mRNA的翻譯[5]。miRNA不僅在生物調(diào)節(jié)途徑中起重要作用[6]，也參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等病理過程[7]。miRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，被認為是診斷癌癥的重要生物標志物[8～12]。然而，miRNA序列的高度同源性、尺寸小以及在生物體內(nèi)含量低等特點[13]，使癌細胞中miRNA的精準、靈敏檢測極具挑戰(zhàn)性。在過去的十幾年中，研究者開發(fā)了很多技術(shù)以提高檢測miRNA的靈敏度[14～17]，如定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)能靈敏地定量檢測低表達的miRNA[17，18]，但該方法的儀器設(shè)備昂貴且耗時長。

近年來，作為一種有效的信號放大策略，核酸循環(huán)為檢測低濃度目標物提供了一個重要的技術(shù)平臺[19，20]。Yin等[21]采用雙鏈特異性核酸酶剪切與miRNA雜交的分子信標放大熒光信號，但核酸酶并不能普遍適用于復雜的生物環(huán)境體內(nèi); Wu等[22]利用兩個發(fā)夾DNA間循環(huán)催化反應(yīng)檢測細胞內(nèi)低表達的mRNA，一個靶目標分子經(jīng)過發(fā)夾DNA循環(huán)反應(yīng)后，輸出多個熒光信號，但熒光染料光學性能的局限性影響了方法靈敏度。

金納米粒子（GNP）具有比表面積大、生物相容性好和毒性低等特性，可作為載體將核酸運輸至細胞內(nèi)[23，24]，并且對熒光基團有很好的淬滅能力[25]。與傳統(tǒng)的熒光染料相比， 量子點（Quantum dots， QDs）具有發(fā)射波長可調(diào)節(jié)、量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像領(lǐng)域[26～29]。 Ma等[30]以DNA為模板一步合成生物功能化的水相碲化鎘量子點（CdTe QDs），簡化了QDs生物功能化的步驟，為構(gòu)建基于QDs的納米傳感器提供了參考。 Ma等[31]報導了以熵驅(qū)動核酸催化循環(huán)[32]為模型構(gòu)建的GNP和QDs組裝的納米傳感器，檢測細胞內(nèi)miRNA，檢出限達到pmol/L級。盡管對于提高檢測miRNA靈敏度的研究取得了一些進展[33，34]，但不同癌細胞中miRNA表達水平差異顯著，常規(guī)傳感器的檢測限和線性檢測區(qū)間限制了其在定量分析miRNA中的實際應(yīng)用。

本研究通過合理設(shè)計DNA序列，組裝了3組金納米粒子-碲化鎘量子點復合物（GNP-QDs composite， GQC），并依次疊加構(gòu)建了以熵驅(qū)動催化循環(huán)為模型的單重、雙重和多重循環(huán)放大的3種納米傳感器。疊加的傳感器中，上層GQC催化循環(huán)解組裝輸出的產(chǎn)物作為下層GQC的催化鏈，引發(fā)其解組裝，釋放更多熒光信號，實現(xiàn)QDs熒光信號的多重放大。通過疊加多個催化循環(huán)體系[35]調(diào)控傳感器的線性檢測區(qū)間，降低檢測限，用于定量檢測不同細胞內(nèi)不同表達水平的miRNA。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

FE20K酸度計（美國Mettler Toledo公司）; AvaSpec-ULS2048-USB2 熒光光譜儀（荷蘭Avantes公司）;? Tecnai G2 F20 S-Twin透射電鏡 （美國FEI公司）;? Agilent 8453 紫外-可見分光光度計（美國 Agilent 公司）; GelDoc-It 310 UVP 凝膠成像儀（美國 UVP 公司）; Mini-PROTEAN Tetra 垂直電泳裝置（美國 Bio-Rad 公司）; DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀（北京六一儀器廠）; Infinite M200 PRO多功能酶標儀（美國TECAN公司）; Nano ZS90 激光粒度儀（英國 Malvern 公司）; Olympus IX71 倒置熒光顯微鏡（日本 Olympus公司）。

氯化鎘（CdCl2， 99.99%）、谷胱甘肽（GSH， 98%）、碲粉（Te， 99.99%）、硼氫化鈉（NaBH4， 98%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O， 99.9%）均購自Sigma-Aldrich公司; 瓊脂糖（Agrose，99%）購自Biowest公司; 檸檬酸鈉（99%）購自百靈威公司; 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、過硫酸銨（APS）、MgCl2、NaCl、NaOH、乙酸（HAc）、HNO3、無水甲醇（CH3OH）均至少為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司;? HCl購自強盛功能公司; 聚丙烯酰胺（40%）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED，98%）、甘油（99.0%）購自北京索萊寶公司; 二硫蘇糖醇（DTT， 99%）、6-巰基-1-己醇（MCH， 98.0%）購自阿拉丁試劑公司; 三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP，98.0%）購自TCI公司; HeLa細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心; 22Rv1細胞系購自上海生物科學研究院細胞資源中心; DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、1×PBS緩沖溶液、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Hyclone公司; miRcute miRNA分離試劑盒購自Tiangen Biotech公司。巰基修飾（Thiolated）DNA購自Takara公司; 熒光染料修飾的DNA購自上海生工生物工程有限公司;硫代DNA以及其它未修飾DNA（序列見表1）購自IDT公司。實驗用水為超純水（Milli-Q Direct8 超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 以硫代DNA為模板一步合成CdTe QDs

按文獻＼[30＼]的方法，用Te和NaBH4制備Te離子的前驅(qū)液; 以GSH為配體，與CdCl2配制Cd離子前驅(qū)液，與硫代DNA混合后加入Te離子前驅(qū)液， 混勻后在100℃下反應(yīng)，可一步合成DNA4修飾CdTe QDs（Q1）、DNA5修飾CdTe QDs（Q2）和DNA6修飾CdTe QDs（Q3）。用30 kD離心超濾管離心超濾（12500 r/min， 3 min）兩次，重新分散于水中。根據(jù)文獻＼[36＼]方法計算濃度。

2.2.2 GNP的合成以及表面DNA的修飾 采用檸檬酸還原法合成約13 nm的GNP[32]，用 0.22 μm微孔濾膜過濾，紫外可見分光光度計測定520 nm處吸光度， 并計算GNP的濃度（摩爾吸光系數(shù)為2.7×108 L/（cm·mol）。? 在巰基DNA1、 DNA2和DNA3中加入TCEP， 孵育2 h， 將GNP和巰基DNA按1∶80的摩爾比例混合，37℃恒溫搖蕩1 h后離心，加入檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液（pH 3），搖蕩1 h，12500 r/min離心7 min，分散在1×PBS中，得到GNP -DNA1（G1）、GNP-DNA2（G2）和GNP -DNA3（G3）。

2.2.3 GQC的組裝 將G1與L1按摩爾比1∶60混合，加入NaCl（終濃度50 mmol/L）和MgCl2（終濃度2.5 mmol/L），于37℃反應(yīng)過夜，12000 r/min離心6 min，分散在1×PBS緩沖液中。將組裝好的G1-L1與Q1按照GNP與QDs摩爾比為1∶60混合，加入NaCl（終濃度50 mmol/L）和MgCl2（終濃度2.5 mmol/L） 37℃反應(yīng)3 h，緩慢降至室溫。12000 r/min離心7 min，分散于1×PBS緩沖液中，得到復合物GNP-QDs1（GQC1）。按同樣步驟，分別通過L2和L3將G2和Q2、G3和Q3組裝成GQC2和GQC3。

2.2.4 GNP修飾DNA數(shù)量的測定 將序列與DNA1一致的FAM-DNA1按照2.2.2節(jié)的步驟修飾在GNP表面，取100 μL FAM-DNA1-GNP（36.5 nmol/L）與80 μL DTT（10 mmol/L）混合，振蕩12 h，14000 r/min離心5 min，收集上清液，酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長520 nm。酶標儀測定濃度分別為10、20、30、40和50 nmol/L 的FAM-DNA1熒光強度，繪制標準曲線，通過標準曲線計算GNP表面連接的FAM-DNA1的濃度，與GNP濃度的比值即為GNP表面修飾DNA1的數(shù)量。GNP表面修飾的DNA2和DNA3的數(shù)量按照以上方法測定。

將與L1序列一致的FAM-L1與G1按照2.2.3節(jié)組裝，測定GNP連接的L1條數(shù)。采用同樣方法測定和計算GNP表面連接的L2和L3的數(shù)量。

2.2.5 納米復合物特異性測試

用1×PBS緩沖液配制一系列含5 nmol/L GNP 的GQC1溶液，并與 F1（終濃度60 nmol/L）混合，加入miR-21（終濃度為100、10、2、1、0.2、0.1和 0 nmol/L）; 對照組（C' control）的GQC1中加入終濃度為100 nmol/L miR-141和 60 nmol/L F1， 37℃反應(yīng)6 h，12000 r/min離心3 min，取上清液測熒光信號。

2.2.6 納米傳感器的構(gòu)建和循環(huán)檢測DNA 由GNP濃度為5 nmol/L GQC1構(gòu)建傳感器C1;? 由GNP濃度均為5 nmol/L GQC1和GQC2混合（即串聯(lián)），構(gòu)建傳感器C2; 由GNP濃度分別為5、5和10 nmol/L的 GQC1、GQC2和GQC3混合，構(gòu)建傳感器C3。

在3組傳感器C1、C2和C3中加入對應(yīng)的fuel DNA（終濃度分別是60 nmol/L F1; 60 nmol/L F1和60 nmol/L F2; 60 nmol/L F1、60 nmol/L F2和120 nmol/L F3），加入靶分子C'至終濃度分別是100、10、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001和0 nmol/L，在37℃分別反應(yīng)6、8和12 h。離心，測定上清液熒光信號，下層沉淀用1×PBS緩沖液分散后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.7 固定細胞成像 在48孔板中接種HeLa細胞和22Rv1細胞，每孔細胞數(shù)約2×104個，在細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，細胞用甲醇固定，加入傳感器C1、C2和C3以及相應(yīng)的Fuel DNA，培養(yǎng)箱中37℃孵育6、8和12 h，用1×PBS緩沖液清洗細胞，采用熒光倒置顯微鏡成像。

2.2.8 提取RNA定量檢測miRNA 在細胞培養(yǎng)瓶中分別接種HeLa細胞和22Rv1細胞，待2種細胞長滿培養(yǎng)瓶后，采用試劑盒提取細胞的總RNA，測量總RNA在260 nm處的吸光度（1 OD=40 ng/μL RNA）。將提取的RNA稀釋，與相應(yīng)FuelDNA混合后加入對應(yīng)的傳感器中，測定熒光光譜，計算熒光恢復率，并根據(jù)線性曲線計算miR-141在兩種細胞中的表達量。

3 結(jié)果與討論

3.1 QDs和GNP組裝和表征

DNA功能化CdTe QDs的吸收光譜和熒光譜如圖1A所示， QDs的最大吸收峰位于571 nm（曲線a），最大發(fā)射波長為627 nm（曲線b）， 計算QDs的量子產(chǎn)率為17.6%[32]。采用透射電鏡和高分辨透射電鏡對QDs進行表征（圖1B）， QDs直徑為（3.43±0.18） nm。QDs進行凝膠電泳圖譜見圖1C，QDs表面大多修飾了一條DNA鏈。

GNP電鏡表征圖如圖2A所示，其直徑為（15.48±0.23） nm。使用DTT法測得每個GNP表面修飾了36條巰基DNA和20條Linker DNA。瓊脂糖電泳表征圖（圖2B）和電鏡表征圖（圖2C）都表明GNP和QDs形成了組裝體，且每個GNP表面組裝了約12個QDs[32]。

3.2 串聯(lián)傳感器的構(gòu)建以及可行性驗證

本研究以熵驅(qū)動核酸催化循環(huán)為模型構(gòu)建納米傳感器，實現(xiàn)檢測信號的放大。在傳感器C1中，Q1通過L1與G1組裝成GQC1，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，Q1的熒光被G1猝滅，miR-141作為GQC1的靶分子，進攻作用位點Toehold 1，將G1取代，由于G1與Q1距離增大，不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，Q1的熒光信號恢復。同時，作用位點Toehold 2暴露，F(xiàn)1與之結(jié)合，將Q1從組裝中取代出來，同時又置換出miR-141，miR-141繼續(xù)進攻下一個作用位點Toehold 1，釋放Q1，如此循環(huán)下去，一個靶目標循環(huán)解組裝GQC1輸出多個Q1熒光信號（圖3A）。將GQC1和GQC2按1∶1比例疊加構(gòu)建傳感器C2，miR-141作為靶向物催化解組裝GQC1中置換出的Q1作為GQC2的催化鏈，與F2通過Toehold 3和Toehold 4兩作用位點，按照上述循環(huán)方式繼續(xù)催化解組裝GQC2，釋放Q2。如此，在傳感器C2中輸入一個靶目標分子，能夠輸出多個Q1和Q2的熒光信號;? 將GQC1、GQC2和GQC3按1∶1∶2比例疊加構(gòu)建傳感器C3，GQC2中被Q1催化解組裝輸出的Q2又作為GQC3的催化鏈，與F3通過Toehold 5和Toehold 6兩作用位點催化解組裝GQC3，釋放Q3，如此，在傳感器C3中，輸入一個靶目標能夠輸出多個Q1、Q2和Q3的熒光信號（圖3B），檢測靶目標miR-141對應(yīng)的熒光信號，得到多重放大。

采用凝膠電泳表征單鏈DNA間雜交、鏈取代反應(yīng)，以驗證該實驗設(shè)計的可行性。如圖4所示，泳道g對應(yīng)在GQC2的單鏈組裝體加入對應(yīng)的催化鏈（DNA4）和F2后解組裝的條帶;? 泳道h對應(yīng)將GQC1和GQC2的單鏈組裝體1∶1串聯(lián)，只加入了GQC1的靶目標（0.05×C'）和F1和F2的情況; 泳道h中同樣也出現(xiàn)了GQC2單鏈組裝體解組裝的條帶， 并且條帶的熒光強度比泳道g中的條帶的熒光強度高，表明將核酸循環(huán)串聯(lián)可實現(xiàn)信號的多重放大。

考察了GQC1對miR-141的特異性響應(yīng)。將miR-21按照與L1（100 nmol/L）摩爾比分別為1、0.1、0.02、0.01、0.002、0.001和0的比例，與F1加入至C1傳感器中，與對照組（C' control）相比，GQC1的熒光強度基本沒有變化（圖5），即沒有QDs被miR-21從GQC1解組裝出來，表明此復合物可特異性識別miR-141。

3.3 串聯(lián)傳感器循環(huán)檢測miRNA

探究3組傳感器C1、C2和C3對不同濃度的靶向物C'（miR-141）的響應(yīng)能力，將與L1（100 nmol/L）不同摩爾比（1、01、002、001、0005、0002、0001、00005、00002、00001、000005、000002、000001和0）的C'和對應(yīng)的Fuel加入至C1、C2和C3傳感器中，采用瓊脂糖電泳和熒光光譜表征復合物解組裝的程度。

如圖6所示，隨著C'/L1的比例不斷增加， 復合物解組裝越完全，在泳道中遷移速率越快。傳感器C1、C2和C3分別對在0001～1、00001～1和000001～1（C'/L1摩爾比）范圍內(nèi)對靶向物有響應(yīng)。隨著核酸循環(huán)體系的疊加，對應(yīng)的傳感器的靈敏度也隨之提高，可響應(yīng)的靶向物濃度更低。因此，可通過改變疊加的循環(huán)體系的數(shù)量調(diào)控靶向物檢測范圍。

圖7A～7C是由不同比例的C'/L1分別滴定C1、C2和C3傳感器釋放的QDs的熒光譜圖，在不同C'/L比例下傳感器解組裝釋放的QDs熒光強度與瓊脂糖電泳表征的解組裝結(jié)果基本一致。圖7D為3組傳感器中QDs熒光恢復率（F/F0-1）與不同比例C'/L1的關(guān)系圖， 根據(jù)圖7D將3組傳感器檢測的C'/L1摩爾比例區(qū)間轉(zhuǎn)化為C'濃度區(qū)間，其中C1為10-10～10-7 mol/L，C2為10-11～10-7?mol/L，C3為10-12～10-7mol/L，可見每疊加一個核酸催化循環(huán)體系，其對應(yīng)的傳感器最低檢測范圍降低一個數(shù)量級。

根據(jù)圖8中3組傳感器的線性檢測曲線，計算C1、C2和C3的檢測限分別為47.3 pmol/L、4.23 pmol/L和552 fmol/L（3σ/k）。

3.4 固定細胞成像

miR-141在22Rv1細胞中表達含量高， 在HeLa細胞中表達含量較低[21，37]。將C1、C2和C3傳感器和對應(yīng)的Fuel與上述兩種固定細胞分別孵育6、8和12 h后的細胞熒光成像圖如圖9所示， 22Rv1細胞與3組傳感器孵育后均有明顯的熒光成像信號， 并隨著每一次核酸循環(huán)體系的疊加， 熒光信號強度也隨之增強; C1傳感器在HeLa細胞中并沒有明顯的QDs熒光成像信號，這是因為HeLa細胞中miR-141表達含量比較低[38]， 其含量低于C1傳感器檢測限。選取相應(yīng)的傳感器定量檢測兩種細胞中miR -141的含量（表2），并與文獻對比發(fā)現(xiàn)，提取RNA定量檢測miR -141的拷貝量與文獻報導的值相接近[21，37～39]。

4 結(jié) 論

通過將核酸循環(huán)體系疊加，開發(fā)了新型納米傳感器，與常規(guī)的納米傳感器相比，串聯(lián)的納米傳感器具有動態(tài)可調(diào)的線性檢測區(qū)間和檢測限，可用于靈敏檢測癌細胞中不同表達水平的miRNA分子。雖然通過串聯(lián)核酸循環(huán)能夠放大檢測信號，但伴隨著信號的放大，傳感器的背景信號也隨之增大，影響串聯(lián)傳感器的靈敏度的提高。 后續(xù)研究將對傳感器背景信號增加的原因進行分析，進一步提高串聯(lián)傳感器的靈敏度。

References

1 Wienholds E， Plasterk R H. FEBS Lett.， 2005， 579（26）： 5911-5922

2 He L， Hannon G J. Nat. Rev. Genet.，? 2004，? 5（7）： 522-531

3 Ambros V. Nature，? 2004，? 431（7006）： 350-355

4 Dong H， Lei J， Ding L， Wen Y， Ju H， Zhang X. Chem. Rev.，? 2013，? 113（8）： 6207-6233

5 Bartel D P. Cell，? 2009，? 136（2）： 215-233

6 Bartel D P. Cell，? 2004，? 116（2）： 281-297

7 Di Stefano V， Zaccagnini G， Capogrossi M C， Martelli F. Vasc. Pharmacol.，? 2011，? 55（4）： 111-118

8 Esquela-Kerscher A， Slack F J. Nat. Rev. Cancer，? 2006，? 6（4）： 259-269

9 Calin G A， Croce C M. Nat. Rev. Cancer，? 2006，? 6（11）： 857-866

10 Liang D， Meyer L， Chang D W， Lin J， Pu X， Ye Y Q， Gu J， Wu X F， Lu K. Cancer Res.，? 2010，? 70（23）： 9765-9776

11 Witwer K W. Clin. Chem.，? 2015，? 61（1）： 56-63

12 Kayano M， Higaki S， Satoh J I， Matsumoto K， Matsubara E， Takikawa O， Niida S. Biomarker Res.，? 2016，? 4（1）： 22

13 Murakami Y， Yasuda T， Saigo K， Urashima T， Toyoda H， Okanoue T， Shimotohno K. Oncogene，? 2006，? 25（17）： 2537-2545

14 Sato Y， Ichihashi T， Nishizawa S， Teramae N. Angew. Chem. Int. Ed.，? 2012，? 51（26）： 6369-6372

15 Cheung T H， Quach N L， Charville G W， Liu L， Park L， Edalati A，Yoo B， Hoang P， Rando T A. Nature，2012，? 482（7386）：? 524-528

16 Hansen T B， Jensen T I， Clausen B H， Bramsen J B， Finsen B， Damgaard C K， Kjems J. Nature，? 2013，? 495（7441）： 384-388

17 Benes V， Castoldi M. Methods，? 2010，? 50（4）： 244-249

18 Marabita F， de Candia P， Torri A， Tegner J， Abrignani S， Rossi R L. Brief. Bioinform.，? 2015，? 17（2）： 204-212

19 Wang F， Lu C H， Willner I. Chem. Rev.，? 2014，? 114（5）：? 2881-2941

20 Chen J， Tang L， Chu X， Jiang J. Analyst，? 2017，? 142（17）： 3048-3061

21 Yin B C， Liu Y Q， Ye B C. J. Am. Chem. Soc.，? 2012，? 134（11）： 5064-5067

22 Wu C， Cansiz S， Zhang L， Teng I T， Qiu L， Li J， Tan W. J. Am. Chem. Soc.，? 2015，? 137（15）： 4900-4903

23 Khlebtsov N， Dykman L. Chem. Soc. Rev.，? 2011，? 40（3）： 1647-1671

24 Seferos D S， Giljohann D A， Hill H D， Prigodich A E， Mirkin C A. J. Am. Chem. Soc.，? 2007，? 129（50）： 15477-15479