安方玉，顏春魯△，劉永琦，王繼龍，趙 磊， 夏鵬飛，駱亞莉，王國(guó)文，趙崇博，鄧 婕

[1甘肅中醫(yī)藥大學(xué), 2甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 3甘肅省高校中(藏)藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 4敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000]

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝骨關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生為特征的慢性關(guān)節(jié)炎疾病[1]，在疾病的活動(dòng)期成為中老年人群發(fā)生疼痛和致殘的主要原因。目前治療KOA的首選藥物主要是鎮(zhèn)痛藥:非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇類藥物。非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇類藥物雖然起效快，但是長(zhǎng)期服用非甾體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇類藥物只能緩解癥狀，并不能阻止關(guān)節(jié)軟骨破壞的進(jìn)展，并且不良反應(yīng)較大，為此，尋找安全、低毒、有效的藥物成為防治KOA的關(guān)注焦點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為，KOA屬于 “痹證”和“痿證”，肝腎虧虛、長(zhǎng)期勞損及外感風(fēng)寒濕邪是其主要病機(jī)。右歸丸(Youguiwan,YGW)具有溫補(bǔ)腎陽和填精止遺的功效，針對(duì)KOA的肝腎虧虛之癥，本方對(duì)KOA可能具有療效。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型，以中藥右歸丸灌胃，觀察其對(duì)模型鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的病理及熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α，Hsp90α)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)蛋白和Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，COL-Ⅱ)等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，分析中醫(yī)藥防治KOA的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體重(180±20) g，購自我?？蒲袑?shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為SYXK(甘)2015-0005。

2 主要試劑

水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150105)；反轉(zhuǎn)錄試劑2×Prime Script RT Master Mix(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)： AI20775A)； 熒光定量SYBR Premix EX TaqⅡ(Promega，批號(hào)為：0000304040)。β-actin、白細(xì)胞介素1β (interleukin-1β,IL-1β)、基質(zhì)金屬蛋白酶3 (matrix metalloprotei-nase-3, MMP-3)和MMP-13的RT-qPCR引物序列由TaKaRa設(shè)計(jì)并合成。β-actin的上游引物序列為5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物序列為5’-GACTCATCGTACTCCGCTTGCTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物150 bp； IL-1β的上游引物序列為5’-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA-3’，下游引物序列為5’-CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為111 bp；MMP-3的上游引物序列為5’-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3’，下游引物序列為5’-TTCATGAGCAG CAACCAGGAATAG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為136 bp；MMP-13的上游引物序列為5’-TGATGATGAAACCTGGACAAGCA-3’，下游引物序列為5’-GAACGTCATCATCTGGGAGCA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為173 bp?？笹APDH抗體(ImmunoWay，批號(hào)：B4501)； rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody(Gene Tex，批號(hào)：821801317)； rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody(Gene Tex，批號(hào)：821801325)； rabbit anti-Fn polyclonal antibody(Gene Tex，批號(hào)：821801378)。

3 主要儀器

BioMATE 3S型蛋白和核酸濃度測(cè)定儀(Thermo)； BX53型顯微鏡(OLYMPUS)；C1000型PCR熱循環(huán)儀(ABI)；LightCycler 96型 Real-Time PCR System(Roche)；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)；TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(凱達(dá)集團(tuán)成員高科技公司)；OSE-Y10型電動(dòng)組織研磨器(Tiangen)。

4 實(shí)驗(yàn)藥物及給藥劑量

右歸丸購自仲景宛西制藥股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z41022170，批號(hào)：151108)，人的臨床用量為27 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法，27 g×0.018×5≈2.4 g/kg，作為中劑量，則右歸丸高、中、低劑量分別為4.8、2.4和1.2 g/kg；硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate， GS)片(保節(jié)力，新興同仁藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041317，批號(hào)：160302)；青霉素(北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13020657，批號(hào)：F6042103)。

5 實(shí)驗(yàn)方法

5.1動(dòng)物分組、造模及給藥 60 只 SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)對(duì)照(sham control,SC)組、模型(model,M)組、GS組及右歸丸高劑量(YGW-H)組、右歸丸中劑量(YGW-M)組和右歸丸低劑量(YGW-L)組，每組10只。參照文獻(xiàn)[2-3]，首先用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各組動(dòng)物，模型組及干預(yù)組采用改良Hulth 法復(fù)制KOA模型，假手術(shù)組 SD 大鼠從膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)只打開關(guān)節(jié)腔，不破壞韌帶和半月板，并保留關(guān)節(jié)軟骨面。術(shù)后連續(xù) 3 d每天肌肉注射青霉素2×105U，各組大鼠均在相同條件下，自由飲水，攝食。手術(shù)造模 6 周后通過HE染色觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化以判定模型的是否成功，造模成功后給予藥物干預(yù)，硫酸氨基葡萄糖組灌服硫酸氨基葡萄糖(0. 17 g/kg)，右歸丸高、中、低劑量組分別按 4.8、2.4和1.2 g/kg灌服相應(yīng)的藥物，干預(yù) 8周。用4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉各組動(dòng)物后股動(dòng)脈采血處死各組動(dòng)物，摘取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛，右側(cè)膝關(guān)節(jié)于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2HE染色觀察骨形態(tài)學(xué)變化 動(dòng)物處死后取完整膝關(guān)節(jié)，對(duì)左側(cè)膝關(guān)節(jié)脫鈣處理并脫蠟至水，采用石蠟包埋法制作蠟塊，并用切片機(jī)切片，切片厚度約5 μm，HE染色，封片、鏡檢并進(jìn)行 Mankin 評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：軟骨結(jié)構(gòu)如常，軟骨細(xì)胞數(shù)量如常，基質(zhì)染色正常，潮線比較完整記為0分；軟骨表面有不規(guī)則裂隙，軟骨細(xì)胞數(shù)量彌漫性增多，基質(zhì)染色減退，出現(xiàn)多重潮線記為1分；軟骨裂隙深達(dá)肌層，軟骨細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，基質(zhì)染色明顯減退，軟骨下血管浸入肌層記為2分；軟骨裂隙深達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，基質(zhì)染色明顯減退記為3分；軟骨裂隙深達(dá)鈣化層，基質(zhì)染色完全消失記為4分；軟骨層脫落記為5分。

5.3免疫組化法觀察軟骨組織Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ的蛋白表達(dá) 4%多聚甲醛固定膝關(guān)節(jié)軟骨并脫鈣，將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、脫水后將切片放入配制好的枸櫞酸緩沖液盒中進(jìn)行微波修復(fù)；3%H2O2室溫孵育30 min； 5%山羊血清封閉 30 min；滴加50 μL 的Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ polyclonal antibody(這些I抗的稀釋比例分別為1 ∶100、1 ∶100和1 ∶300)，同時(shí)用PBS 緩沖液代替I抗設(shè)立陰性對(duì)照，將切片放入濕盒中，4 ℃過夜；滴加山羊抗兔的 II 抗，室溫下放置30 min；滴加ABC工作液，37 ℃孵育60 min；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；二甲苯透明，封固。染色以軟骨基質(zhì)表層和中層的軟骨細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，由我校病理教研室老師采用雙盲法進(jìn)行閱片。應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0 全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)軟骨細(xì)胞陽性染色的積分吸光度(integral absorbance,IA) 進(jìn)行定量分析，對(duì)進(jìn)行標(biāo)記，以其中一個(gè)具有代表意義陽性結(jié)果的視野的棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn),自動(dòng)檢測(cè)所有視野的陽性結(jié)果[4]。

5.4軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)測(cè)定 用 RNA抽提試劑提取軟骨組織RNA，BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定 RNA 含量。用Promega 試劑盒說明書步驟合成 cDNA第1鏈，按Promega實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒操作說明書進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃ 2 min；變性 95 ℃ 15 s、退火 58 ℃ 45 s、延伸 60 ℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)經(jīng) 2-ΔΔCt處理后進(jìn)行IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA相對(duì)表達(dá)量分析。

5.5Western blot法測(cè)定軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ的蛋白表達(dá) 軟骨組織蛋白質(zhì)的提取用 RIPA 裂解液，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定用BCA 法，并調(diào)整點(diǎn)樣的蛋白質(zhì)濃度為5 g/L，每孔10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加抗rabbit anti-Hsp90α polyclonal antibody和rabbit anti-COL-Ⅱ polyclonal antibody等 I 抗孵育，滴加山羊抗兔IgG II抗孵育。采用 ECL Plus 超敏發(fā)光液染色觀察，將溶液A 和 B 等體積混勻后，按約0.125 mL/cm2膜面積進(jìn)行染色，室溫反應(yīng)1 min后置于 Image Lab 3.0 進(jìn)行曝光，曝光條件為：?jiǎn)蝹€(gè)曝光時(shí)間10 s，總曝光時(shí)間60 s。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 膝關(guān)節(jié)軟骨組織的形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面及滑膜結(jié)構(gòu)完整，軟骨細(xì)胞呈水平排列，關(guān)節(jié)軟骨邊緣光滑；模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨邊緣嚴(yán)重破壞，軟骨細(xì)胞排列紊亂；右歸丸低、中劑量組關(guān)節(jié)軟骨邊緣不平整，軟骨細(xì)胞排列紊亂； 右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常，軟骨細(xì)胞分布偶見不均，關(guān)節(jié)軟骨表面欠光滑,見圖1。Mankin評(píng)分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組及各干預(yù)組大鼠Mankin評(píng)分均升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組大鼠Mankin評(píng)分均降低(P<0.05或P<0.01),見圖2。

Figure 1. The pathomorphological changes of cartilages in each group (HE staining, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖1 各組大鼠軟骨組織病理形態(tài)學(xué)變化

Figure 2. Comparison of Makin scores in each group. Mean±SD.n=6.##P<0.01vsSC group;*P<0.05,**P<0.01vsM group.
圖2 各組大鼠Makin評(píng)分結(jié)果的比較

2 軟骨組織Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白表達(dá)的變化

染色以軟骨基質(zhì)表層和中層的軟骨細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。假手術(shù)組 Hsp90α呈弱陽性表達(dá)，F(xiàn)n和COL-Ⅱ均呈陽性表達(dá)；模型組關(guān)節(jié)軟骨中 Hsp90α強(qiáng)陽性表達(dá)，F(xiàn)n和COL-Ⅱ均呈弱陽性表達(dá)；右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組Hsp90α弱陽性表達(dá)、Fn強(qiáng)陽性表達(dá)，右歸丸中、高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組COL-Ⅱ呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Fn和COL-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低，Hsp90α蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量組和硫酸氨基葡萄糖組Hsp90α蛋白表達(dá)明顯降低、Fn蛋白表達(dá)明顯升高，而右歸丸中、高劑量組和氨基葡萄糖組COL-Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.01),見圖3～5和表1。

Figure 3. The cells with positive expression of Hsp90α protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖3 各組大鼠Hsp90α蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

Figure 4. The cells with positive expression of Fn protein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖4 各組大鼠Fn蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

Figure 5. The cells with positive expression of COL-Ⅱprotein in each group (IHC, ×200). A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖5 各組大鼠COL-Ⅱ蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

表1 各組大鼠Hsp90α、Fn和COL-Ⅱ蛋白免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)IA值的結(jié)果比較
Table 1.IAvalues for the protein expression of Hsp90α, Fn and COL-Ⅱin each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αFnCOL-ⅡSC56×103174×103 35×103 M203×103##41×103##17×103##GS71×103??135×103??39×103??YGW-H54×103??151×103??44×103??YGW-M189×103 61×103 36×103??YGW-L193×103 52×103 18×103

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

3 軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸各干預(yù)組和硫酸氨基葡萄糖組IL-1β、MMP-3和MMP-13的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠IL-1β、MMP-3和MMP-13 mRNA表達(dá)的比較
Table 2. The mRNA expression of IL-1β, MMP-3 and MMP-13 in each group (Mean±SD.n=6)

GroupIL-1βMMP-3MMP-13SC1.00±0.091.00±0.091.00±0.03M7.50±0.23##5.57±0.04##6.18±0.01##GS3.86±0.11??1.27±0.08??2.74±0.06??YGW-H2.56±0.35??1.12±0.10??2.53±0.06??YGW-M4.71±0.15??2.44±0.03??3.18±0.04??YGW-L5.32±0.49??3.62±0.04??4.03±0.09??

##P<0.01vsSC group;**P<0.01vsM group.

4 軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠軟骨組織COL-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯降低，Hsp90α的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，右歸丸高劑量干預(yù)組和硫酸氨基葡萄糖干預(yù)組Hsp90α的蛋白表達(dá)顯著降低，右歸丸中、高劑量干預(yù)組和硫酸氨基葡萄糖干預(yù)組COL-Ⅱ蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),見圖6和表3。

Figure 6. Protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in cartilaginous tissues of each group. A: SC group; B: M group; C: GS group; D: YGW-H group; E: YGW-M group; F: YGW-L group.
圖6 各組大鼠軟骨組織Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白的表達(dá)

表3 各組大鼠Hsp90α和COL-Ⅱ蛋白表達(dá)的結(jié)果的比較
Table 3. The protein expression of Hsp90α and COL-Ⅱ in each group (Mean±SD.n=6)

GroupHsp90αCOL-ⅡSC0.48±0.011.26±0.04M1.01±0.03##0.41±0.05##GS0.58±0.01?0.73±0.02?YGW-H0.63±0.03?0.63±0.05?YGW-M0.92±0.010.59±0.02?YGW-L0.75±0.020.38±0.02

##P<0.01vsSC group;*P<0.05vsM group.

討 論

KOA是一種累及膝關(guān)節(jié)軟骨組織、以疼痛和骨關(guān)節(jié)退變?yōu)橹饕±硖攸c(diǎn)的慢性進(jìn)展性疾病。KOA在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“骨痹”范疇，主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、本痿標(biāo)痹；因肝藏血，血養(yǎng)筋，故肝之合筋也；腎主貯藏精氣，骨髓生于精氣，故腎之合骨也。中年以后肝腎虧虛，肝虛則血不養(yǎng)筋，腎虛則髓減，精血不足，筋骨失養(yǎng)，腠理空虛，易感風(fēng)寒濕之邪而為痹；中醫(yī)治療多以補(bǔ)益肝腎為主要法則[5]。來自《景岳全書》的補(bǔ)腎方藥右歸丸，主要由“熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當(dāng)歸”組成，方中附子、肉桂、鹿角膠培補(bǔ)腎中元陽，溫里祛寒，為君藥。熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補(bǔ)脾，填精補(bǔ)髓，取“陰中求陽”之義，為臣藥。再用菟絲子、杜仲補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰膝，配以當(dāng)歸養(yǎng)血和血，共補(bǔ)肝腎精血，為佐藥。諸藥合用，以溫腎陽為主而陰陽兼顧，肝脾腎并補(bǔ)，妙在陰中求陽，使元陽得以歸原。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血中藥可顯著減輕KOA大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹，改善軟骨形態(tài)，延緩軟骨退變，提示補(bǔ)腎活血中藥治療 KOA 可能具有緩解癥狀和修復(fù)結(jié)構(gòu)的效果[6]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸能消除 KOA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹，可有效延緩KOA模型大鼠的關(guān)節(jié)軟骨退變，其作用機(jī)制可能與降低血清 IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子水平，降低Wnt信號(hào)通路的WISP1、Wnt1、β-catenin和LRP5蛋白表達(dá)，以及升高DKK1的蛋白表達(dá)有關(guān)[7-8]。本研究通過觀察右歸丸對(duì)KOA模型組大鼠軟骨病理的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量右歸丸均能減輕KAO模型組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)破壞的范圍和嚴(yán)重程度，改善軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)并具有延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用。Mankin評(píng)分進(jìn)一步說明低、中、高劑量右歸丸可減輕KOA模型組大鼠的軟骨損傷，證實(shí)了右歸丸延緩軟骨退變、保護(hù)軟骨的作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，尤以右歸丸高劑量組作用最為明顯，其可能機(jī)制是右歸丸通過其方中的附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、菟絲子、杜仲等藥達(dá)到滋陰益腎、養(yǎng)肝補(bǔ)脾、填精補(bǔ)髓等功效，從而恢復(fù)肝腎對(duì)膝關(guān)節(jié)的濡養(yǎng)作用，有效改善KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)，達(dá)到延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的目的。

Hsp90可以加重KOA機(jī)體的關(guān)節(jié)軟骨退化，在促進(jìn)其機(jī)體關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞釋放NO中可能發(fā)揮重要的作用[9-10]。Hsp90是熱休克蛋白家族的成員之一，主要有Hsp90α和Hsp90β 兩種亞型，其功能的發(fā)揮可能是通過PI3K/Akt、IKK和NF-κB等信號(hào)通路完成的[11-12]。在骨關(guān)節(jié)炎中，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和降解之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，其中以降解占主導(dǎo)地位。Fn屬于ECM的非膠原糖蛋白成分。膠原蛋白和彈性蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白可以通過纖連蛋白、層粘連蛋白以及其它的連接分子直接或間接與細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、分化、形態(tài)、遷移、組織穩(wěn)態(tài)的建立與維持等生理功能[13]。Tao 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n可以與整合素α5β1受體相互作用增強(qiáng)軟骨修復(fù)。還有研究發(fā)現(xiàn)，COL-Ⅱ合成減少和降解加速與KOA的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，IL-1β 可抑制COL-Ⅱ蛋白的合成，使軟骨細(xì)胞變性，抑制軟骨細(xì)胞增殖和合成前列腺素，同時(shí)MMP-1和MMP-13的分泌可以裂解ECM中的COL-Ⅱ蛋白，破壞其形成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致軟骨發(fā)生破壞和缺損[15-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，低、中、高劑量右歸丸均能減少模型組大鼠炎癥因子IL-1β及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1和MMP-13的分泌，同時(shí)降低了模型組大鼠Hsp90α表達(dá)，增強(qiáng)了模型組大鼠COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達(dá)。這一結(jié)果說明右歸丸可能通過其方藥中的當(dāng)歸、附子和肉桂等來達(dá)到活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，進(jìn)一步抑制KOA模型大鼠炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和Hsp90α的表達(dá)，增強(qiáng)其COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達(dá)，從而使軟骨基質(zhì)的合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡，減少軟骨細(xì)胞凋亡，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，發(fā)揮對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，尤以右歸丸高劑量組作用最為明顯。

綜上所述，右歸丸可能是通過“補(bǔ)益肝腎、活血化瘀、通絡(luò)止痛”等作用抑制KOA模型鼠炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌并調(diào)控軟骨組織Hsp90α、COL-Ⅱ和Fn的蛋白表達(dá)來達(dá)到抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、延緩關(guān)節(jié)軟骨退化、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨重構(gòu)的目的，從而發(fā)揮治療作用。