王馨悅，李 楠，董 兵，楊 洋，林貞花

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室， 吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉林 延吉 133002)

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率呈年輕化趨勢發(fā)展[1]。目前，子宮頸癌患者的死亡率位居女性惡性腫瘤首位，全球每年約有50萬新增病例，其中，28萬患者死于子宮頸癌[2]。子宮頸鱗癌是子宮頸癌最常見的組織學(xué)分型，發(fā)病隱匿，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅女性的生命健康。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)記物對子宮頸癌患者的早期診斷及預(yù)后評估至關(guān)重要。

壽命蛋白(mortalin)屬于熱休克蛋白70家族成員之一，最早被發(fā)現(xiàn)于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，廣泛分布于胞漿及多個(gè)細(xì)胞器中[3]。研究表明，mortalin參與調(diào)控細(xì)胞周期、外界應(yīng)激和腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程[4]，且在卵巢癌[5]、顱腦腫瘤[6]和結(jié)腸癌[7]等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但mortalin與子宮頸癌演進(jìn)之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。為此，本文旨在應(yīng)用免疫組化法檢測mortalin在正常宮頸上皮組織和子宮頸鱗癌組織中的差異表達(dá)情況，并探討其表達(dá)水平與子宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)及子宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，進(jìn)而為子宮頸鱗癌預(yù)后評估提供可能的分子指標(biāo)。

材 料 和 方 法

1 臨床材料

臨床資料及隨訪信息齊全的宮頸組織標(biāo)本選自2006年～2014年延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤組織庫，部分購自上海芯超科技有限公司，包括59例正常宮頸上皮組織標(biāo)本和93例子宮頸鱗癌組織。統(tǒng)計(jì)93例子宮頸鱗癌標(biāo)本的臨床病理資料，包括：年齡<50歲的有51例，≥50歲的有42例；腫瘤<3.0 cm的有38例，≥3.0 cm的有55例；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)12例，II級(jí)66例，III級(jí)15例；依據(jù)國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，0～I(xiàn)I期63例，III～I(xiàn)V期30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者67例。

2 試劑

mortalin抑制劑MKT-077購自Sigma；DMEM 培養(yǎng)基和新生牛血清 FBS 購自Gibco；熒光II抗及DAPI購自Invitrogen；抗E-cadherin、vimentin及 Snail抗體購自CST；抗mortalin抗體購自Abcam；抗β-actin抗體以及羅丹明標(biāo)記的II抗購自中杉金橋公司。

3 方法

3.1免疫熒光染色 將SiHa細(xì)胞鋪于0.1 mm厚度的蓋玻片上，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至50%后，加入多聚甲醛室溫下固定15 min，以0.5%的Triton X-100 細(xì)胞打孔10 min，3% BSA室溫封閉2 h，滴加 I 抗(抗mortalin抗體1 ∶200 稀釋)，4 ℃過夜；熒光Ⅱ抗Alexa Fluro 488標(biāo)記，室溫避光孵育1 h，DAPI封片固定；用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光染色結(jié)果，并照相記錄。

3.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、重懸，按每孔100 μL接種于96孔板內(nèi)，每孔含2×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)5個(gè)復(fù)孔；待細(xì)胞貼壁后按藥物濃度梯度加入mortalin抑制劑MKT-077，并按給藥時(shí)間梯度分別加入MTT(5 g/L)，4 h后加入二甲基亞砜溶液，振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在490 nm波長檢測吸光度(A)值并繪制細(xì)胞生長曲線。

3.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞常規(guī)消化、鋪板，待細(xì)胞長至80%用10 μL無菌槍頭沿孔底呈“一”字形劃痕，PBS液洗細(xì)胞3次后，加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，并分別于0、24和48 h拍照。

常規(guī)消化、計(jì)數(shù)細(xì)胞，取3×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后加入Transwell小室上室內(nèi)，將1 mL含10%血清的培養(yǎng)液加入下室，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后甲醇固定，蘇木素染色，中性樹脂封片、拍照。

3.4Western blot檢測蛋白水平 RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取蛋白；BCA 法測定蛋白濃度；SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上；5% 脫脂奶粉搖床封閉2 h；加入 I 抗4 ℃ 過夜；TBS-T洗膜后加入 II抗；孵育 2 h；ECL曝光。

3.5免疫組化染色 制備4 μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原修復(fù)，滴加抗mortalin抗體(稀釋比例1∶50)，4 ℃孵育過夜；次日滴加 II 抗，DAB顯色，蘇木素對比染色，中性樹膠封片。為證明mortalin抗體免疫組化檢測的特異性，選用mortalin強(qiáng)陽性染色的切片，以PBS代替 I 抗的染色結(jié)果作為陰性對照。以著色強(qiáng)度及著色細(xì)胞數(shù)綜合計(jì)算作為mortalin陽性染色評分標(biāo)準(zhǔn)。按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度與著色細(xì)胞數(shù)得分相乘，0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～7分為中度陽性(++)，≥8分為強(qiáng)陽性(+++)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法進(jìn)行臨床病理分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩獨(dú)立樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 mortalin在SiHa細(xì)胞中的定位

免疫熒光結(jié)果顯示mortalin主要表達(dá)于SiHa細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，見圖1。

Figure 1. The mortalin was mainly located in the cytoplasm of SiHa cells.
圖1 mortalin在宮頸癌SiHa細(xì)胞系中的胞質(zhì)定位

2 mortalin在宮頸鱗癌組織中過表達(dá)

免疫組化染色顯示，mortalin在子宮頸鱗癌組織中過表達(dá),mortalin在子宮頸鱗癌組織中表達(dá)的陽性率和強(qiáng)陽性率分別為89.2%(83/93)和62.4%(58/93)，顯著高于其在正常宮頸上皮組織中的表達(dá)(23.7%和5.1%，P<0.01)，見圖2、表1。

Figure 2. The protein expression of mortalin in cervical squamous-cell carcinoma tissues.
圖2 mortalin在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)

表1 mortalin在各組宮頸組織中的表達(dá)Table 1. Mortalin protein expression in cervical squamous-cell carcinoma tissues

**P<0.01vsnormal cervical epithelium.

3 mortalin表達(dá)與子宮頸鱗癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

對mortalin表達(dá)與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示mortalin表達(dá)與子宮頸癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與患者年齡和腫瘤大小無明顯相關(guān)性，見表2。

表2 mortalin表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 2. Correlation between mortalin expression and the clinicopathological features of cervical squamous cell carcinoma

4 mortalin表達(dá)下調(diào)通過EMT途徑抑制SiHa細(xì)胞的遷移

MTT實(shí)驗(yàn)篩選mortalin抑制劑MKT-077作用的最佳濃度及時(shí)間為11.93 μmol/L和48 h，見圖3A，并通過Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在使用抑制劑后，mortalin的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.01),見圖3B。細(xì)胞劃痕及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)mortalin受到抑制時(shí)，SiHa細(xì)胞的遷移能力顯著下降，見圖3C、D；進(jìn)一步通過Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示抑制mortalin后，上皮表型標(biāo)志物E-cadhe-rin的表達(dá)明顯上調(diào)，間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及Snail的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01),見圖3B。

Figure 3. Inhibition of mortalin attenuated the migration ability of SiHa cells. A: the optimal concentration and dosing time of MKT-077 were evaluated by MTT assay; B: the protein expression of EMT-related molecules was determined by Western blot; C and D: the migration ability of SiHa cells was detected by wound-healing (×40) and Transwell migration (×200) assays. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.
圖3 抑制mortalin對SiHa細(xì)胞遷移能力的影響

討 論

子宮頸癌是婦科三大惡性腫瘤之一，其中最常見的是子宮頸鱗癌，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜而多變的過程[8]。隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷進(jìn)步，診斷子宮頸癌的腫瘤標(biāo)記物日益增多，主要包括CA125、p53、p16和Ki-67等，在其早期診斷、療效評估以及判斷預(yù)后等方面已具有一定的臨床意義[9]。近年來針對子宮頸癌治療靶點(diǎn)的研究多圍繞血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子受體及基質(zhì)金屬蛋白酶等方面，但靶向治療仍處于初步階段，仍存在一些不足，如抗體的異質(zhì)性、患者耐藥性及藥物引起的毒性反應(yīng)等[10]。目前宮頸癌的早期診斷、進(jìn)展期治療及預(yù)后仍不樂觀，因此，研究宮頸癌的潛在分子機(jī)制及尋求更有效的分子治療靶點(diǎn)對于宮頸癌患者的治療及預(yù)后至關(guān)重要。

mortalin屬于分子伴侶HSP70家族的一員，是人類HSPA9基因編碼的蛋白，其基因定位于染色體5q31.1上[11]。mortalin具有蛋白質(zhì)修飾、免疫應(yīng)答、參與胞內(nèi)運(yùn)輸和受體的內(nèi)化等功能[12]。越來越多的研究表明，mortalin與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。Yi等[13]報(bào)道,mortalin在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與患者的臨床分期及靜脈浸潤密切相關(guān)；Dundas等[7]發(fā)現(xiàn),mortalin在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并與患者預(yù)后不良關(guān)系密切。有研究表明,mortalin可能與成纖維細(xì)胞生長因子、細(xì)胞漿J蛋白等相關(guān)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力[14]；Iosefson等[15]研究證實(shí),mortalin的衍生物通過促使p53的功能失活，使腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性、遷移和轉(zhuǎn)移能力及在體內(nèi)外形成腫瘤的能力；Hu等[16]在研究中發(fā)現(xiàn)mortalin蛋白可通過激活MAPK-ERK通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生形成。上述研究提示mortalin的異位表達(dá)可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，mortalin在乳腺癌組織中過表達(dá)，且與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)、患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]；并發(fā)現(xiàn)其在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)且與胰腺導(dǎo)管腺癌患者臨床分期、神經(jīng)周圍浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[18]。在本研究中，免疫熒光染色法明確了mortalin在子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，且免疫組化染色結(jié)果顯示其在子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸上皮組織。進(jìn)一步分析mortalin高表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mortalin在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)子宮頸鱗癌組織中的強(qiáng)陽性率(83.3%)顯著高于早期(0～I(xiàn)I期)組織(52.4%，P=0.004)；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的子宮頸鱗癌組織中，mortalin表達(dá)強(qiáng)陽性率(80.8%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織(55.2%)，提示其與子宮頸鱗癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kang等[19]發(fā)現(xiàn),mortalin促進(jìn)了肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞EMT的發(fā)生;Na等[20]研究表明mortalin能夠促進(jìn)EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究mortalin在子宮頸鱗癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展中的作用機(jī)制，本研究進(jìn)行了細(xì)胞劃痕及遷移實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示抑制mortalin后，SiHa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力明顯下降；檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)上皮表型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)，而間充質(zhì)表型標(biāo)志物vimentin及Snail表達(dá)明顯下調(diào)。上述結(jié)果與本課題組前期對于mortalin調(diào)控漿液性卵巢癌轉(zhuǎn)移及EMT進(jìn)程的研究結(jié)果相符[21]，提示mortalin可能通過EMT途徑促進(jìn)了子宮頸鱗癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，mortalin在子宮頸鱗癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)合mortalin表達(dá)與子宮頸鱗癌臨床病理學(xué)特征及轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，提示mortalin蛋白可能參與子宮頸鱗癌的演進(jìn)。本研究對于判斷子宮頸鱗癌的進(jìn)展及預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。