吳江立，安勝軍，常 宏, 2△

(1 河北中醫(yī)學(xué)院科技處， 河北 石家莊 050091； 2蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 蘇州 215009)

高脂血癥是指血清中一種或幾種脂質(zhì)指標(biāo)濃度水平高于正常值，是一種全身性疾病。其可進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，繼而引發(fā)冠心病、腦卒中和心肌梗死等病癥，嚴(yán)重危害人類健康。他汀類藥物在臨床上廣泛用于高血脂的治療，但是仍有患者在最大承受劑量的情況下血脂不能恢復(fù)到正常水平。

低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)在脂類代謝的環(huán)節(jié)中起著重要的作用，可介導(dǎo)肝臟對(duì)脂蛋白的代謝和攝取，維持低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)在一個(gè)穩(wěn)定的水平。人前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族中一員，又稱神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC1)蛋白，可與血液中LDLR的表皮生長(zhǎng)因子A(epidermal growth factor A，EGF-A)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，加速LDLR降解[1]，從而導(dǎo)致血液中LDL-C水平升高[2]，故PCSK9-LDLR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)血脂方面受到越來(lái)越多的關(guān)注[3-4]。

三七又名人參三七，為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H. Chen的干燥根，其性溫，微苦，三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)為其主要活性成分，具有活血化瘀的功效。有研究報(bào)道，PNS能顯著降低大鼠血清總膽固醇(total cholesterol，TC)和LDL-C的含量，降低血清羥自由基(-OH)及丙二醛(malondialdehyde，MDA)的濃度等[5-7]。以其作為有效成份的藥物(血塞通注射液和三七膠囊)在臨床也被廣泛用于心腦血管疾病的治療[8-9]。有關(guān)PNS的降脂研究大多集中在血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定方面，未涉及具體的降脂機(jī)制。PNS在降脂過(guò)程中對(duì)PCSK9和LDLR表達(dá)水平影響如何，未見(jiàn)報(bào)道。鑒于以上問(wèn)題，本課題研究了PNS對(duì)高脂血癥金黃地鼠血脂水平的調(diào)節(jié)作用，并探討其是否可以通過(guò)影響PCSK9-LDLR通路來(lái)調(diào)節(jié)血脂代謝。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)敘利亞雄性金黃地鼠30只，6～8周，體質(zhì)量(120±10) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。高脂飼料配方[10]由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2014-0008。

2 藥物

血塞通注射液(云南白藥集團(tuán)股份有限公司)，購(gòu)于石家莊市康和藥房。

3 主要試劑

TC、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒購(gòu)自石家莊志誠(chéng)醫(yī)療器械有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；引物為Invitrogen設(shè)計(jì)；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗LDLR抗體(ab30532)購(gòu)自Abcam;抗PCSK9抗體(A7860)和抗GAPDH抗體(AC033)購(gòu)自ABclonal；Peroxidase-Labeled Affinity Purified Antibody To Rabbit/Mouse IgG(H+L)購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司。

4 主要方法

4.1動(dòng)物分組及給藥 30只敘利亞金黃地鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，即正常對(duì)照(normal,N)組10只和高脂模型組20只。其中，正常對(duì)照組飼喂普通飼料，自由飲水；高脂模型組飼喂高脂飼料，自由飲水。造模4周后，眼內(nèi)眥取血檢測(cè)TC和TG的含量，當(dāng)模型組地鼠血清TC和TG水平與正常組相比顯著升高時(shí)，表示造模成功。將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為模型(model,M)組(10只)和PNS給藥(S)組(10只)，其中， PNS組地鼠每天腹腔注射血塞通注射液(50 mg/kg)，給藥劑量約為成人用藥的30倍[11]；正常對(duì)照組和高脂模型組地鼠每天腹腔注射等量的生理鹽水。每周測(cè)量體重1次以調(diào)整給藥量，給藥周期12周。

4.2標(biāo)本采集 末次給藥后，以10%的水合氯醛麻醉地鼠，眼內(nèi)眥取血，隨后打開胸腔，分離肝臟，部分置于4%多聚甲醛固定，余下部分置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.3血脂和肝功的檢測(cè) 將血液室溫靜止2 h，4 ℃、3 000×g離心15 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和AST。

4.4Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 取地鼠肝臟組織，采用RNA快速提取試劑盒提取RNA，用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，之后用Reverse Transcriptase Kit合成cDNA，以其為模板，采用SYBR qPCR Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。LDLR 上游引物序列為5’-GGACCTCAAGATTGGCTACGAG-3’，下游引物序列為5’-TCGTGGCGATTAGTGAAGAGC-3’；PCSK9上游引物序列為5’-CCTGCCTTTGTGGTGAAGATGA-3’，下游引物序列為5’-TGACCCTGCCCTCAATTTCC-3’；β-actin上游引物序列為5’-AAAGAGCACTTCCGGTGTCCAG-3’，下游引物序列為5’-CTGACTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。PCR條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，循環(huán)40次，之后進(jìn)行熔解曲線分析。以β-actin作為內(nèi)參照，按照2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

4.5免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PCSK9和LDLR在肝臟的表達(dá) 將固定在4%多聚甲醛的肝臟組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，隨后進(jìn)行連續(xù)切片厚度5 μm，切片于68 ℃下烘烤1 h，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，于37 ℃，過(guò)氧化氫孵育10 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，隨后用檸檬酸緩沖液高壓抗原修復(fù)3 min，之后加入Ⅰ抗(LDLR，1∶400；PCSK9，1∶400)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗3次之后滴加Ⅱ抗，之后進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，Leica顯微鏡下觀察拍照。

4.6Western blot 檢測(cè)LDLR和PCSK9的表達(dá) 提取肝臟組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，之后將蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1 h，加入Ⅰ抗(兔抗LDLR抗體1∶500；兔抗PCSK9抗體1∶500； 鼠抗GAPDH抗體1∶10 000)， 4 ℃過(guò)夜，后用TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG，1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST充分洗膜后，用ECL試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng) Fusion Fx5 Spectra 進(jìn)行曝光和拍照，用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PNS對(duì)高脂血癥金黃地鼠血脂的影響

與正常對(duì)照組相比，高脂模型組地鼠血清TC、TG和LDL-C水平均顯著升高(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)PNS治療后，與模型組相比，TC、TG和LDL-C水平均顯著降低(P<0.05)；HDL-C水平在3組之間無(wú)顯著變化(P>0.05),見(jiàn)圖1。

Figure 1. The levels of blood lipids in different groups of the hamsters. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
圖1 各組地鼠血清的血脂水平

2 PNS對(duì)高脂血癥金黃地鼠血清肝功能的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組血清ALT活性顯著升高(P<0.05)，AST雖有升高但變化不明顯(P>0.05)；與模型組比較，PNS組血清ALT活性顯著降低(P<0.05)，AST無(wú)顯著變化(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2. The ALT and AST activity in serum in different groups of the hamsters. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
圖2 各組地鼠血清ALT和AST的活性

3 PNS對(duì)高脂血癥金黃地鼠肝臟PCSK9和LDLR mRNA表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高脂模型組地鼠肝臟中PCSK9 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，LDLR mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與高脂模型組相比，PNS組地鼠肝臟中PCSK9mRNA表達(dá)水平雖有降低，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，LDLR mRNA表達(dá)水平降低，差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Relative mRNA expression levels of hamster hepatic PCSK9 and LDLR in each group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsN group.
圖3 肝臟中PCSK9和LDLR mRNA表達(dá)水平

4 PNS對(duì)高脂血癥金黃地鼠肝臟中PCSK9和LDLR蛋白表達(dá)的影響

免疫組化顯示，PCSK9主要分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上，LDLR蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均有分布,見(jiàn)圖4。Western blot結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，高脂模型組肝臟PCSK9的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，LDLR蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與高脂模型組相比，PNS組PCSK9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，LDLR蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

Figure 4. The distribution of PCSK9 and LDLR in the liver. Scale bar=50 μm.
圖4 PCSK9和LDLR在肝臟中的分布

Figure 5. The protein expression of PCSK9 in the hamster liver of different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
圖5 各組地鼠肝臟PCSK9蛋白的表達(dá)

Figure 6. The protein expression of LDLR in the hamster liver of different groups. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsN group;▲P<0.05vsM group.
圖6 各組地鼠肝臟LDLR蛋白的表達(dá)

討 論

隨著人們生活水平的提高，高脂血癥的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人類健康。對(duì)高脂血癥動(dòng)物模型進(jìn)行研究，有助于模擬人類此疾病的發(fā)展和治療。大鼠作為經(jīng)典高血癥動(dòng)物模型，由于其血漿中LDL-C和HDL-C比例與人類存在較大不同，其使用比例在國(guó)外逐漸減少[12]。小鼠體內(nèi)HDL-C是主要的載脂蛋白，也與人類不同[13]。本研究選擇金黃地鼠作為建模的動(dòng)物，因其膽固醇的合成和代謝與人類相似[14]，不足之處是地鼠尾巴短小，采血困難。本研究模型組地鼠血清中TC、TG和LDL-C含量與正常對(duì)照組相比明顯升高，說(shuō)明造模成功。經(jīng)PNS治療后，地鼠血清中TC、TG和LDL-C水平與模型組相比顯著下降，說(shuō)明PNS確實(shí)可以降低血脂，與前期研究結(jié)果相符[5-6]。

長(zhǎng)期的高脂飲食可導(dǎo)致肝臟損傷、肝細(xì)胞變性壞死。ALT是目前肝功能損害最敏感的檢測(cè)指標(biāo)[15]。本研究中，模型組金黃地鼠血清中ALT活性與正常對(duì)照組相比顯著升高，提示高血脂地鼠的肝功能受到損害；經(jīng)過(guò)PNS治療后，血清ALT活性明顯下降，說(shuō)明PNS減輕了肝臟的脂肪病變，有保護(hù)肝臟的功能，與之前在大鼠中的報(bào)道相同[6]。AST在本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)生顯著變化，其具體原因還需進(jìn)一步深入研究。

目前對(duì)于高血脂的治療，他汀類藥物是首選藥物，但是研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以使血液中的PCSK9升高。PCSK9基因?yàn)榧易逍愿吣懝檀佳Y的易感基因之一[16]，對(duì)膽固醇的水平有很大的影響[17]， PCSK9通過(guò)降解LDLR而使血液LDL-C水平升高。鑒于此，PCSK9已成為降血脂的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。有報(bào)道顯示PCSK9抑制劑能明顯降低高血脂小鼠血清的TC、TG和LDL-C水平[18]，有望成為降血脂的新藥。本研究中，PNS可使高血脂地鼠肝臟中PCSK9蛋白的表達(dá)水平顯著下降，LDLR蛋白表達(dá)水平顯著上升，表明PNS可能通過(guò)降低PCSK9蛋白表達(dá)，減少LDLR的降解，增加LDLR的含量，促進(jìn)肝臟對(duì)LDL-C的攝取，從而使血脂維持在一個(gè)正常的水平。PNS可使肝臟PCSK9 mRNA表達(dá)有所降低，但是與模型組相比無(wú)顯著差異，這意味著三七總皂苷并沒(méi)有在轉(zhuǎn)錄水平影響PCSK9的表達(dá)，而是從蛋白穩(wěn)定性方面來(lái)影響了PCSK9的蛋白水平。本研究只是做了初步的探討，如想進(jìn)一步確定PCSK9是三七總皂苷降低LDL-C的分子靶點(diǎn)，仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究顯示三七總皂苷可以降低高脂血癥金黃地鼠肝臟中PCSK9蛋白的表達(dá)，升高LDLR蛋白的表達(dá)，通過(guò)PCSK9-LDLR信號(hào)通路減輕脂代謝紊亂，從而降低高脂模型金黃地鼠血清脂類的含量(示意圖見(jiàn)圖7)。

Figure 7. The schematic diagram of panax notoginseng saponins regulating blood lipid level through PCSK9-LDLR pathway
圖7 三七總皂苷通過(guò)PCSK9-LDLR通路調(diào)節(jié)血脂水平示意圖