曾 濤，溫劍虎，王繼相

(1 四川綿陽(yáng)四○四醫(yī)院胸外科， 四川 綿陽(yáng) 621000; 2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科， 重慶 400016)

泛素化是一種多翻譯后特異性修飾過程，其在多種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)控作用，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖，DNA復(fù)制和細(xì)胞凋亡等[1]。越來越多的證據(jù)表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用[2]。在泛素化過程中，泛素連接酶能夠?qū)⒎核胤肿优c目的蛋白連接起來。泛素連接酶含三重基序蛋白25(tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)被認(rèn)為與多種腫瘤有關(guān)，其可能通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)靶向細(xì)胞周期來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]。值得注意的是，TRIM25在具有較低TRIM25表達(dá)的GC細(xì)胞系中的異位表達(dá)能夠顯著促進(jìn)其遷移和侵襲。另一方面，已有報(bào)道顯示胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3，IGF2BP3)也能通過局部翻譯IGF2BP3結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。Choudhury等[5]通過免疫沉淀TRIM25后質(zhì)譜分析暗示了TRIM25和IGF2BP3可能存在相互作用。同時(shí)，食管癌中存在TRIM25低表達(dá)且IGF2BP3高表達(dá)的現(xiàn)象[6]。因此，為了探究TRIM23和IGF2BP3表達(dá)與食管癌EC109細(xì)胞活力的關(guān)系，我們進(jìn)行了如下研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人食管癌細(xì)胞系EC109購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)(貨號(hào) 3111C0001CCC000246)。IGF2BP3和ubiquitin (UB)的質(zhì)粒購(gòu)自北京中原公司(ADDGNE貨號(hào) #19879和#74218)；TRIM25的質(zhì)粒購(gòu)自上海權(quán)陽(yáng)生物有限公司(貨號(hào)TC07931)；Lipofectamine 2000(貨號(hào)11668027)和胎牛血清(貨號(hào)10099-133)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GE Health(貨號(hào)SH30091)；抗IGF2BP3、TRIM25、MYC和HA抗體購(gòu)自CST(貨號(hào) 57145、13773、2276和3724)；Protein A/G免疫沉淀磁珠(貨號(hào)B23201)和蛋白酶抑制劑Cocktail(不含EDTA，mini片劑)購(gòu)自Bimake(貨號(hào)B14011)；蛋白酶體抑制劑MG132購(gòu)自SELLECK(貨號(hào)S2619)；PBS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號(hào)E607008)；青鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)P1400)；2×SDS 蛋白電泳上樣緩沖液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(貨號(hào)WB-0081)；蛋白裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)P0013)；TRIM25的siRNA序列為5’-AGGCUCUGUUCAAUCUCCUC-3’，IGF2BP3的siRNA序列為5’-CCAUAAAUUCUUCCCUGAGC-3’，由上海生工合成。

Western blot裝置(Bio-Rad)；酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱和生物安全柜(Thermo Fisher Scientific)；微量加樣器(Gilson)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；旋轉(zhuǎn)搖床(海門其林貝爾)；脫色搖床(北京大龍)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 將食管癌EC109細(xì)胞分為過表達(dá)TRIM25組、過表達(dá)IGF2BP3組、敲減TRIM25組和敲減IGF2BP3表達(dá)且過表達(dá)TRIM25組。食管癌EC109細(xì)胞維持在含有2 mmol/L L-谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%熱滅活FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在潮濕氣氛(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。環(huán)己酰亞胺(cycloheximide,CHX)以終濃度40 mg/L處理EC109細(xì)胞；MG132以終濃度為5 μmol/L處理EC109細(xì)胞，8 h后收獲細(xì)胞。

2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞。將含目的基因的質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合靜止大約20 min后，緩緩滴入EC109細(xì)胞。于12孔板中實(shí)施劑量依賴性實(shí)驗(yàn)。

2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行10%或12%SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移到Immobilon-P PVDF膜(0.45 μm孔徑)。將PVDF膜在室溫下用含有0.01%Tween-20和5%脫脂奶粉的Tris緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl)封閉1 h，然后在4 ℃下與目的蛋白的抗體溫育過夜。然后將膜在室溫下與綴合有HRP的相應(yīng) II 抗孵育1 h。觀察特定蛋白質(zhì)使用ECL Plus Western blot檢測(cè)系統(tǒng)。

2.4免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) EC109細(xì)胞在1 mL NP-40裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% Nonidet P-40, 10 mg/L抑肽酶，10 mg/L亮抑酶肽和1 mmol/L苯甲基磺酰氟)中裂解。在14 000×g，4 ℃條件下離心15 min，立即將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。用PBS洗滌Protein A/G瓊脂糖珠2次，并制成50% Protein A/G瓊脂糖工作液(PBS中)。 在水平振蕩器上4 ℃振蕩10 min(此步驟旨在消除非特異性結(jié)合蛋白)。在14 000×g、4 ℃條件下離心15 s，將上清液轉(zhuǎn)移到新管中并丟棄Protein A/G瓊脂糖。加入適量的Ⅰ抗至總體積約500 μL。旋轉(zhuǎn)振蕩器上于4 ℃緩慢搖動(dòng)過夜。在14 000×g、4 ℃條件下離心15 s，保持沉淀并用預(yù)先冷卻的洗滌緩沖液(或冷PBS)洗滌3次。加入15 μL SDS-loading buffer，100 ℃水浴5 min后取7 μL進(jìn)行Western blot分析。

2.5MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 第1天用胰蛋白酶消化EC109細(xì)胞，將EC109細(xì)胞稀釋至 7.5×107/L(使用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞)。向96孔板的每孔中加入100 μL細(xì)胞(總共7 500個(gè)細(xì)胞)并孵育過夜。第2天處理細(xì)胞，且最終每孔體積為100 μL。第3天，向每個(gè)孔中加入20 μL MTT(5 g/L),包括一組加入MTT但沒有細(xì)胞的孔(對(duì)照)。在培養(yǎng)箱中37 ℃孵育3.5 h。小心取出96孔板，加入150 μL DMSO，用錫箔覆蓋并在軌道振蕩器上攪拌細(xì)胞15 min。在酶標(biāo)儀中讀取590 nm處的吸光度(A)值。

2.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板中分配100 μL EC109細(xì)胞懸浮液(每孔5 000個(gè))。將板在潮濕的培養(yǎng)箱中預(yù)孵育24 h(37 ℃、5% CO2條件下)。將10 μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)加入板中。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(0 d、1 d、2 d、3 d和4 d)。向板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用library(VIM)中aggr(env, prop=T, numbers=T) 函數(shù)將信息缺失比例大于20%的無效信息可視化后手工剔除，用最高頻率或通過變量的相關(guān)關(guān)系填補(bǔ)缺失值后先錄入Epidata建立數(shù)據(jù)庫(kù)，再導(dǎo)入SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)中組間比較使用三因素方差分析(three-way ANOVA)；蛋白條帶通過ImageJ軟件定量后組間差異采用Student’st檢驗(yàn)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用例數(shù)(n)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過表達(dá)TRIM25抑制食管癌EC109細(xì)胞的活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與vector組相比，轉(zhuǎn)染0.5、1和2 μg HIS-TRIM25后，食管癌EC109細(xì)胞的活力在第2天和第3天受到明顯抑制；且隨著TRIM25表達(dá)量的升高，食管癌EC109細(xì)胞的活力抑制越明顯(P<0.01)，見圖1。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)TRIM25后EC109細(xì)胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明顯抑制(P<0.05);而敲減TRIM25表達(dá)對(duì)EC109細(xì)胞的活力在第2天、第3天和第4天有明顯的促進(jìn)效應(yīng)(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. Over-expression of TRIM25 inhibited the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
圖1 MTT法檢測(cè)過表達(dá)TRIM25對(duì)食管癌EC109細(xì)胞活力的抑制作用

Figure 2. The changes of EC109 cell viability measured by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
圖2 CCK-8法檢測(cè)EC109細(xì)胞活力的變化

2 過表達(dá)IGF2BP3促進(jìn)食管癌細(xì)胞的活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與vector組相比，轉(zhuǎn)染0.5、1和2 μg MYC-IGF2BP3對(duì)食管癌EC109細(xì)胞的活力在第2天和第3天有明顯的促進(jìn)效應(yīng)，且隨著IGF2BP3表達(dá)量的升高,EC109細(xì)胞活力的增高越明顯(P<0.01)，見圖3。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)IGF2BP3后，EC109細(xì)胞的活力在第2天、第3天和第4天明顯增高(P<0.05);敲減IGF2BP3表達(dá)后，EC109細(xì)胞的活力在第2天、第3天和第4天受到明顯抑制(P<0.05)，見圖4。

Figure 3. Over-expression of TRIM25 promoted the viability of EC109 cells (measured by MTT assay). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group at the same time point.
圖3 過表達(dá)TRIM25促進(jìn)食管癌細(xì)胞的活力

Figure 4. The changes of EC109 cell viability detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group at the same time point.
圖4 CCK-8法檢測(cè)EC109細(xì)胞活力的變化

3 敲減IGF2BP3表達(dá)和過表達(dá)TRIM25對(duì)食管癌EC109細(xì)胞的活力無明顯影響

過表達(dá)TRIM25后EC109細(xì)胞的活力受到了抑制(P<0.05)，與前面的結(jié)果相吻合； 敲減IGF2BP3表達(dá)抑制EC109細(xì)胞的活力(P<0.05)，也與前面的結(jié)果相吻合;敲減IGF2BP3表達(dá)的同時(shí)過表達(dá)TRIM25可抑制EC109細(xì)胞的活力，但其抑制程度與單純敲減IGF2BP3表達(dá)的EC109細(xì)胞相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)， 見圖5。

Figure 5. No significant change in the viability of esophageal cancer EC109 cells when knock-down ofIGF2BP3expression and over-expression of TRIM25 measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.
圖5 敲減IGF2BP3表達(dá)同時(shí)過表達(dá)TRIM25對(duì)食管癌細(xì)胞的活力無明顯影響

4 過表達(dá)TRIM25導(dǎo)致IGF2BP3的表達(dá)量減少

當(dāng)梯度過表達(dá)TRIM25時(shí)，內(nèi)源IGF2BP3的表達(dá)量會(huì)梯度減少，提示泛素E3連接酶TRIM25會(huì)對(duì) IGF2BP3進(jìn)行泛素化修飾，且修飾后的IGF2BP3會(huì)被蛋白酶體降解,見圖6。

Figure 6. Over-expression of TRIM25 resulted in reducing IGF2BP3 expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsvector group.
圖6 過表達(dá)TRIM25導(dǎo)致IGF2BP3的表達(dá)量減少

5 過表達(dá)TRIM25后用MG132處理食管癌細(xì)胞，IGF2BP3的表達(dá)量無明顯變化

當(dāng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理食管癌EC109細(xì)胞時(shí)，即使梯度過表達(dá)TRIM25，IGF2BP3的表達(dá)量也沒有減少，見圖7。這表明TRIM25對(duì)IGF2BP3表達(dá)量的影響是蛋白酶體依賴性的。

Figure 7. The expression of IGF2BP3 in EC109 cells treated with MG132 after over-expression of TRIM25. Mean±SD.n=3.
圖7 過表達(dá)TRIM25后用MG132處理食管癌細(xì)胞，IGF2BP3的表達(dá)量無明顯變化

6 TRIM25與IGF2BP3存在相互作用

在只轉(zhuǎn)染HIS-TRIM25和空載體的對(duì)照組中，未能檢測(cè)到TRIM25的存在，只有當(dāng)MYC-IGF2BP3和HIS-TRIM25共轉(zhuǎn)染時(shí)才能檢測(cè)到HIS-TRIM25, 說明TRIM25與IGF2BP3存在相互作用，見圖8。

Figure 8. TRIM25 interacted with IGF2BP3.
圖8 TRIM25與IGF2BP3存在相互作用

7 過表達(dá)TRIM25使IGF2BP3的泛素化程度增加

當(dāng)過表達(dá)TRIM25時(shí)，與未過表達(dá)TRIM25的對(duì)照組相比，免疫沉淀后的IGF2BP3多聚泛素化鏈明顯增加，而未過表達(dá)UB的陰性對(duì)照卻無此種現(xiàn)象，見圖9。這表明過表達(dá)TRIM25會(huì)使IGF2BP3的泛素化程度增加。

Figure 9. Over-expression of TRIM25 increased the degree of ubiquitination of IGF2BP3.
圖9 過表達(dá)TRIM25會(huì)使IGF2BP3的泛素化程度增加

討 論

泛素化過程中，泛素分子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)經(jīng)常在癌細(xì)胞中改變。幾種腫瘤抑制因子和癌基因與泛素-蛋白酶體途徑的相關(guān)酶存在相互作用，并在泛素綴合和解偶聯(lián)中起作用[7]。越來越多的證據(jù)表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)展中起著重要作用。在本研究中，IGF2BP3能被泛素分子修飾，并且經(jīng)UPS降解。

含有三聯(lián)基序的TRIM25也被稱為雌激素反應(yīng)鋅指蛋白，是TRIM蛋白家族的成員[8]。TRIM25含有RING指結(jié)構(gòu)域，2個(gè)B-box結(jié)構(gòu)域和1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，并起到泛素E3連接酶的作用[9]。已經(jīng)在TRIM25基因的3’非編碼區(qū)鑒定出雌激素反應(yīng)元件，且其表達(dá)由雌激素誘導(dǎo)[10]。據(jù)報(bào)道，TRIM25在乳腺癌和卵巢癌中過表達(dá)。但在子宮內(nèi)膜癌中，TRIM25表達(dá)下調(diào)[11-13]。在本研究中，當(dāng)過表達(dá)TRIM25時(shí)，食管癌細(xì)胞的增殖受到抑制，而沉默TRIM25后，食管癌細(xì)胞的增殖和活力受到明顯促進(jìn)。TRIM25在某些腫瘤中低表達(dá)而在另一些腫瘤中又是高表達(dá)，提示腫瘤中的TRIM25是一種雙向調(diào)節(jié)泛素E3連接酶。

RNA結(jié)合蛋白參與RNA成熟，RNA轉(zhuǎn)換，蛋白質(zhì)翻譯，整個(gè)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄物的移動(dòng)等多個(gè)方面[14]。IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3屬于RNA結(jié)合蛋白的保守家族[15]。編碼IGF2BP3的基因最初被鑒定為編碼含有KH結(jié)構(gòu)域的RNA結(jié)合蛋白的基因。IGF2BP3不存在于正常胰腺組織、胰腺良性病變或慢性胰腺炎中[16]，但是該蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌中過表達(dá)。IGF2BP3能結(jié)合mRNA的3’非編碼區(qū)來防止HeLa細(xì)胞中CD44 mRNA的降解[17]。 IGF2BP3還可受IGF2的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并通過PI3K/MAPK通路來誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲[18-19]。在本研究中，過表達(dá)IGF2BP3可促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞的活力，而敲減IGF2BP3表達(dá)使食管癌EC109細(xì)胞的活力受抑制；但敲減IGF2BP3表達(dá)的同時(shí)過表達(dá)TRIM25不會(huì)改變食管癌EC109細(xì)胞的活力；當(dāng)過表達(dá)TRIM25時(shí)，IGF2BP3的表達(dá)量減少，但是用蛋白酶體抑制劑MG132處理可避免此效應(yīng)的產(chǎn)生；并且TRIM25與IGF2BP3存在相互作用。與此同時(shí)，過表達(dá)TRIM25增加IGF2BP3的泛素化程度?；诖?，推測(cè)在食管癌細(xì)胞中，TRIM25通過泛素化修飾IGF2BP3后，IGF2BP3被蛋白酶體識(shí)別并被降解，細(xì)胞中IGF2BP3的蛋白水平減少，PI3K/MAPK通路受到抑制，進(jìn)而最后影響食管癌細(xì)胞的活力。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP3能夠被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。泛素與目的蛋白的共價(jià)結(jié)合主要存在K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63共7種形式，其中，泛素與目的蛋白通過K48的結(jié)合會(huì)被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解[20],提示TRIM25至少會(huì)對(duì)IGF2BP3進(jìn)行K48的泛素化修飾。

雖然本文就TRIM25、IGF2BP3表達(dá)與食管癌EC109細(xì)胞活力關(guān)系作出闡釋，但受研究時(shí)間和工作量的限制，本文未對(duì)TRIM25及IGF2BP3在食管癌瘤組織或細(xì)胞中的表達(dá)模式進(jìn)行深入研究。下一步，我們擬擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)規(guī)模，分析在TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶體降解以此抑制EC109細(xì)胞活力過程中的分子機(jī)制。

綜上所述，TRIM25泛素化IGF2BP3使其被蛋白酶體降解，由此抑制食管癌EC109細(xì)胞的活力。