吳瑞霞，黃 糧，白玉鵬，劉曉剛，胡立群

(武漢市第四醫(yī)院心血管內科， 湖北 武漢 430000)

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)為18～25個核苷酸之間的內源性短鏈非編碼RNA分子，是一類參與細胞凋亡的重要調節(jié)因子[1]。氧化應激誘導的細胞凋亡是導致心肌炎性損傷的主要因素。之前很多研究已經證明miR-153在腫瘤中具有抗腫瘤作用[2]。然而，miR-153是否參與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的心肌細胞損傷過程及機制仍有待闡明。Sorbin和SH3結構域包含蛋白2(Sorbin and SH3 domain-containing protein 2，SORBS2)基因位于4p35.1，在心肌的Z帶表達，為一種銜接蛋白[3-4]。本研究擬以LPS誘導的心肌H9C2細胞為研究對象，檢測其中miR-153和SORBS2的表達，觀察抑制miR-153、過表達或抑制SORBS2對LPS誘導的H9C2細胞活力、炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)及凋亡的影響，揭示其機制與靶向SORBS2有關，將為心臟疾病的治療提供參考。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT和胰蛋白酶均購自Sellect；LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒和逆轉錄試劑盒購自TaKaRa；PVDF膜購自Roche；TNF-α檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液和RIPA蛋白裂解液均購自碧云天生物技術公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。

2 方法

2.1心肌H9C2細胞損傷模型的建立及分組 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎大鼠心肌H9C2細胞，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。參考劉峰等[5]的實驗選用500 μg/L LPS與對數(shù)生長期的H9C2細胞共處理48 h，標記為LPS組。用等劑量的PBS與H9C2細胞共培養(yǎng)48 h，標記為PBS組。運用脂質體將anti-miR-Con、anti-miR-153、pcDNA、pcDNA-SORBS2、anti-miR-153+si-Con和anti-miR-153+si-SORBS2轉染至H9C2細胞，轉染6 h后，在進行LPS誘導處理48 h，分別標記為anti-miR-Con組、anti-miR-153組、pcDNA組、pcDNA-SORBS2組、anti-miR-153+si-Con組和anti-miR-153+si-SORBS2組。

2.2RT-qPCR實驗檢測H9C2細胞中miR-153和SORBS2 mRNA的表達 TRIzol法提取對數(shù)生長期的細胞樣本總RNA,并用Nano-Drop 2000微量分光光度計進行RNA定量。DNaseⅠ消化RNA中可能污染的DNA。逆轉錄反應采用逆轉錄試劑盒方式，操作按照試劑盒說明書進行，合成模板鏈cDNA。按照反應體系進行，反應結束后通過分析Ct值，計算定量結果，以2-ΔΔCt法測定miR-124-3p的相對表達水平。每個樣品重復3次，取平均值，實驗重復2次。miR-124-3p的上游引物序列為5′-GCGGCGGTAAGGCACGCGGTG-3′,下游引物序列為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′;內參照U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;SORBS2的上游引物序列為5′-AAATCACCATGCCCTCTACAAG-3′,下游引物序列為5′-CCCACTTTTATCACCATCGCAA-3′;內參照GAPDH的上游引物序列為5′-GTCAGCCGCATCTTCTTTTG-3′,下游引物序列為5′-GCGCCCCAATACGACCAAATC-3′。

2.3Western blot檢測H9C2細胞中SORBS2的蛋白表達 取適量對數(shù)生長期的H9C2細胞，RIPA裂解后用BCA進行定量，變性離心后取上清進行蛋白上樣。按照Western blot實驗常規(guī)操作流程進行電泳-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-顯影曝光。ImageJ分析目的條帶的灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

2.4ELISA實驗檢測H9C2細胞中TNF-α和IL-6的含量 按TNF-α檢測試劑盒和IL-6檢測試劑盒要求進行TNF-α和IL-6的檢測。每個樣品重復3次，取平均值，實驗重復2次。

2.5流式細胞術檢測H9C2細胞的凋亡 將2.1各轉染組細胞，用 500 μL 的binding buffer懸浮細胞，加入5 μL的annexin V-FITC避光反應20 min后再加入5 μL的PI避光反應20 min，用300目銅篩過濾，最后在1 h內上流式細胞儀結束檢測。細胞的凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個樣品做3個平行實驗，實驗重復2次。

2.6雙螢光素酶報告基因實驗檢測H9C2細胞中miR-153與SORBS2的結合力 取適量對數(shù)生長期的H9C2細胞，按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明書要求進行操作，以psiCHECK2-SORBS2-3’UTR WT和psiCHECK2-SORBS2-3’UTR MUT的表達為對照，觀察miR-153對SORBS2表達的影響。

2.7MTT實驗檢測細胞活力 收集需要檢測的細胞，取105個每孔的密度分別加入96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入MTT試劑再培養(yǎng)4 h，最后加入DMSO結晶紫染色。將酶標儀設置為450 nm波長，檢測細胞的吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。所得實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差(mean±SD)表示，每組數(shù)據(jù)代表3個生物學重復，每個生物學重復包括2個技術重復。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LPS對心肌H9C2細胞miR-153和SORBS2表達的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細胞中miR-153的表達顯著升高，SORBS2的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，見圖1。這表明LPS刺激后心肌H9C2細胞miR-153的表達增加，伴隨SORBS2表達的下調。

Figure 1. The changes of miR-153 and SORBS2 expression in the H9C2 cells. A: the expression level of miR-153 was detected by RT-qPCR; B: the mRNA expression of SORBS2 was detected by RT-qPCR; C: the protein level of SORBS2 was detected by Westerm blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group.
圖1 心肌細胞中miR-153和SORBS2表達的變化

2 敲減miR-153表達對LPS誘導的心肌H9C2細胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著升高；與LPS+anti-miR-con組相比，LPS+anti-miR-153組H9C2細胞中TNF-α和IL-6的含量均顯著降低(P<0.05)，見圖2。這一結果提示miR-153可促進LPS刺激誘導的細胞因子釋放。

Figure 2. The effect of miR-153 on the secretion of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
圖2 miR-153的表達對心肌H9C2細胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響

3 敲減miR-153的表達對LPS誘導心肌H9C2細胞活力和細胞凋亡的影響

與PBS組相比，LPS組H9C2細胞中細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高;與LPS+anti-miR-Con組相比，LPS+anti-miR-153組細胞中細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖3。這一結果提示miR-153可抑制LPS刺激誘導的細胞活力，促進凋亡。

Figure 3. The changes of the viability (A) and apoptosis (B) of the H9C2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group.
圖3 心肌H9C2細胞活力和凋亡的變化

4 miR-153靶向調控SORBS2

運用miRcode數(shù)據(jù)庫預測到miR-153與SORBS2 3’UTR存在結合位點，見圖4A。雙螢光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組相比，miR-153組WT-SORBS2細胞中螢光素酶活性顯著降低，MUT-SORBS2細胞中螢光素酶活性不受影響，見圖4B。與miR-Con組相比，miR-153組細胞中SORBS2表達顯著降低; 與anti-miR-Con組相比，anti-miR-153組細胞中SORBS2表達顯著升高(P<0.05)，見圖4C。上述結果提示，miR-153可靶向調控SORBS2。

Figure 4. miR-153 targeted the 3’UTR of SORBS2 mRNA to regulate its protein expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsmiR-Con group;#P<0.05vsanti-miR-Con group.
圖4 miR-153靶向H9C2細胞SORBS2 mRNA 3’UTR而調控其蛋白表達

5 過表達SORBS2抑制LPS誘導的心肌H9C2細胞炎癥因子分泌和細胞凋亡，提高細胞活力

與LPS+pcDNA組相比，LPS+pcDNA-SORBS2組H9C2細胞中SORBS2的蛋白表達顯著升高，TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖5。這一結果提示SORBS2可抑制LPS誘導的細胞因子釋放和細胞凋亡。

Figure 5. The effects of SORBS2 protein over-expression on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLPS+pcDNA group.
圖5 心肌H9C2細胞SORBS2蛋白過表達對TNF-α和IL-6釋放、細胞活力和凋亡的影響

6 敲減SORBS2的表達可部分抵消抑制miR-153對LPS誘導的心肌H9C2細胞的保護作用

與 LPS+anti-miR-Con組相比，LPS+anti-miR-153組的H9C2細胞中SORBS2蛋白表達顯著升高，TNF-α和IL-6的含量均顯著降低，細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；與LPS+anti-miR-153+si-Con組相比，LPS+anti-miR-153+si-SORBS2組的H9C2細胞中SORBS2蛋白表達顯著降低，TNF-α和IL-6的含量均顯著升高，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖6。上述結果提示，miR-153通過抑制SORBS2的表達，促進LPS誘導的細胞因子釋放和細胞凋亡。

Figure 6. The effects ofSORBS2expression knock-down on the releases of TNF-α and IL-6, cell viability and apoptosis of H9C2 cells with inhibition of miR-153 expression. A: the protein level of SORBS2 was detected by Western blot; B and C: the levels of TNF-α and IL-6 were detected by ELISA; D: the cell viability was detected by MTT assay; E: the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS+anti-miR-Con group;#P<0.05vsLPS+anti-miR-153+si-Con group.
圖6 敲減心肌H9C2細胞中SORBS2表達對抑制miR-153產生的生物學效應的影響

討 論

據(jù)報道，很多miRNA參與了多種心臟疾病的發(fā)展，有報道稱miRNA不僅控制心律失常的發(fā)生，而且還參與心肌細胞死亡的調控[6-8]。此前，miR-153已被證明可以抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移[9-11]。盡管已經在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了幾個靶點，miR-153在心肌細胞中的作用機制仍有待充分闡明。Zou等[12]在心肌缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激下miR-153的表達明顯增加，并且內源miR-153的抑制可減少細胞的凋亡，miR-153抑制氧化應激過程中的自噬，并且Mcl-1小干擾RNA有效地消除了其自噬誘導和凋亡抑制的作用，闡明了miR-153通過細胞凋亡和自噬調節(jié)氧化應激過程中心肌細胞存活的新機制，其與靶向Mcl-1直接介導密切相關，提示miR-153在治療心血管疾病中的潛在臨床價值。本研究構建了LPS誘導的H9C2細胞損傷模型，通過RT-qPCR法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-153的表達異常的升高，這與Zou研究的結果相一致；深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-153可下調炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，促進細胞活力，抑制細胞凋亡，這是首次報道m(xù)iR-153對心肌細胞損傷的炎癥反應和凋亡的影響，為miR-153在心肌損傷中的功能研究及機制探索奠定了基礎，推進了miR-153在心血管疾病中潛在治療價值的進一步深入研究。通過生物信息學分析和雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-153可靶向負調控SORBS2，這說明miR-153的作用與調控下游基因SORBS2有關，揭示了靶向SORBS2為miR-153在心肌細胞中的調控網絡之一。

SORBS2在機體多種組織中廣泛表達，尤其在心臟中表達最高，其參與細胞信號通路、細胞骨架[13]。趙穎等[14]運用高效液相色譜法對先天性心臟患者組織標本進行分析發(fā)現(xiàn)，SORBS2在心臟中的表達量異常升高，且其對先天性心臟病的影響不顯著，但是推測出SORBS2在心肌病變等心臟疾病中具有一定的作用。Kakimoto等[15]發(fā)現(xiàn)，SORBS2在心肌梗死患者組織中表現(xiàn)出異常降低。王惠等[16]通過腹腔注射LPS制造膿毒性心肌病小鼠模型，通過miRNAs芯片篩選發(fā)現(xiàn)，miR-21-3p表達異常升高，且與SORBS2存在內源性靶向調控關系，共同發(fā)揮對小鼠心功能、自噬、線粒體及生存的調控，揭示了miR-21-3p通過靶向抑制SORBS2調控膿毒癥心肌病的發(fā)生發(fā)展。本研究檢測了LPS誘導的H9C2細胞中SORBS2的表達發(fā)現(xiàn)，SORBS2異常降低，這與趙穎、王惠的研究結果相呼應，也是國內外首次公開報道SORBS2在體外炎性心肌細胞中的異常表達，為進一步進行SORBS2的體外功能研究奠定了基礎。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達SORBS2可下調炎性因子TNF-α和IL-6的表達，促進細胞活力，抑制細胞凋亡，這些研究結果說明SORBS2參與炎癥心肌細胞的生長、炎癥及凋亡過程，為研究SORBS2的作用機制提供參考依據(jù)，推測SORBS2具有心血管疾病治療的潛力。此研究還發(fā)現(xiàn)，抑制SORBS2可逆轉抑制miR-153對LPS誘導H9C2細胞抗炎、抗凋亡及提高細胞活力的作用。

綜上所述，miR-153可加重心肌細胞的損傷，其機制與靶向SORBS2有關。本研究可能為心血管疾病的治療提供新靶點。