楚文慶，葛葳，王歡，楊景峰，董武

內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，通遼028000

硒元素是人體和動(dòng)物必需的微量元素，具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，在有機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和預(yù)防疾病過(guò)程中，發(fā)揮著極其重要的作用[1]。硒具有較高的抗氧化作用，其中有機(jī)硒生物利用率較無(wú)機(jī)硒高，且有較低的毒性，從而得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。有機(jī)硒已成功應(yīng)用在飼料領(lǐng)域，常將有機(jī)硒作為添加劑來(lái)補(bǔ)充必需微量元素硒，提高牲畜生產(chǎn)能力。隨著硒與人類健康關(guān)系的深入研究，含硒藥物的研發(fā)也成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，研究主要集中于有機(jī)硒在抗腫瘤、抗炎和抗高血壓等方面的作用[4-5]。然而，對(duì)有機(jī)硒的毒性效應(yīng)和作用機(jī)制的研究尚顯不足。

目前，硒對(duì)環(huán)境的污染和危害已多見(jiàn)報(bào)道。已有研究表明，部分湖水中硒濃度達(dá)到20 μg·L-1，魚類餌料(無(wú)脊椎動(dòng)物)中的硒的質(zhì)量濃度達(dá)到4～13 mg·kg-1(以濕質(zhì)量計(jì))[6]。Muscatello和Janz[7]通過(guò)對(duì)魚群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)魚體出現(xiàn)鰓腫脹、貧血、眼球突出以及脊椎、頭、嘴和鰭條等發(fā)生畸形現(xiàn)象；同時(shí)發(fā)現(xiàn)有機(jī)硒造成了魚類下一代的畸形和缺陷。美國(guó)北卡羅來(lái)納州的Belews湖硒污染事件，是因?yàn)榛鹆Πl(fā)電廠的燃煤中含有大量的硒元素，排放后造成了周邊河流的污染，從20世紀(jì)70年代中期開(kāi)始，含硒污水便源源不斷排入河流，通過(guò)河流進(jìn)入湖中；相比之下，周邊非硒污染的水體，硒質(zhì)量濃度約為Belews湖的1/10～1/20，生物體內(nèi)的硒質(zhì)量濃度約為Belewas湖內(nèi)生物體的1/10～1/50，在Belews湖中生存的20種魚中，除了食蚊魚存活外，其他魚類均已滅亡；由此可見(jiàn)，硒污染造成了嚴(yán)重的毒性效應(yīng)[1]。1986年底，電廠停止排放含硒污水，但是魚類種群的恢復(fù)速度依舊十分緩慢；經(jīng)過(guò)10年時(shí)間，魚類種群雖然有所恢復(fù)，但僅有4種，其中，一種是僅存的食蚊魚，一種是消失后又恢復(fù)的，另外2種是從其他環(huán)境引入的[1]。有關(guān)有機(jī)硒對(duì)水生生物的生態(tài)毒性研究有待深入[8]。

青鳉魚(medaka)作為一種重要的水生動(dòng)物模型，在特定條件下，可以通過(guò)控制飼料和水中有毒物質(zhì)的暴露水平進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。青鳉魚早期發(fā)育時(shí)，身體透明且發(fā)育速度適中，因此，可以有充足的時(shí)間，對(duì)發(fā)育狀況進(jìn)行詳細(xì)的觀察和檢測(cè)[9-11]。使用成年青鳉魚考察有機(jī)硒飼料對(duì)其子代(F1)的影響，有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[12-13]。青鳉魚屬于異性繁殖，其個(gè)體卵泡的卵黃發(fā)生過(guò)程和相關(guān)卵母細(xì)胞的成熟需要72 h以上[14-15]，暴露的時(shí)間至關(guān)重要[16]。在此期間，為成熟的卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和微量元素的飼料可能與觀察到的結(jié)果有關(guān)聯(lián)[12,16]。因此，本研究以青鳉魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，用含有機(jī)硒的飼料飼喂F0代親本(父本單獨(dú)、母本單獨(dú)，以及父本、母本同時(shí))，對(duì)比研究不同暴露條件對(duì)F1代幼魚早期發(fā)育的影響，包括胚胎孵化率、幼魚存活率、畸形類型和畸形率，并通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)上述研究可以獲得有機(jī)硒的傳代毒性數(shù)據(jù)，為有機(jī)硒的健康和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 青鳉魚的培育

青鳉魚由內(nèi)蒙古民族大學(xué)毒物監(jiān)控及毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。將成魚飼養(yǎng)在28 ℃的封閉循環(huán)水系統(tǒng)中，14 h∶10 h的光照/黑暗交替，每天喂食3次商業(yè)干飼料(Pen-tair Aquatic Eco-Systems，Apopka，美國(guó)佛羅里達(dá)州)和2次鹵蟲。青鳉魚繁育已經(jīng)超過(guò)3 a，孵化率達(dá)到85%以上。已經(jīng)成功用于對(duì)各種臟器的毒性研究，包括病理組織學(xué)和基因水平的研究等[17]。

1.2 飼料制備

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)試了含2、10和50 μg·g-1干重(即1 g普通干飼料中含有2、10和50 μg有機(jī)硒)有機(jī)硒的飼料對(duì)青鳉魚胚胎的影響。其中，含2 μg·g-1有機(jī)硒的飼料沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，死亡率增高不明顯；10 μg·g-1處理組中出現(xiàn)畸形的胚胎超過(guò)20%；50 μg·g-1處理組中死亡胚胎個(gè)數(shù)增加。因此，筆者選擇5 μg·g-1的有機(jī)硒濃度進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，并選擇暴露時(shí)間為14 d。

制備含有5 μg·g-1干重硒代-L-甲硫氨酸(西格瑪，美國(guó)，純度98%)的干燥飼料，具體方法如下。首先，配制含有1 mg·mL-1有機(jī)硒的儲(chǔ)備溶液，溶劑為MilliQ水(Millipore，Milli-Q INTEGRAL 5 A10 Water Purification System，美國(guó))。然后，在玻璃培養(yǎng)皿中倒入超過(guò)20 g的干燥飼料，并用刮刀徹底混合以確保液體均勻分布。接著，用刮刀將混合物在培養(yǎng)皿的底部展開(kāi)，以增加表面積促進(jìn)干燥，再將培養(yǎng)皿置于4 ℃的封閉容器中保存。為促進(jìn)飼料干燥，每天將飼料分開(kāi)并攪拌，露出額外的表面區(qū)域進(jìn)行干燥。當(dāng)飼料顆粒處于或非常接近其原始大小后，再繼續(xù)干燥1周。在喂食時(shí)將飼料儲(chǔ)存在密閉容器中，以防止水分進(jìn)入。

1.3 F0代親本暴露方案

暴露方案參照Chernick等[18]的方法進(jìn)行。從繁育群體中隨機(jī)選擇性成熟雄性和雌性青鳉魚(6～9個(gè)月)，將雄性和雌性分離并觀察1周，通過(guò)確認(rèn)可存活的胚胎來(lái)確定個(gè)體的生殖狀態(tài)。將選定的魚轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)缸，并參考自然環(huán)境冬季的光照條件保持9 h∶15 h的光照/黑暗時(shí)間。在3 L的魚缸中分別放入雄性(5 只·缸-1)和雌性(3 只·缸-1)，在24 ℃條件下孵育。實(shí)驗(yàn)缸內(nèi)水體使用前曝氣并過(guò)夜，配制成千分之一鹽水。把魚隨機(jī)分配到4個(gè)組：(1)母本暴露，父本未暴露；(2)母本未暴露，父本暴露；(3)母本暴露，父本暴露；(4)母本未暴露，父本未暴露(對(duì)照)。每組處理3個(gè)重復(fù)。

實(shí)驗(yàn)之前，魚在飼養(yǎng)缸內(nèi)適應(yīng)3 d，喂食時(shí)間表為每天3次，在前2次喂食期間補(bǔ)充無(wú)節(jié)蟲幼體鹵蟲。在適應(yīng)期后，根據(jù)該時(shí)間表將魚喂養(yǎng)14 d，每天加入約1%體重的對(duì)照飼料，鹵蟲液體量減少到每次補(bǔ)充3滴，以確保完全攝入干燥的飼料。暴露14 d后，將成年魚輕輕地從罐中取出并沖洗，將罐徹底清洗，并將補(bǔ)充的其他性別的成魚混合到育種組中。在繁殖期間，魚類保持相同的飼喂時(shí)間表并控制飼料用量，鹵蟲溶液的量恢復(fù)正常以促進(jìn)產(chǎn)卵。每日虹吸臟污及糞便，以保持水體清潔，并減少缸內(nèi)廢物中積累的有機(jī)硒。觀察成魚的正?；顒?dòng)、喂養(yǎng)狀況和應(yīng)激跡象。

1.4 F1代卵的收集和觀察

成魚暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在每次喂食后約20 min時(shí)從缸底部虹吸，每天收集含胚卵，連續(xù)6 d，或者在每天結(jié)束時(shí)直接收集卵塊。將胚胎放在濕潤(rùn)的紙巾上輕輕滾動(dòng)以分離并清潔，然后轉(zhuǎn)移到標(biāo)有收集日期和罐號(hào)的培養(yǎng)皿(VWR International，美國(guó))。對(duì)未受精和受精的胚胎進(jìn)行分別計(jì)數(shù)，并將前者丟棄。受精魚卵置于0.1%(W/V)人工鹽溶液中，每天更換溶液，并在28 ℃的培養(yǎng)箱中保持14 h∶10 h的光照/黑暗循環(huán)，在緩慢移動(dòng)的振蕩器上晃動(dòng)，直至孵化。

根據(jù)Iwamatsu[19]的方法，在立體顯微鏡(Nikon SMZ1500, USA)下每天檢查每個(gè)培養(yǎng)皿中的個(gè)體發(fā)育情況。畸形種類根據(jù)文獻(xiàn)[17,20-21]中所用的標(biāo)準(zhǔn)確認(rèn)，這些類別包括死亡率、孵化時(shí)間、顱頜畸形、頜骨大小和形狀的變化，特別是頭部畸形、心囊與卵黃囊水腫情況、眼睛是否對(duì)稱、色素是否沉積、脊索畸形、血液流通速度，以及在孵化后個(gè)體中鰾是否擴(kuò)充等各種表型，列出各種表型，計(jì)算出表型總和。拍攝受精后3、6和10 d的幼魚，比較對(duì)照組與暴露組胚胎的變化(Nikon, DXM1200，NIS-Elements 3.20.01，日本)。

1.5 軟骨染色

幼魚用質(zhì)量比為10%的甲醛溶液固定24 h后，用質(zhì)量比為0.1%的Alcian blue 8 GX、體積比為80%的甲醇和體積比為20%的醋酸染色6 h，然后用體積比為75%、50%的酒精以及蒸餾水各浸泡3 h，再用0.05%的胰酶飽和四硼酸鹽、質(zhì)量比為1%的KOH和體積比為30%的H2O2各處理1 h，最后在體積比為70%的甘油中保存并觀察。

1.6 蘇木-伊紅染色

使用質(zhì)量比為10%的中性緩沖甲醛溶液固定青鳉魚胚胎于4 ℃過(guò)夜。分別用酒精脫水、二甲苯脫水透明后，用石蠟進(jìn)行包埋處理。包埋后的標(biāo)本作成5 μm的切片，脫石蠟，然后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，用光學(xué)顯微鏡對(duì)標(biāo)本進(jìn)行觀察。

1.7 RNA的提取及基因?qū)崟r(shí)定量PCR(RT-PCR)測(cè)定

RNA提取：采用Trizol法制備總RNA，用Trizol (賽默飛世爾科技(上海)有限公司)裂解細(xì)胞后，加入氯仿并離心使之分為水相和有機(jī)相2層；轉(zhuǎn)移RNA所在的水相，并用異丙醇沉淀RNA，經(jīng)體積比為80%的乙醇洗滌后用水(RNase free)溶解；制備的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測(cè)OD260、OD260/OD280的值，并計(jì)算RNA產(chǎn)量。

反轉(zhuǎn)錄：在體系中加入5×Buffer 4 μL、5 mmoL·L-1dNTP 4 μL、反轉(zhuǎn)錄抑制劑1 μL、AMV (5 U·μL-1)反轉(zhuǎn)錄酶2 μL、特異下游引物1 μL、模板5 μL，最后加焦碳酸二乙酯水(DEPC水)至20 μL；在42 ℃下保持60 min后，冰水中冷卻2 min。

Sybr Green Ι RT-PCR方法的建立：在25 μL反應(yīng)體系中，加入Sybr Green Ι PCR反應(yīng)混合液12.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、水9.5 μL；在95 ℃下保持10 min，然后在95 ℃下保持15 s，60 ℃、1 min條件下反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

內(nèi)參基因選擇以及計(jì)算：試驗(yàn)采用18s作為內(nèi)參基因，采用2-△△CT方法來(lái)計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)10 dpf (days post fertilizaion)的存活率(或孵化、鰾的膨脹情況)進(jìn)行個(gè)體異常發(fā)育的評(píng)估。使用非參數(shù)單向Kruskal-Wallis分析暴露組的顯著差異。在P≤0.05時(shí)，差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

母本、父本單獨(dú)暴露、以及母本、父本同時(shí)暴露于有機(jī)硒后，所產(chǎn)魚卵的生存率顯著低于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的50%以下(P<0.01)，并且死亡率隨時(shí)間推移不斷增加(圖1(a))。在各個(gè)有機(jī)硒暴露組都出現(xiàn)了不同程度的畸形，如心囊水腫、卵黃囊水腫、血液停滯、視網(wǎng)膜色素沉積減弱、鰾開(kāi)啟障礙、單眼、顱面畸形、下頜突出和脊索彎曲(圖2～圖4)等。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，父本、母本單獨(dú)暴露組，以及母本、父本同時(shí)暴露組，與對(duì)照組相比，總畸形率分別是對(duì)照組的4倍、9倍和9.2倍(P<0.01)，且母本單獨(dú)暴露組比父本單獨(dú)暴露組差異更明顯(圖1(b))。

圖1 有機(jī)硒暴露引起F1代青鳉魚胚胎死亡率、總畸形率和軟骨畸形率增高注：M為父本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)為母本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)+M為母本、父本雙方同時(shí)暴露組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；有機(jī)硒飼喂14 d后，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至10 d后進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)分析。Fig. 1 Seleno-L-methionine (Se-Met) causes increased mortality, total deformity and cartilage deformity in medaka embryos of the F1 generationNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; the different letters indicate significant difference (P<0.05); male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, and medaka embryos were continuously collected for 5 times; after 10 d of development, comprehensive statistical analysis was performed.

圖2 有機(jī)硒引起F1代青鳉魚胚胎畸形注：當(dāng)給父本單獨(dú)(M)、母本單獨(dú)(F)或者父本和母本雙方同時(shí)(M+F)飼喂有機(jī)硒14 d后，讓其交配產(chǎn)卵，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至3 d和6 d進(jìn)行鏡下觀察；箭頭在(f)、(g)和(h)圖中分別指示管狀心臟、停止的血流和單眼發(fā)育。Fig. 2 Se-Met causes deformity in medaka embryos of the F1 generationNote: Male-only (M), female-only (F), and male and female (F+M) of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 3 d and 6 d; the arrows indicate the tubular heart, stopped blood, and monocular development in (f), (g), and (h), respectively.

圖3 有機(jī)硒引起F1代青鳉魚幼魚水腫注：(a) 對(duì)照組，(b) 母本、父本雙方同時(shí)暴露組；有機(jī)硒飼喂14 d后，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至10 d進(jìn)行鏡下觀察；(b)中箭頭指示眼球周邊水腫，**指示卵黃囊水腫。Fig. 3 Se-Met causes edema in larva of the F1 generation medakaNote: (a) control group, (b) exposure group (male and female); male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 10 d; arrows in (b) indicate edema around the eyeball, and **indicates edema of the yolk sac.

圖4 有機(jī)硒引起F1代青鳉魚幼魚下頜突出注：(a)和(c) 對(duì)照組，(b)和(d)母本、父本雙方同時(shí)暴露組；有機(jī)硒飼喂14 d后，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至10 d進(jìn)行鏡下觀察；h表示心臟，紅色箭頭指示畸形的下頜。Fig. 4 Se-Met causes jaw protrusion in larva of the F1 generation medakaNote: (a) and (c) control group, (b) and (d) exposure group (male and female); male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and microscopic observation at 10 d; h indicates heart, and the red arrow indicates the deformed lower jaw.

在眾多畸形中，下頜骨延伸尤為突出(圖4(b)和(d))，與對(duì)照組相比，頭部發(fā)育畸形和下頜畸形的發(fā)生率在各暴露組具有顯著差異(P<0.05)，父本、母本單獨(dú)暴露組，以及母本、父本雙方同時(shí)暴露組中畸形率分別為對(duì)照組的7倍、9倍和10倍(P<0.01)(圖1(c))，其中，母本單獨(dú)暴露組和母本、父本雙方同時(shí)暴露組比父本單獨(dú)暴露組的畸形發(fā)生率更高。經(jīng)過(guò)組織切片結(jié)果確認(rèn)，下頜鰓弓出現(xiàn)顯著的增生(圖4(b)和(d))。經(jīng)過(guò)軟骨染色，也能夠檢測(cè)到下頜與顱面軟骨的變形(圖5(f)、(g)和(h))和脊索彎曲(圖5(c)和(d))。

為查明軟骨畸形出現(xiàn)的機(jī)制，本研究進(jìn)行了軟骨關(guān)聯(lián)基因的檢測(cè)，包括SOX9a、SOX9b和Collagen2a1。結(jié)果表明，SOX9a的表達(dá)在各個(gè)組間沒(méi)有顯著差異，但各暴露組都有增高的趨勢(shì)，而SOX9b基因表達(dá)在父本單獨(dú)暴露時(shí)沒(méi)有顯著差異，母本單獨(dú)暴露以及母本、父本雙方同時(shí)暴露時(shí)都出現(xiàn)顯著的增高，分別是對(duì)照組的2.6倍和2.57倍(P<0.05)(圖6(a)和(b))。SOX9s下游基因，與軟骨合成直接相關(guān)的Collagen2a1，在各個(gè)暴露組都出現(xiàn)顯著的表達(dá)增高，都達(dá)到對(duì)照組的4倍以上(P<0.05)(圖6(c))。

圖5 有機(jī)硒對(duì)F1代青鳉魚幼魚骨骼的影響注：M為父本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)為母本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)+M為母本、父本雙方同時(shí)暴露組；有機(jī)硒飼喂14 d后，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至10 d進(jìn)行阿爾新蘭軟骨染色，鏡下觀察；紅色箭頭指示下頜。Fig. 5 Effect of Se-Met on the larva’s bone of the F1 generation medakaNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, medaka embryos were continuously collected for 5 times, and Alcian blue cartilage staining was performed when the embryo developed to 10 d; the red arrow indicates the lower jaw.

圖6 有機(jī)硒誘導(dǎo)F1代青鳉魚幼魚骨骼關(guān)聯(lián)基因表達(dá)的增加注：M為父本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)為母本單獨(dú)暴露組，F(xiàn)+M為母本、父本雙方同時(shí)暴露組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；有機(jī)硒飼喂14 d后，連續(xù)收集青鳉魚卵5次，發(fā)育至10 d后進(jìn)行RT-PCR。Fig. 6 Se-Met induces an increase in bone-associated gene expression in the larva of the F1 generation medakaNote: M. Paternal exposure group, F. Maternal exposure group, F+M. Maternal and patental exposure group; the different letters indicate significant difference (P<0.05); male-only, female-only, and male and female of F0 parental medaka were fed with Se-Met for 14 d, and medaka embryos were continuously collected for 5 times, and RT-PCR was performed when the embryo developed to 10 d.

3 討論(Discussion)

單獨(dú)喂飼母本、父本，或同時(shí)飼喂母本、父本有機(jī)硒，均會(huì)造成F1代生存率的降低，后代畸形的發(fā)生率顯著增加，尤其是造成了不同形態(tài)的軟骨畸形和發(fā)育障礙；這種軟骨發(fā)育障礙，與SOX9b和Collagen2a1 mRNA表達(dá)的升高有密切關(guān)聯(lián)。F1代畸形率增高強(qiáng)度依次為母本、父本同時(shí)飼喂組，母本單獨(dú)飼喂組，父本單獨(dú)飼喂組。其中，父本單獨(dú)暴露組出現(xiàn)畸形的種類較多。結(jié)果表明，不同性別飼喂過(guò)量有機(jī)硒，其后代的畸形種類和畸形率是不同的。過(guò)量飼喂有機(jī)硒對(duì)母本和父本都有生殖和發(fā)育毒性。

小型魚幼魚心囊水腫以及卵黃囊水腫是一種常見(jiàn)的毒性癥狀，出現(xiàn)在很多污染物質(zhì)的暴露效應(yīng)中。有機(jī)硒的暴露同樣造成心囊、卵黃囊水腫[13,17,22]。筆者在3 d和6 d時(shí)，觀察到嚴(yán)重的心囊水腫(圖2(c)和(f))，在10 d時(shí)觀察到卵黃囊水腫(圖3(b))。同時(shí)觀察到血液停滯圖2(g))，這與之前的報(bào)道一致[18]。

F1代青鳉幼魚出現(xiàn)高頻率顱面畸形，以及下頜的凸起或者變形。尤其發(fā)生在母本、父本青鳉成魚同時(shí)飼喂高濃度有機(jī)硒的暴露組中，其次是單獨(dú)母本或者父本飼喂高濃度有機(jī)硒暴露組。類似的顱面畸形和下頜畸形在黑鱒中也觀察到，雖然這種畸形不直接致命，但會(huì)影響口腔開(kāi)合，也可能會(huì)影響呼吸[23]。這種特異性顱面畸形表型也提示有機(jī)硒飼喂對(duì)母本和父本骨骼基因表達(dá)產(chǎn)生一定影響[24]。

本研究結(jié)果表明，有機(jī)硒能夠促進(jìn)SOX9a、SOX9b和Collagen2a1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。骨骼發(fā)育中SOX9家族基因是成骨細(xì)胞/軟骨細(xì)胞的關(guān)聯(lián)基因，SOX9還可以結(jié)合并激活Collagen2基因的轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)產(chǎn)物被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物[25]。青鳉魚有2種SOX9基因(SOX9a和SOX9b)，在軟骨組織中表達(dá)[26]。初步可以推測(cè)，由于軟骨組織的產(chǎn)生增加，SOX9a和SOX9bmRNA的表達(dá)水平升高造成了下頜骨突出、脊索和尾部畸形彎曲。

有機(jī)硒經(jīng)由小腸進(jìn)入血液，再次進(jìn)入肝臟和骨骼肌，但沒(méi)有觀察到有機(jī)硒在卵巢或睪丸中蓄積[27]。這也許是因?yàn)楸┞稌r(shí)間短尚沒(méi)有造成大量的有機(jī)硒累積。Thomas和Janz[28]報(bào)道了斑馬魚成熟魚卵中的有機(jī)硒并沒(méi)有集中在卵巢中的現(xiàn)象。有機(jī)硒也可直接經(jīng)由青鳉魚母本滲透到魚卵中[12]。有關(guān)魚卵中有機(jī)硒的濃度和分布，仍需進(jìn)一步研究。組織切片分析結(jié)果表明，有機(jī)硒可能造成精原細(xì)胞質(zhì)量降低和精子凋亡[29]。

綜上所述，與青鳉魚母本或父本單獨(dú)暴露組相比，母本、父本同時(shí)暴露組會(huì)有更多個(gè)體出現(xiàn)畸形，并有更多的外觀表型種類。父本單獨(dú)飼喂有機(jī)硒組出現(xiàn)了非常多的特異表型，這說(shuō)明，父本暴露也會(huì)有很大風(fēng)險(xiǎn)。有機(jī)硒的過(guò)量攝入對(duì)青鳉魚F1代的毒性與軟骨發(fā)育通路障礙相關(guān)。