李曉東，袁思亮，李俊，劉春生

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070

環(huán)境中的多種化合物具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，能夠干擾生物體正常的內(nèi)分泌功能，對(duì)個(gè)體及其子代產(chǎn)生不良影響，而類雌激素效應(yīng)物質(zhì)是環(huán)境中最主要的內(nèi)分泌干擾物。長(zhǎng)期以來(lái)，由于環(huán)境雌激素濃度低、急性毒性小等特點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)不為人們所重視[1]。近些年來(lái)，由于環(huán)境介質(zhì)中雌激素物質(zhì)濃度的逐步升高，釋放到環(huán)境中的雌激素效應(yīng)物質(zhì)可能會(huì)干擾生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)[2]。畜禽養(yǎng)殖是產(chǎn)生雌激素的重要來(lái)源，更值得引起注意的是，由于活禽養(yǎng)殖的糞便被用作土壤肥料，因此造成環(huán)境雌激素的廣泛分布，且在眾多環(huán)境雌激素中，17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)具有較高的生物活性[3]。E2作為最典型的雌激素效應(yīng)物質(zhì)，大量應(yīng)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，并在環(huán)境中被頻繁地檢測(cè)到且具有較高的環(huán)境濃度。與其他污染物類似，E2首先在污水廠進(jìn)出水口中被檢測(cè)到。在德國(guó)污水處理廠中，檢測(cè)到E2的最高濃度為19 ng·L-1[4]，巴西、意大利和以色列污水處理廠中檢測(cè)到的E2濃度分別為21、16.1和141.9 ng·L-1[5-6]。在中國(guó)沿海地區(qū)，檢測(cè)3家污水處理廠進(jìn)出水口的E2濃度，范圍分別為39.6～90.1 ng·L-1和2.2～54.6 ng·L-1[7-8]。在對(duì)地表徑流的檢測(cè)中，E2在日本和美國(guó)河流中的濃度為1.8～2.1 ng·L-1[9]和9 ng·L-1[10]。在中國(guó)天津地區(qū)的3條河流以及珠江檢測(cè)到E2最高濃度分別為32.4 ng·L-1[11]和7.5 ng·L-1[12]。

大量的毒理學(xué)研究證明，水環(huán)境中的雌激素物質(zhì)對(duì)魚類[13]和兩棲類[14]等水生脊椎動(dòng)物有發(fā)育毒性、生殖毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)等多種毒性效應(yīng)。李國(guó)超等[15]報(bào)道E2暴露能夠引起斑馬魚中雌性比例上升，并上調(diào)部分雌性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)部分雄性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。侯彥峰等[16]報(bào)道0.1 ng·L-1E2暴露導(dǎo)致日本青鳉肝臟內(nèi)卵黃蛋白原基因轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。樹蛙暴露于E2導(dǎo)致間性個(gè)體的出現(xiàn)并干擾肝臟中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[17]。徐偉等[18]報(bào)道6月齡非洲爪蛙暴露于2.72 μg·L-1E2中6 d，可導(dǎo)致雌性個(gè)體輸卵管發(fā)生形態(tài)改變。目前，有關(guān)水體雌激素風(fēng)險(xiǎn)或危害評(píng)價(jià)研究大多集中在高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的水生脊椎動(dòng)物中[19]，而其對(duì)低營(yíng)養(yǎng)級(jí)水生無(wú)脊椎動(dòng)物的毒性效應(yīng)缺乏系統(tǒng)性的研究和分子機(jī)制上的探究。

大型溞(Daphniamagna)是一類小型的枝角類浮游甲殼動(dòng)物，廣泛分布于亞洲、歐洲、北美洲以及非洲[20-21]，其生命周期和繁殖周期短，繁殖量大，在環(huán)境條件良好的狀況下進(jìn)行孤雌生殖，是一種模式毒理學(xué)生物[22]。大型溞作為低等的水生生物，處在水環(huán)境食物鏈的中間位置，占據(jù)重要生態(tài)位。因此，有關(guān)大型溞毒性效應(yīng)的研究對(duì)整個(gè)水生環(huán)境食物鏈具有一定的參考作用[23]。Brennan等[24]報(bào)道了E2對(duì)大型溞的48 h半致死濃度(48 h-LC50)為2.87 mg·L-1，且1.0 mg·L-1E2暴露21 d顯著降低大型溞存活率至60%，同時(shí)E2暴露對(duì)大型溞的累積蛻皮個(gè)數(shù)與累積產(chǎn)卵個(gè)數(shù)沒(méi)有顯著性影響。李根[25]報(bào)道了1.28 mg·L-1E2急性暴露抑制了大型溞抗氧化酶的活性，但是21 d慢性暴露對(duì)其平均繁殖次數(shù)和產(chǎn)溞數(shù)沒(méi)有顯著性影響。Torres等[26]報(bào)道了在巴西Piracicaba河流中E2的濃度為137 ng·L-1，進(jìn)一步揭示河水中的E2對(duì)大型溞有較低的急性毒性風(fēng)險(xiǎn)并強(qiáng)調(diào)開展慢性E2暴露的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的必要性。已有的有關(guān)E2對(duì)大型溞毒性效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究?jī)H僅統(tǒng)計(jì)了部分表觀指標(biāo)的改變，而未涉及分子機(jī)制上的探究?；诖耍狙芯吭诳偨Y(jié)已有文獻(xiàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探究E2對(duì)大型溞的發(fā)育和生殖等的毒性效應(yīng)以及相應(yīng)的分子機(jī)制，選擇0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1為E2的暴露濃度，開展了為期21 d的慢性暴露實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間，統(tǒng)計(jì)并分析了大型溞存活率、累積產(chǎn)溞量、累積蛻皮個(gè)數(shù)、母代與子代體長(zhǎng)、母代與子代游泳速度等終點(diǎn)指標(biāo)，并利用熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)評(píng)估了大型溞發(fā)育和生殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，在分子機(jī)制上探討了E2對(duì)大型溞毒性效應(yīng)的機(jī)理。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

E2購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，CAS號(hào)為50-28-2，純度>97%。有機(jī)助溶劑二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CAS號(hào)為67-68-5，純度>99%。實(shí)驗(yàn)前，取不同量的E2溶解于DMSO中，制備成相應(yīng)濃度的貯備液，存放于4 ℃。RNA提取所需的RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent kit及熒光定量試劑SYBR?Primex Ex TaqTMⅡ購(gòu)自中國(guó)TaKaRa公司。此外，RNA提取所用氯仿(CAS號(hào)67-66-3)、異丙醇(CAS號(hào)67-63-0)和無(wú)水乙醇(CAS號(hào)64-17-5)均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 大型溞的培養(yǎng)

本研究所用大型溞已在本實(shí)驗(yàn)室中連續(xù)培養(yǎng)多代，日常持續(xù)培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱中，并設(shè)置培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度為(22±1)℃，光照/黑暗時(shí)長(zhǎng)比為16 h/8 h。大型溞培養(yǎng)所用水體為連續(xù)曝氣48 h的過(guò)濾自來(lái)水。以小球藻(Chlorellapyrenoidosa)和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)的混合液喂食大型溞，喂養(yǎng)密度為4.5×104cells·mL-1，待到大型溞開始產(chǎn)卵后喂食9.0×104cells·mL-1的小球藻和斜生柵藻的混合液，每天上午喂食一次，每次投喂2 mL。

1.3 慢性暴露實(shí)驗(yàn)

慢性暴露實(shí)驗(yàn)在1 L的玻璃燒杯中進(jìn)行，按照OECD Test Guideline 211[27]相關(guān)指導(dǎo)方案。因?yàn)锽rennan等[24]報(bào)道了E2對(duì)大型溞48 h-LC50為2.87 mg·L-1，并且1.0 mg·L-1E2對(duì)大型溞21 d慢性暴露沒(méi)有引起顯著性效應(yīng)。因此，為了探究不同濃度范圍的E2暴露對(duì)大型溞的影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)濃度梯度，分別為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行。采用OECD Test Guideline 211[27]指導(dǎo)方案中的半靜態(tài)暴露方法，暴露液每2 d更換一次，每個(gè)平行燒杯中含有900 mL暴露液和30只幼溞(<24 h)，對(duì)照組和處理組中DMSO濃度均為0.1‰，暴露時(shí)間為21 d。暴露期間每天統(tǒng)計(jì)大型溞的死亡個(gè)數(shù)、產(chǎn)溞數(shù)以及蛻皮個(gè)數(shù)，并繪制累積蛻皮曲線和累積產(chǎn)卵曲線。

1.4 體長(zhǎng)測(cè)量與游泳速度檢測(cè)

在暴露的第7、14和21天每個(gè)暴露缸取10只溞用于體長(zhǎng)的測(cè)定，在第21天取10只(<24 h)子一代小溞，用于體長(zhǎng)的測(cè)定，使用軟件Image Pro Plus和LEICA DFC450C(德國(guó))測(cè)量體長(zhǎng)，用動(dòng)物行為儀DanioVision(荷蘭Noldus公司)檢測(cè)F0、F1代游泳速度。檢測(cè)用24孔板，每個(gè)暴露缸取4只溞，每個(gè)孔板中放置1只溞，每個(gè)濃度組共12個(gè)平行。檢測(cè)程序設(shè)置為25 min，包括5 min黑暗適應(yīng)時(shí)間和2個(gè)10 min的光暗循環(huán)，每個(gè)光暗循環(huán)包括5 min光照時(shí)間和5 min黑暗時(shí)間，在每個(gè)5 min光照或黑暗時(shí)長(zhǎng)中間給予一個(gè)輕拍刺激。

1.5 qRT-PCR

21 d暴露結(jié)束后，每個(gè)暴露缸取10只溞，用TRIzol法提取總RNA，所提取的RNA用Epoch Microplate分光光度計(jì)(美國(guó)BioTek Instruments, Inc.公司)進(jìn)行純度檢驗(yàn)。檢驗(yàn)方法根據(jù)RNA樣品在260 nm/280 nm波長(zhǎng)下的比值，若比值在1.90～2.10之間，則確定所得RNA的純度較高，可以用于反轉(zhuǎn)錄。RNA的濃度則根據(jù)260 nm波長(zhǎng)下的吸光度數(shù)值確定，將所提取的RNA在200 μL EP管中稀釋至100 ng·L-1。反轉(zhuǎn)錄使用Prime Script RT reagent kits (中國(guó)Takara公司)試劑，所需RNA的量為500 ng。將反轉(zhuǎn)錄所需所有試劑配制為10 μL體系，具體試劑用量如下：5× Prime Script Buffer (for real time) 2 μL、Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo dT Primer (50 μmol·L-1) 0.5 μL、Random 6 mers (100 μmol·L-1) 0.5 μL、RNase Free dH2O 1.5 μL和Total RNA 5 μL。反轉(zhuǎn)錄體系加樣完成后，經(jīng)離心后放置在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR儀反應(yīng)條件設(shè)置如下：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反應(yīng)完成后得到cDNA，在200 μL EP管中加入RNase Free dH2O 90 μL，cDNA被稀釋10倍，均勻混合后置于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。qRT-PCR使用SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits(中國(guó)Takara公司)試劑。根據(jù)SYBR Green Primex Ex TaqⅡ kits試劑盒說(shuō)明，配制20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green Mix試劑10 μL、DEPC水6 μL、ROX Reference Dye試劑0.4 μL、Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL和cDNA 2 μL。將此20 μL體系置于qRT-PCR專用96孔板中，每個(gè)濃度組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)暴露缸中的10只溞混樣為一個(gè)平行。qRT-PCR擴(kuò)增條件設(shè)置為：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；共計(jì)40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用CT值計(jì)算，采用2-△△CT法分析。實(shí)驗(yàn)所選取的與蛻皮和生殖有關(guān)基因選自相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道[28-33]，如表1所示。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的研究，在雌激素物質(zhì)暴露中，ubc的轉(zhuǎn)錄水平更為穩(wěn)定[28]，因此本實(shí)驗(yàn)選定ubc為內(nèi)參基因。

表1 大型溞生殖和發(fā)育有關(guān)基因引物序列Table 1 The primer sequences of the genes related to the reproduction and development of Daphnia magna

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0(SPSS, 芝加哥)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)方法中的Tukey’s多量程檢驗(yàn)來(lái)確認(rèn)對(duì)照組與暴露組之間的顯著差異，P<0.05定義具有顯著性差異。所有的數(shù)據(jù)結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所有圖片均用軟件Prism Graphpad6繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 E2慢性暴露的致死率

如圖1所示，21 d暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1暴露組大型溞存活率分別為97.78%±1.92%、97.78%±1.92%、98.89%±1.92%、93.33%±6.67%和71.11%±17.10%。與對(duì)照組相比，1 360 μg·L-1暴露組大型溞的存活率顯著降低，對(duì)大型溞的致死效應(yīng)顯著。

圖1 17β-雌二醇(E2) 21 d暴露對(duì)大型溞的致死效應(yīng)注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 1 The lethal effect of 17β-estradiol (E2) exposure on Daphnia magna after exposure for 21 dNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.2 E2暴露的發(fā)育毒性

2.2.1 E2暴露對(duì)累積蛻皮個(gè)數(shù)的影響

如圖2(a)所示，E2暴露21 d后，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1暴露組中，平均每只溞的累積蛻皮個(gè)數(shù)分別為(9.16±0.05)、(8.89±0.05)、(9.00±0.10)、(8.91±0.13)和(8.37±0.28)個(gè)。與對(duì)照組相比，1 360 μg·L-1暴露組平均累積蛻皮個(gè)數(shù)降低了8.62%，表明E2暴露能夠顯著地抑制大型溞的蛻皮，減緩其發(fā)育過(guò)程。

2.2.2 E2暴露對(duì)大型溞F0代體長(zhǎng)及游泳速度的影響

如圖2(b)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個(gè)暴露組在第7天時(shí)體長(zhǎng)分別為(2.41±0.13)、(2.38±0.15)、(2.36±0.13)、(2.33±0.20)和(2.12±0.28) mm。E2暴露對(duì)大型溞體長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴性抑制效應(yīng)，并且1 360 μg·L-1暴露組中大型溞F0代體長(zhǎng)受到顯著抑制。但是在第14天和第21天時(shí)暴露組與對(duì)照組相比體長(zhǎng)均沒(méi)有受到顯著性抑制效應(yīng)，說(shuō)明E2對(duì)大型溞生長(zhǎng)發(fā)育早期有明顯抑制效應(yīng)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，暴露組與對(duì)照組之間的差異逐漸減小。1 360 μg·L-1暴露組與對(duì)照組相比，體長(zhǎng)雖有所減少，但已經(jīng)沒(méi)有顯著性差異。

如圖2(c)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個(gè)暴露組中，F(xiàn)0代游泳速度分別為(0.52±0.04)、(0.46±0.10)、(0.53±0.06)、(0.55±0.07)和(0.47±0.03) cm·s-1。所有暴露組與對(duì)照組相比，速度均無(wú)顯著性差異。

圖2 E2的21 d暴露對(duì)大型溞發(fā)育的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；**代表P<0.01，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 2 The effect of E2 exposure on the development of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; ** represented that the exposure group had significant difference at P<0.01 level when compared with control.

2.3 E2暴露的生殖毒性

2.3.1 E2暴露對(duì)大型溞幼溞產(chǎn)量的影響

如圖3(a)所示，暴露21 d后，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個(gè)暴露組中，平均每只母溞的累積產(chǎn)溞量分別為(13.50±0.68)、(12.96±0.91)、(11.41±0.37)、(13.16±1.38)和(18.28±1.39)個(gè)。與對(duì)照組相比，1 360 μg·L-1暴露組大型溞平均累積產(chǎn)溞量顯著提高35.40%，表明E2暴露能夠顯著增加大型溞產(chǎn)溞量，干擾大型溞的生殖。

2.3.2 E2暴露對(duì)大型溞F1代體長(zhǎng)和游泳速度的影響

如圖3(b)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個(gè)暴露組中，F(xiàn)1代體長(zhǎng)分別為(0.84±0.05)、(0.87±0.04)、(0.87±0.05)、(0.85±0.04)和(0.82±0.03) mm。與對(duì)照組相比，暴露組F1代體長(zhǎng)并無(wú)顯著性差異。

如圖3(c)所示，0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1這5個(gè)暴露組中，F(xiàn)1代游泳速度分別為(0.52±0.04)、(0.46±0.10)、(0.53±0.06)、(0.55±0.07)和(0.47±0.03) cm·s-1。與對(duì)照組相比，暴露組F1代游泳速度無(wú)顯著性差異。

圖3 E2的21 d暴露對(duì)大型溞生殖的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 3 The effect of E2 exposure on the reproduction of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

2.4 E2暴露對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

如圖4(a)所示，在與大型溞發(fā)育有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄中，1 360 μg·L-1E2暴露顯著性地降低了大型溞蛻皮激素代謝相關(guān)基因cyp18a1(0.42±0.04)和蛻皮激素受體基因hr3(0.52±0.16)的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也降低了大型溞表皮蛋白合成基因cut(0.70±0.66)，并促進(jìn)了表皮蛋白代謝基因cht(2.05±1.11)和cht3(1.60±0.74)的轉(zhuǎn)錄，但是與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。在與大型溞生殖有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄中，如圖4(b)所示，所有暴露組中生殖相關(guān)基因vtg1、vtg2和vmo1的轉(zhuǎn)錄均與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

圖4 E2的21 d暴露對(duì)大型溞發(fā)育(a)和生殖(b)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響注：E2濃度為0、1.36、13.6、136和1 360 μg·L-1；數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；*代表P<0.05，與對(duì)照組相比有顯著性差異。Fig. 4 The effect of E2 exposure on the transcriptions of genes relevant to development (a) and reproduction (b) of Daphnia magnaNote: The concentrations of E2 are 0, 1.36, 13.6, 136, 1 360 μg·L-1; data was represented by mean±standard deviation; *represented that the exposure group had significant difference at P<0.05 level when compared with control.

3 討論(Discussion)

本研究依據(jù)OECD Test Guideline 211[27]測(cè)試方法，評(píng)價(jià)了E2對(duì)大型溞存活、發(fā)育和生殖的影響。結(jié)果表明，只有最高濃度組(1 360 μg·L-1E2)中，暴露21 d后大型溞會(huì)有顯著死亡，其死亡率約為30%，說(shuō)明高濃度E2對(duì)大型溞有顯著致死效應(yīng)。Brennan等[24]曾報(bào)道1.0 mg·L-1E2暴露21 d可對(duì)大型溞產(chǎn)生40%的致死率，與本研究結(jié)果基本一致。李根[25]探究了E2急性暴露對(duì)大型溞抗氧化酶系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)0.64 mg·L-1E2暴露48 h會(huì)抑制大型溞幼溞過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等抗氧化酶的活性，這說(shuō)明E2暴露可能會(huì)通過(guò)影響大型溞氧化應(yīng)激水平，降低大型溞的存活率。

蛻皮是大型溞生殖和發(fā)育所必需的重要生理過(guò)程，蛻皮后大型溞體長(zhǎng)增加，卵囊空間增大，有利于其生長(zhǎng)和產(chǎn)卵[34]。本研究結(jié)果表明，E2顯著地抑制

了大型溞的平均累積蛻皮個(gè)數(shù)，此外，E2暴露7 d顯著抑制了F0代大型溞的個(gè)體生長(zhǎng)，但是隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組體長(zhǎng)之間的差異逐漸縮小，這說(shuō)明E2可能對(duì)大型溞早期發(fā)育抑制效應(yīng)更為顯著，從而導(dǎo)致其發(fā)育減緩。對(duì)于E2的生殖毒性，本研究表明，E2暴露會(huì)導(dǎo)致大型溞21 d累積產(chǎn)溞數(shù)顯著升高，但對(duì)F1子代的個(gè)體生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)行為沒(méi)有影響。這說(shuō)明，E2能干擾F0代大型溞的生殖能力，但E2的母代暴露不會(huì)影響子代的發(fā)育。相關(guān)研究用1 mg·L-1E2連續(xù)染毒兩代大型溞，發(fā)現(xiàn)F0代產(chǎn)溞量沒(méi)有顯著變化，但是暴露至F1代時(shí)，其產(chǎn)溞量與F0代相比，顯著性降低[30]。本研究與此研究結(jié)果的差異可能是由暴露方式和濃度不同導(dǎo)致的，但兩者均說(shuō)明E2暴露會(huì)對(duì)大型溞產(chǎn)生生殖毒性。

為進(jìn)一步探究E2對(duì)大型溞毒性效應(yīng)的分子機(jī)制，本研究利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)大型溞蛻皮和生殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了評(píng)價(jià)。大型溞蛻皮主要受20-羥基蛻皮激素(20-HE)的直接控制[35]，并且蛻皮激素在蛻皮過(guò)程中的代謝對(duì)大型溞的蛻皮至關(guān)重要[36]。在大型溞中，cyp18a1負(fù)責(zé)編碼將蛻皮激素20-HE催化成26-羧基酸的酶[36]，因此，cyp18a1轉(zhuǎn)錄結(jié)果的降低會(huì)干擾大型溞蛻皮激素20-HE的正常代謝。蛻皮激素20-HE與蛻皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)共聚物結(jié)合后引發(fā)蛻皮激素受體基因hr3的轉(zhuǎn)錄[37]。蛻皮激素受體基因hr3是引發(fā)蛻皮激素下游信號(hào)通路的非常關(guān)鍵的基因，當(dāng)沉默hr3基因時(shí)，可以導(dǎo)致蛻皮的延遲和失敗[38-39]。在本研究中，E2暴露顯著地降低了cyp18a1及hr3這2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，這與1 360 μg·L-1E2處理組中累積蛻皮個(gè)數(shù)減少的結(jié)果一致。在大型溞中，一個(gè)完整的蛻皮過(guò)程包括舊有的表皮水解、角質(zhì)蛋白分泌、舊蛋白水解與重吸收、舊表皮脫落以及新的表皮形成等過(guò)程[39]。其中，cut基因負(fù)責(zé)角質(zhì)蛋白的生成[37]，cht和cht3基因負(fù)責(zé)水解角質(zhì)蛋白[31]。本研究中，E2暴露導(dǎo)致cut轉(zhuǎn)錄的下調(diào)和cht轉(zhuǎn)錄的上調(diào)，繼而可能導(dǎo)致了大型溞舊表皮水解和新角質(zhì)蛋白分泌過(guò)程被干擾，最終減少了大型溞蛻皮個(gè)數(shù)，抑制了大型溞的蛻皮。Zou和Fingerman[40]曾指出，在大型溞中，具有多個(gè)苯環(huán)的外源性化學(xué)物質(zhì)可以與蛻皮激素受體結(jié)合，對(duì)內(nèi)源性蛻皮激素產(chǎn)生拮抗作用，干擾正常的蛻皮過(guò)程[40]。Mu和Leblanc[41]總結(jié)了他們之前的研究，認(rèn)為能夠表現(xiàn)出干擾蛻皮激素代謝或者與蛻皮激素產(chǎn)生拮抗效應(yīng)的外源性化學(xué)物質(zhì)對(duì)大型溞可以表現(xiàn)出蛻皮抑制和生殖干擾作用[41-44]。然而，qRT-PCR結(jié)果顯示，E2暴露并未對(duì)大型溞生殖相關(guān)基因vtg1、vtg2和vmo1基因的轉(zhuǎn)錄有顯著性影響。這表明，E2主要是通過(guò)干擾大型溞蛻皮激素的代謝，從而影響了大型溞的蛻皮和生殖周期，并干擾了大型溞的生殖能力。

綜上所述，1 360 μg·L-1E2暴露對(duì)大型溞產(chǎn)生了明顯的致死效應(yīng)，以及較高的生殖毒性效應(yīng)和較低的發(fā)育毒性效應(yīng)。此外，1 360 μg·L-1暴露抑制了大型溞蛻皮激素代謝關(guān)鍵基因cyp18a1和蛻皮激素受體基因hr3的轉(zhuǎn)錄，干擾了蛻皮激素代謝，并且抑制了大型溞表皮蛋白合成基因cut的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)促進(jìn)了大型溞表皮蛋白分解基因cht、cht3的轉(zhuǎn)錄，從而干擾了大型溞蛻皮和生殖。同時(shí)，E2暴露顯著地促進(jìn)大型溞產(chǎn)卵量，干擾了大型溞正常的生殖過(guò)程。以上結(jié)果表明，E2暴露對(duì)大型溞產(chǎn)生較低的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

本研究揭示了E2對(duì)大型溞生殖、發(fā)育及相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響，為環(huán)境中E2的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了相關(guān)的理論依據(jù)。有關(guān)E2暴露對(duì)大型溞生殖發(fā)育影響的具體分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。同時(shí)，由于自然界中化學(xué)物質(zhì)的多樣性和持續(xù)存在性，聯(lián)合暴露和多代暴露在進(jìn)一步的研究中也具有重要意義。