呂鈞惠，王悅，周蕾，范曉琳，肖寒，楊磊，胥建衛(wèi)，張照斌,*

1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，楊凌 712100 2. 北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100871

環(huán)境雌激素(EEs)是水環(huán)境中最受關(guān)注的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)類型[1-4]。研究表明，暴露在EEs污染的環(huán)境中，魚類會(huì)出現(xiàn)雄性生殖能力下降、雌雄同體、雄性逆轉(zhuǎn)為雌性和性激素水平異常等問題，進(jìn)而造成魚類種群的繁殖能力下降，種群數(shù)量減少，甚至滅絕[5-7]。卵黃原蛋白(vitellogenin, VTG)和卵殼前體蛋白(choriogenin, CHG)是魚類等卵生動(dòng)物卵巢發(fā)育過程中需要的2類蛋白質(zhì)，正常情況下，雌性個(gè)體中，2類蛋白質(zhì)在內(nèi)源雌激素刺激下在肝臟合成后運(yùn)輸至卵巢。魚類幼體和雄性中VTG和CHG基因通常不表達(dá)或表達(dá)量極低，但是在環(huán)境雌激素作用下幼魚和雄魚中VTG和CHG基因也會(huì)大量表達(dá)[8-9]，因此，VTG和CHG基因被開發(fā)為生物標(biāo)記物(biomarker)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)物質(zhì)雌激素活性的評(píng)估。近年來，隨著新一代測序技術(shù)(NGS)的成熟，人們開始用其研究魚類其他雌激素響應(yīng)基因，以期闡明環(huán)境雌激素影響魚類生殖發(fā)育的分子機(jī)理，同時(shí)也希望找到更多可以利用的生物標(biāo)記物基因。Kausch等[10]發(fā)現(xiàn)斑馬魚肝臟中有211個(gè)雌激素響應(yīng)基因。在環(huán)境雌激素的生態(tài)毒理學(xué)研究中，國內(nèi)外常用斑馬魚和日本青鳉等[11-13]作為模式生物，我國的一些學(xué)者也采用本土物種稀有鮈鯽開展研究[14-16]。國際通用的模式生物的優(yōu)勢在于其生物學(xué)信息較全面，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組和基因功能等已有大量基礎(chǔ)研究，數(shù)據(jù)信息可以在現(xiàn)存常規(guī)數(shù)據(jù)庫中調(diào)閱，如斑馬魚模式物種數(shù)據(jù)庫ZFIN(Zebrafish Model Organism Database)和基因組注釋數(shù)據(jù)庫Ensembl、Vega和UCSC Genome Browser[17]；而本土物種材料易得，甚至可以直接從環(huán)境水體中獲得，且不存在外來物種入侵風(fēng)險(xiǎn)。近年來NGS的迅速發(fā)展，使得一個(gè)獨(dú)立課題組也能夠開展一個(gè)物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組分析，能夠較容易地分析本地物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組。在本研究中，選擇在中國南北方均廣泛分布的中國青鳉作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過實(shí)驗(yàn)室多代馴化培育，獲得了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)穩(wěn)定傳代的野生型實(shí)驗(yàn)品系。利用NGS和生物信息學(xué)軟件，對(duì)其肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析。

在開展環(huán)境雌激素的魚類毒理學(xué)研究中，通常采用活體暴露方式，其優(yōu)點(diǎn)在于暴露方式與現(xiàn)實(shí)環(huán)境暴露形式相同。但是在機(jī)理性研究時(shí)，往往由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，造成一些誤差和不確切的結(jié)果。因此，建立和采用魚類細(xì)胞培養(yǎng)方法，利用離體細(xì)胞開展機(jī)理研究更為理想[18-21]。為此，以中國青鳉肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)不同濃度的17β-雌二醇(E2)暴露后，利用NGS獲得轉(zhuǎn)錄本后篩選雌激素響應(yīng)基因，并通過GO功能注釋和KEGG通路富集分析，揭示肝臟雌激素響應(yīng)基因的功能和通道；然后利用RT-qPCR方法，驗(yàn)證NGS結(jié)果并建立雌激素響應(yīng)基因與E2濃度的關(guān)系，以期建立有效的環(huán)境雌激素生物檢測方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性中國青鳉(Oryziassinensis)，取自本實(shí)驗(yàn)室繁育的4月齡個(gè)體，體長2.8～3.5 cm，體重0.2～0.28 g。該實(shí)驗(yàn)品系最初采自北京市海淀公園湖泊，目前在本實(shí)驗(yàn)室已繁育>3 a，繁育代數(shù)超過6代。養(yǎng)殖條件：采用活性炭處理的自來水，水溫(25±1) ℃，水硬度8.0 mg·L-1，pH 7.5～7.8，溶解氧8.0～9.0 mg·L-1，光照周期晝夜比為16 h∶8 h，飼料為新孵化豐年蝦，每日喂食2次。

E2純度>98%，購于美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和青鏈霉素溶液購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自以色列BI公司；0.28%胰蛋白酶-EDTA溶液和生理鹽水(兩棲動(dòng)物專用，無菌)購自中國Leagene公司；二甲基亞砜(DMSO)分析純，購自美國VWR公司；RNA提取試劑Trizol和實(shí)時(shí)定量PCR試劑SYBR?Green PCR Master Mix購自美國Life Technologies公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、M-MLV-RT緩沖液、dNTP Mix、Oligo(dT)15 Primer和RNA酶抑制劑購自美國Promega公司；35 mm培養(yǎng)皿、6孔培養(yǎng)板購自美國Costar公司；96孔光學(xué)PCR板和光學(xué)透明塑料蓋膜購自美國Axygen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中國青鳉原代肝細(xì)胞采集

將魚置于冰上麻醉，用1%的次氯酸鈉和75%的酒精對(duì)魚體表消毒，解剖取肝臟組織，置于生理鹽水(兩棲動(dòng)物專用，無菌)中；肝臟經(jīng)多次洗滌后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，剪刀剪碎后用胰酶消化2～3 min至組織塊松散，去掉胰酶，加入完全培養(yǎng)基(15% FBS+80% DMEM+5% H2O+0.1%青鏈霉素)終止反應(yīng)；用150目濾網(wǎng)過濾，將濾液置于15 mL離心管，1 000 r·min-1離心5 min，收集肝細(xì)胞棄上清；用培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，采用臺(tái)盼蘭染色法評(píng)估細(xì)胞活力達(dá)到90%以上方可使用；采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 E2暴露實(shí)驗(yàn)

將魚原代肝細(xì)胞接種于6孔板中，對(duì)照組加入DMSO，實(shí)驗(yàn)組加入E2溶液，置于25 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，E2溶液由DMSO配制，濃度梯度為0.01、0.1、1、10和100 nmol·L-1，DMSO含量不超過0.01%，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，暴露時(shí)間24 h。

1.2.3 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序

細(xì)胞總RNA用Trizol試劑提取，提取方法按Trizol試劑說明書。用Agilent 2100(美國安捷倫科技公司)和Nanodrop 2000c(美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測RNA的完整性。檢測合格的RNA樣品構(gòu)建測序文庫，在北京大學(xué)高通量測序平臺(tái)Illumina Hiseq進(jìn)行測序，獲得clean reads數(shù)據(jù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組組裝、基因注釋與差異表達(dá)基因篩選

通過CLC Genomics Workbench軟件對(duì)clean reads進(jìn)行剪切(trim)和組裝，得到表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)。通過CLC Genomics Workbench軟件中blastX功能對(duì)ESTs序列進(jìn)行注釋。將ESTs序列作為參考序列分析各個(gè)樣品的表達(dá)數(shù)據(jù)，以RPKM作為衡量基因表達(dá)水平指標(biāo)進(jìn)行組間比較。以差異倍數(shù)絕對(duì)值|fold change (FC)|≥2、P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEG)篩選。最后通過GO分析和KEGG Pathway分析得到GO功能注釋和Pathway富集分析。

1.2.5 RT-qPCR方法

用Primer Express(美國Applied Biosystems)軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示。先將RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以rpl7為內(nèi)參基因，以cDNA為模版進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線條件為：95 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，95 ℃保溫30 s。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

使用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS進(jìn)行單因素方差分析(ANOVO)，顯著性水平為P<0.05，通過Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 中國青鳉原代肝細(xì)胞培養(yǎng)方法建立

以DMEM(無酚紅，高糖)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入15% FBS，添加5%的超純水調(diào)節(jié)滲透壓。細(xì)胞采集過程中，魚體需經(jīng)過2層體表消毒，1%次氯酸鈉和75%酒精，減少細(xì)菌污染機(jī)會(huì)。原代細(xì)胞分離過程中采用機(jī)械破碎和胰蛋白酶消化相結(jié)合的方式能有效提高活細(xì)胞比例，經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖1)。

圖1 中國青鳉原代肝細(xì)胞照片(100倍)注：(a)細(xì)胞培養(yǎng)開始時(shí)；(b)細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)。Fig. 1 Primary hepatocytes of Oryzias sinensis (100 times)Note: (a) before cell culture; (b) after 72 h of cell culture.

2.2 轉(zhuǎn)錄組序列組裝結(jié)果

中國青鳉肝細(xì)胞暴露于不同濃度(0.01、0.1、1、10和100 nmol·L-1)的E2中24 h，提取RNA測序。經(jīng)Illumina測序后，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，獲得clean reads，每個(gè)樣本均獲得6 G左右的測序數(shù)據(jù)量。各樣本reads有88%以上能匹配到參考序列上，具體結(jié)果如表2所示。

表2 各樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Summary of different sample transcriptome sequencing data

通過CLC Genomics Workbench對(duì)clean reads進(jìn)行De novo組裝，共獲得65 765條ESTs，最大contig長度為46 862 bp，平均長度為531 bp，N50為596 bp，GC含量44.7%，組裝結(jié)果比較理想。

2.3 差異基因表達(dá)篩選與分析

以差異表達(dá)變化倍數(shù)和顯著性P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異基因105個(gè)，其中，上調(diào)基因38個(gè)，下調(diào)基因67個(gè)，如表3所示，基因表達(dá)聚類分析如圖2所示。

圖2 差異表達(dá)基因聚類分析注：(a)為總體差異表達(dá)基因；(b)為上調(diào)差異表達(dá)基因；(c)為下調(diào)差異表達(dá)基因。Fig. 2 Cluster analysis of differentially expressed genesNote: (a) total differentially expressed genes; (b) up-regulated differentially expressed genes; (c) down-regulated differentially expressed genes.

表3 上調(diào)和下調(diào)基因列表Table 3 Up and down regulated gene list

2.4 差異基因的GO和KEGG Pathway富集分析

將篩選到的105個(gè)差異表達(dá)基因通過在線分析網(wǎng)站DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。差異表達(dá)基因主要富集到的生物學(xué)過程為雌激素的細(xì)胞響應(yīng)、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白磷酸化、骨骼肌組織發(fā)育、鈣離子運(yùn)輸、胞內(nèi)信號(hào)傳遞、對(duì)外來物的刺激反應(yīng)、紅細(xì)胞分化和肌肉收縮。上調(diào)基因主要富集到的生物學(xué)過程為雌激素的細(xì)胞響應(yīng)、脂質(zhì)運(yùn)輸、骨骼肌組織發(fā)育、對(duì)外來物的刺激反應(yīng)和肌原纖維組裝。下調(diào)基因主要富集到了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白磷酸化、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、鈣離子運(yùn)輸、蛋白泛素化、紅細(xì)胞分化和血管發(fā)育。KEGG Pathway富集分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集到的生物學(xué)過程為蛋白泛素化降解、MAPK信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路。

2.5 標(biāo)記物基因的濃度效應(yīng)關(guān)系

肝臟中與雌激素相關(guān)的基因有esr1、VTG家族和CHG家族等，ESR1為雌激素核受體，介導(dǎo)下游基因表達(dá)。VTG和CHG都由肝臟產(chǎn)生，通過血液運(yùn)輸?shù)铰殉?，?duì)魚類的繁殖發(fā)育有重要影響。本實(shí)驗(yàn)選取了生物標(biāo)記基因esr1、vtg1、vtg2、vtg3、chg-l、chg-h和chg-hm，以rpl7作為管家基因進(jìn)行RT-qPCR，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可靠性。將得到的循環(huán)數(shù)經(jīng)2-ΔΔCT法計(jì)算后，通過SPSS進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。隨著E2濃度的增加，基因表達(dá)水平顯著提高，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。VTG家族對(duì)雌激素的響應(yīng)比CHG家族更靈敏，與對(duì)照組相比，雌激素受體esr1在0.1 nmol·L-1E2暴露后升高了2.70倍，chg-l、chg-h和chg-hm在0.1 nmol·L-1E2暴露后分別升高了2.08倍、3.75倍和1.84倍，而vtg1、vtg2和vtg3在0.1 nmol·L-1E2暴露后時(shí)分別升高了70.81倍、11.39倍和18.68倍，具有很高的靈敏度。

3 討論(Discussion)

結(jié)合胰蛋白酶-EDTA法和機(jī)械分散法處理肝臟，獲得的肝臟細(xì)胞分散均勻且損傷小，有別于傳統(tǒng)的單一處理方法。淡水魚類細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基為EMEM，且多用于細(xì)胞系培養(yǎng)，RPMI-1640多用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，M199適用范圍比較廣[22-23]，本實(shí)驗(yàn)采用的是DMEM高糖無酚紅培養(yǎng)基加胎牛血清的方法，適用于各種原代細(xì)胞及細(xì)胞系的培養(yǎng)，尤其適合附著性較差的細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)保留了部分甚至全部體細(xì)胞的生理功能特性，廣泛應(yīng)用于藥物測試和毒理學(xué)研究等領(lǐng)域。

ER、VTG、CHG以及腦特異性芳香化酶B(AroB)是雌激素暴露的生物標(biāo)志物，已被廣泛用于檢測雌激素內(nèi)分泌干擾物。為了尋找其他的雌激素響應(yīng)基因，Lam等[24]通過寡核苷酸微陣列技術(shù)獲得了雄性斑馬魚的雌激素響應(yīng)基因1 092個(gè)；Levi等[25]通過轉(zhuǎn)錄組分析研究了斑馬魚肝臟中的雌激素響應(yīng)基因并篩選出了20個(gè)顯著差異基因；Hao等[26]研究了斑馬魚早期胚胎發(fā)育的雌激素響應(yīng)基因。本研究篩選出肝細(xì)胞雌激素響應(yīng)基因105個(gè)，包含7個(gè)生物標(biāo)記基因esr1、vtg1、vtg2、vtg3、chg-l、chg-h和chg-hm，7個(gè)報(bào)道過的雌激素響應(yīng)基因klf3、cxcr3、chia.1、zgc:154058、nots、fam20c和apoebmgll，82個(gè)新發(fā)現(xiàn)的雌激素響應(yīng)基因以及9個(gè)未命名的基因，這些新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)量顯著上調(diào)或下調(diào)，可以作為新的生物標(biāo)記物。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析注：(a)為總體差異表達(dá)基因；(b)為上調(diào)差異表達(dá)基因；(c)為下調(diào)差異表達(dá)基因。Fig. 3 GO enrichment analysis of differentially expressed genesNote: (a) total differentially expressed genes; (b) up-regulated differentially expressed genes; (c) down-regulated differentially expressed genes.

圖4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

GO和KEGG Pathway分析顯示，差異表達(dá)基因主要參與了雌激素響應(yīng)、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白磷酸化、鈣離子運(yùn)輸和信號(hào)傳遞等生物學(xué)過程以及蛋白泛素化降解、MAPK信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路，分子功能富集分析顯示差異表達(dá)基因主要與脂質(zhì)運(yùn)輸代謝和離子運(yùn)輸相關(guān)。Jin等[27]的研究證明了雌激素影響肝臟的脂質(zhì)代謝。雌激素作用于肝細(xì)胞后，雌激素受體磷酸化程度增加，激活了MAPK信號(hào)通路，MAPK通路的激活增強(qiáng)了Ser-118和Ser-167的磷酸化[28]。雌激素可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，鈣離子可以參與ERK通路的活化[29-30]。

ESR1為雌激素受體，VTG和CHG是卵黃蛋白和卵殼蛋白的前體，影響魚類的胚胎和幼體早期發(fā)育，對(duì)雌激素暴露反應(yīng)敏感，常作為生物標(biāo)記物[31]。本實(shí)驗(yàn)通過原代肝細(xì)胞培養(yǎng)來檢測雌激素活性，RT-qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，證明中國青鳉原代肝細(xì)胞作為檢測環(huán)境雌激素的實(shí)驗(yàn)方法可行。esr1、VTG和CHG基因在0.01～100 nmol·L-1E2濃度范圍內(nèi)都有很好的劑量效應(yīng)關(guān)系，且VTG家族比CHG家族對(duì)雌激素的響應(yīng)更靈敏，vtg1在0.1 nmol·L-1E2暴露后升高了70.81倍，vtg2在100 nmol·L-1E2暴露后升高了29 227.91倍。羅平[32]通過高效液相色譜法檢測地表水中E2，檢出限為0.04 μg·mL-1；Kovalchuk等[33]的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E2最低濃度為1 nmol·L-1時(shí)與雌激素受體有相互作用，Tyler等[34]通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定了黑頭軟口鰷VTG的含量，建立了魚早期發(fā)育階段的雌激素體內(nèi)檢測體系，E2暴露濃度為100 ng·L-1時(shí)，VTG含量是對(duì)照組的100多倍。這些結(jié)果表明，原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合RT-qPCR的方法靈敏度高，對(duì)雌激素的響應(yīng)明顯。

圖5 不同濃度雌二醇(E2)暴露下基因表達(dá)變化注：樣本數(shù)n=3，與對(duì)照組相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 5 Changes of gene expression in groups with different concentrations of estradiol (E2)Note: Number of samples, n=3, * P<0.05 and ** P<0.01 compared to control group.