晁會(huì)珍，孫明明,*，朱國(guó)繁，葉茂，張勝田，劉滿強(qiáng)，胡鋒

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，土壤生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095 2. 合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，地下水實(shí)驗(yàn)室，合肥 230009 3. 中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008 4. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所，國(guó)家環(huán)境保護(hù)土壤環(huán)境管理與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042

蚯蚓腸道中富含大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，腸道中每克干重需氧菌和厭氧菌的數(shù)量大約是土壤中的12倍～40倍和10倍～4 000倍，它們不僅對(duì)蚯蚓自身新陳代謝及機(jī)能穩(wěn)定具有重要調(diào)節(jié)作用，而且還有利于蚯蚓對(duì)土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解及養(yǎng)分元素(碳、氮和磷)的轉(zhuǎn)化[1-2]。蚯蚓腸道是接近于厭氧狀態(tài)的微環(huán)境，其中，內(nèi)生細(xì)菌群落主要來(lái)源于土壤，但與土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成因環(huán)境的不同而存在顯著差異[3]。由于特殊的生境體系，蚯蚓腸道細(xì)菌群落具有富集碳、氮和磷元素的能力，其含量約為土壤的2倍～5倍，這使得蚯蚓腸道細(xì)菌在促進(jìn)土壤中有機(jī)污染物、微塑料和抗生素的降解以及重金屬的解毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[4]。但是，過(guò)量污染物的存在也會(huì)對(duì)蚯蚓自身免疫系統(tǒng)及腸道細(xì)菌的群落多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，進(jìn)一步探明蚯蚓腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的特征規(guī)律，挖掘蚯蚓腸道細(xì)菌環(huán)境功能潛力，對(duì)于促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及污染土壤可持續(xù)修復(fù)治理具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成(Bacteria community in earthworm gut)

蚯蚓通過(guò)吞食土壤而攝入的土著菌群，其結(jié)構(gòu)會(huì)隨著腸道的運(yùn)轉(zhuǎn)和發(fā)酵發(fā)生變化；后期蚯蚓又通過(guò)排出蚓糞等方式改變土壤細(xì)菌群落，這就使土壤、蚯蚓腸道和蚓糞中的細(xì)菌群落既相互聯(lián)系又有一定的區(qū)分度[5]。蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成對(duì)蚓糞的產(chǎn)出速率和質(zhì)量有重要的影響，而蚓糞中細(xì)菌的種類和數(shù)量是抑制土傳病害、緩解土壤污染物毒害的關(guān)鍵因素[6]。因此，探明3種介質(zhì)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和差異能夠?yàn)橥寥鲤B(yǎng)分管理及蚓糞的品質(zhì)的提升提供科學(xué)依據(jù)。

1.1 蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成特點(diǎn)

蚯蚓腸道是蚯蚓消化系統(tǒng)最重要的器官之一，腸道為厭氧環(huán)境，且pH接近于中性(6～7)[4,7]，因而，蚯蚓腸道優(yōu)勢(shì)細(xì)菌通常是在厭氧或兼性厭氧條件下可以生存的特殊菌群，例如：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)[8]；同時(shí)內(nèi)生菌群的結(jié)構(gòu)組成也會(huì)隨著蚯蚓種類、生活習(xí)性和周邊土壤生境特征發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。Knapp等[9]對(duì)粉正蚓(Lumbricusrubellus)的腸道菌群進(jìn)行檢測(cè)，該蚯蚓取自阿爾卑斯山脈中部的高山牧場(chǎng)，并且在牛糞中喂養(yǎng)6周后，利用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，在腸道總細(xì)菌群落的豐度占比分別為36%、20%、17%、10%和3%(表1)；Pass等[3]利用16S rRNA焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)砷污染地區(qū)粉正蚓的腸道細(xì)菌群落進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蚯蚓腸道中以變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群，豐度分別為總細(xì)菌群落的50%、30%、6%和3%(表1)。Meier等[10]利用高通量技術(shù)檢測(cè)到草地中陸正蚓(Lumbricusterrestris)的腸道優(yōu)勢(shì)菌群分別為變形菌門(30%)、放線菌門(28%)、軟壁菌門(Tenericutes)(13%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(7%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(7%)和疣微菌門(4%)(表1)。愛(ài)勝蚓屬(Eisenia)是一類分布較為廣泛的蚯蚓，因其生活周期短、繁殖力強(qiáng)和易于飼養(yǎng)等特點(diǎn)，被應(yīng)用于許多研究。Wang等[11]為探究牛糞堆肥中赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafetida)的腸道細(xì)菌組成，利用高通量技術(shù)檢測(cè)出蚯蚓腸道菌群共有24個(gè)門，優(yōu)勢(shì)菌群豐度由大到小分別為變形桿菌(50%)>軟壁菌門(33%)>放線菌門(9%)>擬桿菌門(7%)(表1)；Singh等[12]用木質(zhì)纖維素生物基質(zhì)喂養(yǎng)赤子愛(ài)勝蚓(Eiseniafoetida)和Perionyxexcavates30 d后，利用宏基因組測(cè)序技術(shù)分析2種蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)2種蚯蚓腸道細(xì)菌均以厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌，疣微菌門和綠彎菌門只在赤子愛(ài)勝蚓中檢出，而螺旋體門僅在Perionyxexcavates腸道內(nèi)檢測(cè)出(表1)。周艷玲等[13]對(duì)峨眉山秉氏環(huán)毛蚓(Pheretimacarnosa)腸道的可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌全部屬于厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，豐度分別為68%、29%和3%(表1)。因此，蚯蚓腸道細(xì)菌群落的種類和豐度隨著蚯蚓的品種和外界環(huán)境等多因素發(fā)生相應(yīng)的變化，且變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門通常是蚯蚓腸道中主要的優(yōu)勢(shì)菌群。

1.2 蚯蚓腸道和土壤細(xì)菌群落組成差異

土壤是蚯蚓掘穴、攝食、消化和排泄的場(chǎng)所，為蚯蚓的生存提供了適宜的條件；同時(shí)，蚯蚓也通過(guò)自身活動(dòng)改善土壤結(jié)構(gòu)、提高土壤通透性、參與土壤能量傳遞和物質(zhì)循環(huán)等。土壤是相對(duì)開放的空間，受外界擾動(dòng)較大，氧氣含量、土壤含水量、pH值以及養(yǎng)分隨著土壤質(zhì)地的改變而變化；相較于土壤，蚯蚓腸道的厭氧環(huán)境和高含量的碳、氮?jiǎng)t給內(nèi)生細(xì)菌的定殖和存活提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的空間。芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)是土壤中常見(jiàn)的細(xì)菌，但是其在土壤中的數(shù)量通常比蚯蚓腸道低，主要是因?yàn)槟c道中高含量的氨基酸和糖底物能刺激它們的定殖和增殖，因此，當(dāng)芽孢桿菌屬和梭狀芽胞桿菌屬的細(xì)菌進(jìn)入蚯蚓腸道后，數(shù)量和活性均會(huì)顯著增加[14]。一些厭氧或兼性厭氧菌，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)在蚯蚓腸道中的生存能力也相應(yīng)增強(qiáng)[15]。此外，如表1所示，蚯蚓腸道、土壤及蚓糞中細(xì)菌群落組成具有一定的同源性，然而在門的水平的相對(duì)比例上有一定差異。Montagna等[16]利用高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)阿爾卑斯山脈原狀土壤中，變形菌門的相對(duì)豐度為15%，未檢測(cè)到厚壁菌門；而在同地區(qū)的粉正蚓腸道中，變形菌門的相對(duì)豐度高達(dá)36%，厚壁菌門的相對(duì)豐度為20%[9](表1)；指出該地區(qū)土著蚯蚓對(duì)于土壤中變形菌門和厚壁菌門具有親和性和共生關(guān)系。Liu等[17]將秉氏環(huán)毛蚓放置在黃棕壤中培養(yǎng)10 d后，發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道變形菌門的相對(duì)豐度為45%，而土壤中變形菌門的豐度只占22%，并且還檢測(cè)到蚯蚓腸道中厚壁菌門的比例大于黃棕壤，相對(duì)豐度分別為42%和2%(表1)。Navrátilová等[18]利用高通量技術(shù)分析草地土壤中細(xì)菌群落組成，發(fā)現(xiàn)土壤中的放線菌門(8%)為優(yōu)勢(shì)菌群，豐度比例明顯小于草地中粉正蚓腸道放線菌門(30%)(表1)。然而，并不是所有細(xì)菌均能適應(yīng)蚯蚓腸道環(huán)境。Pass等[3]在研究砷對(duì)粉正蚓體內(nèi)微生物組影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酸桿菌是土壤微生物主要的群落組成之一，占總數(shù)的35%，但在同一地區(qū)發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道中的酸桿菌門只有總數(shù)的3%(表1)；Liu等[17]同樣發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道中酸桿菌門的數(shù)量小于土壤，豐度分別為1%和31%(表1)；Naether等[19]在探究不同環(huán)境因子對(duì)酸桿菌的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)該類菌在土壤養(yǎng)分缺乏的環(huán)境能生長(zhǎng)良好，且有與碳、氮含量呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，而蚯蚓腸道碳、氮含量往往是土壤的2倍～5倍，這可能是導(dǎo)致土壤中酸桿菌數(shù)量高于蚯蚓腸道的原因。因此，土壤和蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成差異主要來(lái)源于二者環(huán)境的不同，且蚯蚓腸道中的厭氧或兼性厭氧菌的數(shù)量普遍高于土壤。

1.3 蚯蚓腸道和蚓糞中細(xì)菌群落組成差異

蚯蚓糞是自然界中多種有機(jī)廢棄物經(jīng)發(fā)酵后，在蚯蚓體內(nèi)消化酶系統(tǒng)的綜合作用下，迅速分解轉(zhuǎn)化而成的一類環(huán)境友好型高效養(yǎng)分有機(jī)肥資源。因此，蚓糞中細(xì)菌群落的組成和蚯蚓腸道內(nèi)生菌群有著密不可分的關(guān)系。由于蚯蚓腸道更加適合厭氧或兼性厭氧菌的生存，所以細(xì)菌經(jīng)過(guò)腸道運(yùn)轉(zhuǎn)后，蚓糞中厭氧菌的數(shù)量高于原始基質(zhì)[20]。Koubová等[5]將安德愛(ài)勝蚓(Eisentiaandrei)放入由牛糞、稻草桿和有機(jī)廢棄物組成的基質(zhì)中進(jìn)行飼養(yǎng)，并利用聚合酶鏈-變性梯度凝膠電泳技術(shù)，對(duì)基質(zhì)、蚯蚓腸道及蚓糞中細(xì)菌群落進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在基質(zhì)中厚壁菌門豐度為總細(xì)菌群落的19%，而蚯蚓腸道和蚓糞中厚壁菌門的豐度比例分別達(dá)到63%和36%(表1)。Huang等[20]以果蔬殘余和赤子愛(ài)勝蚓進(jìn)行堆肥，利用定量聚合酶反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)對(duì)蚓糞中的細(xì)菌群落進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蚓糞中厚壁菌門豐度高于原始基質(zhì)。另外，通過(guò)蚯蚓腸道的運(yùn)轉(zhuǎn)，可能會(huì)使腸道和蚓糞中革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的比例發(fā)生改變。Villar等[21]將安德愛(ài)勝蚓和污泥進(jìn)行堆肥，并利用磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid analysis, PLFAs)分析蚓糞細(xì)菌群落的組成，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)腸道后，革蘭氏陽(yáng)性菌的數(shù)量會(huì)減小，進(jìn)而造成蚓糞中革蘭氏陽(yáng)性菌/革蘭氏陰性菌的比例減小。蚓糞細(xì)菌群落的組成還受到基質(zhì)種類的影響。Aira等[22]分別以馬糞、豬糞和牛糞為基質(zhì)，添加安德愛(ài)勝蚓進(jìn)行堆肥，后期利用16S rRNA焦磷酸測(cè)序和宏基因組測(cè)序檢測(cè)蚯蚓腸道菌群組成，結(jié)果顯示，以馬糞和牛糞為基質(zhì)的蚓糞中變形菌門豐度最高，為總細(xì)菌豐度的82%和76%；以豬糞基質(zhì)的蚓糞中厚壁菌門所占的比例最高，為57%。Wang等[11]利用高通量技術(shù)，對(duì)牛糞、赤子愛(ài)勝蚓以及牛糞和赤子愛(ài)勝蚓產(chǎn)出的蚓糞進(jìn)行了細(xì)菌群落檢測(cè)，分別在牛糞、蚯蚓腸道和蚓糞中檢測(cè)到15、24和33個(gè)門，79、182和184個(gè)屬。因此，蚓糞細(xì)菌群落組成與蚯蚓種類及蚓糞基質(zhì)具有密不可分的聯(lián)系，且通過(guò)蚯蚓腸道運(yùn)轉(zhuǎn)后，蚓糞中厭氧菌的數(shù)量會(huì)有所增加，同時(shí)蚓糞中細(xì)菌群落通常具有比蚯蚓腸道內(nèi)容物和原始基質(zhì)更高的物種多樣性。

表1 蚯蚓腸道、土壤和蚓糞細(xì)菌群落組成(%)(門水平)Table 1 Bacteria community of phylum in earthworm gut, soil and cast (%)

2 蚯蚓腸道細(xì)菌對(duì)土壤中污染物的解毒作用(Detoxification of earthworm intestinal bacteria to soil pollutants)

近年來(lái)，隨著我國(guó)工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，重金屬、有機(jī)污染物、微塑料和抗生素等物質(zhì)在土壤中的檢出率不斷增加，給場(chǎng)地土壤的污染治理、農(nóng)業(yè)的安全生產(chǎn)及人體健康帶來(lái)較為嚴(yán)重的威脅，因此，找到安全、經(jīng)濟(jì)和有效的治理方法尤為重要[23-25]。蚯蚓在土壤中廣泛分布，其腸道菌群可以通過(guò)生物降解、吸附轉(zhuǎn)化和生物積累等方式對(duì)環(huán)境中的污染物進(jìn)行積累或降解，且不產(chǎn)生二次污染，有利于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[26-29]。

2.1 蚯蚓腸道細(xì)菌對(duì)土壤中重金屬的解毒作用

蚯蚓作為陸地生態(tài)系統(tǒng)生物量最大的無(wú)脊椎動(dòng)物，已被廣泛的應(yīng)用于重金屬污染土壤的毒理學(xué)研究。蚯蚓之所以能夠在緩解重金屬毒害的過(guò)程中發(fā)揮作用，主要是因?yàn)槠渥陨韽?qiáng)大的代謝系統(tǒng)以及腸道內(nèi)生菌群的參與[6]。已經(jīng)有許多研究表明，可以在蚯蚓腸道中分離出具有重金屬抗性并能有效降低重金屬毒害作用的內(nèi)生細(xì)菌。Biswas等[26]在土后腔環(huán)蚓(Metaphireposthuma)腸道中分離一株對(duì)二價(jià)銅離子和二價(jià)鋅離子具有顯著抗性的菌株，通過(guò)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析方法確定為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformiastrain KX 657843)；該菌株對(duì)二價(jià)銅離子和二價(jià)鋅離子的最大耐受濃度分別為8 mmolL-1和6 mmolL-1，而且在重金屬濃度為25 mg·L-1的LB培養(yǎng)基上培育72 h后，通過(guò)分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)對(duì)金屬離子的絡(luò)合作用，使二價(jià)銅離子和二價(jià)鋅離子的濃度分別降低35%和54%。后期Biswas等[30]在土后腔環(huán)蚓中又相繼分離出3株具有抗二價(jià)銅離子和二價(jià)鋅離子的磷酸鹽增溶菌(Phosphate solubilizing bacteria, PSB)，分別為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegateriumstrain MF589715)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformiastrain MF589720)和溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticusstrain MF589716)，此類菌株可以增加磷酸鹽的溶解，促使土壤中磷酸根和金屬離子形成絡(luò)合物，以減輕金屬離子帶來(lái)的危害，同時(shí)對(duì)二價(jià)銅離子和二價(jià)鋅離子的最大耐受濃度范圍為2～6 mmolL-1。此外，蚯蚓腸道中豐度較高的假單胞菌屬(Pseudomonassp.)也具有固定金屬離子的能力。如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)通過(guò)增加磷酸鹽的溶解使鉛離子轉(zhuǎn)化為鉛羥基磷灰石和磷氯鉛進(jìn)而達(dá)到對(duì)鉛的固定，減小鉛離子帶來(lái)的危害[31]。Goswami等[32]將赤子愛(ài)勝蚓和Lampitomauritii置于鋅、砷和錳等重金屬脅迫的環(huán)境中，為緩解重金屬毒性，蚯蚓腸道細(xì)菌分泌大量的金屬硫蛋白，以實(shí)現(xiàn)對(duì)重金屬的吸附絡(luò)合(圖1)。代金君等[33]以重金屬污染土壤為基質(zhì)培養(yǎng)1周后，在赤子愛(ài)勝蚓腸道中發(fā)現(xiàn)了分泌金屬β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)的細(xì)菌，如香味菌屬(Myroidessp.)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，該細(xì)菌可以分泌金屬β-內(nèi)酰胺酶對(duì)土壤中的鋅離子吸附絡(luò)合。因此，蚯蚓腸道細(xì)菌可以通過(guò)生物吸附、生物積累和生物轉(zhuǎn)化等方式緩解或降低重金屬對(duì)土壤生物的毒害作用[34-36]。

2.2 蚯蚓腸道細(xì)菌群落對(duì)土壤中有機(jī)污染物的降解作用

有機(jī)污染物是指以蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪和氨基酸等形式存在并對(duì)人類和環(huán)境造成危害的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)。其中，持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)，如多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)，因其具有難降解、高毒性和半揮發(fā)等特點(diǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了較大的負(fù)面影響。已有許多研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道細(xì)菌能夠有效降解環(huán)境中的有機(jī)污染物[37]。Verma等[27]在土后腔環(huán)蚓腸道中分離出一株可以降解硫丹的菌株RhodococcusMTCC 6716，該菌株在硫丹存在的情況下通過(guò)酶促反應(yīng)，將硫丹降解為硫丹二醇和硫丹硫酸酯2種無(wú)毒的代謝產(chǎn)物，且15 d內(nèi)菌株對(duì)硫丹的降解率高達(dá)97%(圖1)。Mudziwapasi等[38]通過(guò)16S rRNA技術(shù)在赤子愛(ài)勝蚓腸道中分離出具有降解4,4-滴滴涕(4,4-dichlorodiphenyltrichloroethane, 4,4-DDT)能力的紅球菌(Rhodococcus)和芽孢桿菌，該類菌株通過(guò)分泌4,4-DDT還原性脫鹵素酶將污染物降解為毒性更小的4,4-滴滴滴(4,4-1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl) ethylene, 4,4-DDD)，并且降解率分別高達(dá)88%和85%；Singh等[12]利用宏基因組測(cè)序?qū)Τ嘧訍?ài)勝蚓和掘穴環(huán)爪蚓(Perionyxexcavatus)這2種蚯蚓的腸道微生物的功能和分類進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在赤子愛(ài)勝蚓腸道中有22%的細(xì)菌可以參與脫鹵過(guò)程，有4%和2%的腸道細(xì)菌可以降解氯酚和萘；在掘穴環(huán)爪蚓腸道中同樣發(fā)現(xiàn)了可以參與脫鹵過(guò)程的細(xì)菌，豐度為總細(xì)菌群落的17%。蚯蚓腸道低氧化還原電位及豐富的葡萄糖為發(fā)酵提供了可能，腸道中產(chǎn)甲烷菌群可以通過(guò)發(fā)酵生成甲烷，甲烷可以為厭氧微生物如假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)提供電子供體，促進(jìn)甲基橙(methyl orange, MO)等有機(jī)污染物的降解[39]。因此，蚯蚓腸道菌群對(duì)土壤中有機(jī)污染物的解毒及共代謝降解具有巨大的潛力。

2.3 蚯蚓腸道細(xì)菌群落對(duì)土壤中微塑料的分解作用

微塑料是粒徑<5 mm的塑料固體顆粒，因其具有易吸附重金屬和有機(jī)污染物且難降解等特點(diǎn)，給環(huán)境治理帶來(lái)了較為嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[23,40-41]。目前，已有研究報(bào)道，蚯蚓腸道是富集微塑料的重要場(chǎng)所，腸道內(nèi)生細(xì)菌具有分解微塑料的能力。Lwanga等[28]在陸正蚓腸道中分離出放線菌門和厚壁菌門，并將其培養(yǎng)在密度值為1%(w/w)的低密度聚乙烯(low density polyethylene, LDPE)的環(huán)境中，21 d后檢測(cè)到細(xì)菌對(duì)低密度聚乙烯的降解率達(dá)到60%，粒徑減小34%～56%，降解產(chǎn)物主要是正十八烷、二十烷、二十二烷和二十三烷等(圖1)。短芽孢桿菌(Brevibacillusborstelensis)是蚯蚓腸道常見(jiàn)的細(xì)菌種類，在Hadad等[42]的研究中發(fā)現(xiàn)，短芽孢桿菌可降解低密度聚乙烯的CH2主鏈，并可將低密度聚乙烯作為碳源進(jìn)行利用，30 d內(nèi)使聚乙烯的分子量降低30%。芽孢桿菌因抗逆性較強(qiáng)可廣泛存在于土壤、水以及腸道等環(huán)境中，已有研究表明，芽孢桿菌是蚯蚓腸道的優(yōu)勢(shì)菌[8,13]。Auta等[43-44]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有降解聚丙烯(polypropylene, PP)的能力，后期將其置于含有聚丙烯的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40 d后發(fā)現(xiàn)該菌株主要是通過(guò)分泌胞外酶破壞聚丙烯的表面，致使菌株進(jìn)入空隙內(nèi)部定殖生長(zhǎng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)逐步分解聚丙烯的過(guò)程。然而，蚯蚓腸道菌群在降解微塑料的同時(shí)，微塑料也會(huì)對(duì)蚯蚓及其腸道菌群產(chǎn)生影響。Wang等[45]將加州腔蚓(Metaphirecalifornica)培養(yǎng)在聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)濃度為2 000 mg·kg-1的土壤中28 d，通過(guò)高通量技術(shù)發(fā)現(xiàn)聚氯乙烯的存在降低了腸道中綠彎菌門和酸桿菌門的相對(duì)豐度。Lwanga等[46]將陸正蚓置于不同含量的低密度聚乙烯(<150 μm)污染土壤中培養(yǎng)60 d，發(fā)現(xiàn)在清潔對(duì)照土壤中蚯蚓的生長(zhǎng)率為10 mg·worm-1·d-1，而添加了濃度為60%的低密度聚乙烯的污染土壤中，蚯蚓的生長(zhǎng)率受到顯著抑制，生長(zhǎng)率<0。Zhu等[47]將Enchytraeuscrypticus暴露在納米聚苯乙烯(nano-polystyrene)含量為10%的土壤中，后期蚯蚓體重明顯下降，而且腸道中根瘤菌科(Rhizobiaceae)和伊索菌科(Isosphaeraceae)的豐度分別下降6%和33%。因此，蚯蚓腸道細(xì)菌不但能減小微塑料的物理粒徑，還能對(duì)環(huán)境中的微塑料化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行降解。但是當(dāng)微塑料含量過(guò)高時(shí)，會(huì)降低蚯蚓自身的機(jī)能以及改變蚯蚓腸道細(xì)菌群落組成。

2.4 蚯蚓腸道細(xì)菌群落對(duì)土壤中抗生素的消減作用

抗生素是由微生物或高等動(dòng)物產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，由于抗生素的不規(guī)范使用，已經(jīng)在很多畜禽養(yǎng)殖廠、河海漁廠和垃圾填埋場(chǎng)等熱點(diǎn)區(qū)域周邊土壤中檢測(cè)到多種抗生素的長(zhǎng)期殘留，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境安全造成了潛在威脅[48-49]。微生物菌群共代謝強(qiáng)化降解是土壤中殘留抗生素去除的重要途徑[50]。蚯蚓腸道作為土壤中移動(dòng)的厭氧微域，通過(guò)增加土壤中厭氧菌的數(shù)量、改變土壤細(xì)菌群落組成來(lái)消減土壤中殘留的抗生素。Cao等[29]將赤子愛(ài)勝蚓放置在土霉素(oxytetracycline, OTC)濃度為100 mg·kg-1的土壤中56 d，與未添加蚯蚓的土壤相比，蚯蚓的存在增加了土壤中黃桿菌科(Flavobacteriaceae)和假單胞菌屬的豐度，進(jìn)而促進(jìn)土霉素的降解；同時(shí)在添加蚯蚓的土壤中檢測(cè)到土霉素濃度下降至33 mg·kg-1，并伴有降解產(chǎn)物4-差向土霉素(4-epi-oxytetracycline, EOTC)和2-乙酰基-2-甲酰氨基土霉素(2-acetyl-2-decarboxamido-oxytetracycline, ADOTC)的生成(圖1)。環(huán)境因子尤其是氧氣含量是蚯蚓腸道內(nèi)生細(xì)菌和土壤菌群產(chǎn)生差異的重要原因[51]。蚯蚓通過(guò)排泄的方式將腸道內(nèi)的細(xì)菌帶入土壤，造成周邊環(huán)境細(xì)菌群落發(fā)生改變，促進(jìn)細(xì)菌對(duì)抗生素的共代謝，以達(dá)到對(duì)環(huán)境中抗生素消減的目的。假單胞菌和葡萄球菌是蚯蚓腸道中常見(jiàn)的細(xì)菌種類，已有研究發(fā)現(xiàn)，在污泥和土壤中分離出來(lái)的假單胞菌和葡萄球菌可以通過(guò)分泌酶(如：氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphotransferase, APH)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT))修飾鈍化環(huán)境中的抗生素[52-55]。因此，蚯蚓腸道細(xì)菌具有較大的潛力降解或鈍化土壤中殘留的抗生素。此外，環(huán)境中過(guò)量的抗生素對(duì)蚯蚓本身及其腸道菌群也有一定的損傷。Ma等[56]用土霉素濃度為10 μg·g-1的菜地土壤將Enchytraeuscrypticus培養(yǎng)21 d，并利用高通量技術(shù)檢測(cè)到土霉素的存在降低了腸道中變形菌門的豐度(由48%下降到24%)、增加了浮霉菌門的豐度(由28%上升到47%)。Wang等[57]將赤子愛(ài)勝蚓培養(yǎng)在環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)濃度為0～51 mg·kg-1的土壤中，15 d后發(fā)現(xiàn)蚯蚓超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)及抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbateperoxidase, APX)的含量均有提高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致羥基化蛋白質(zhì)的氧化損傷。Li等[58]探究了不同濃度的環(huán)丙沙星對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)丙沙星的濃度為2 g·kg-1時(shí)，赤子愛(ài)勝蚓的繁殖能力下降到原先的1/6，躲避行為達(dá)到100%。因此，土壤中過(guò)量的抗生素對(duì)蚯蚓的生長(zhǎng)繁殖及氧化防御系統(tǒng)具有較大的負(fù)面影響。目前已有較多的研究發(fā)現(xiàn)抗生素對(duì)蚯蚓具有毒害作用，但是關(guān)于腸道菌群對(duì)抗生素的降解機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

圖1 蚯蚓腸道細(xì)菌對(duì)土壤中污染物的解毒作用Fig. 1 Detoxification of earthworm intestinal bacteria to soil pollutants

3 蚯蚓腸道細(xì)菌對(duì)土壤物質(zhì)循環(huán)的影響(The effect of earthworm intestinal bacteria on soil substance circulation)

土壤中物質(zhì)循環(huán)是組成生物體的化學(xué)元素在土壤無(wú)機(jī)環(huán)境和生物群落之間的遷移、轉(zhuǎn)化及物質(zhì)交換的過(guò)程，有利于物質(zhì)的更新和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。蚯蚓腸道獨(dú)特的原位條件為厭氧微生物提供了適宜的生存空間，腸道中的厭氧微生物對(duì)促進(jìn)土壤碳、氮和磷等元素的循環(huán)具有重要的影響[59-60]。

氮循環(huán)是自然界中各種形態(tài)的氮相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程，其中，固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用是細(xì)菌促進(jìn)氮循環(huán)的重要過(guò)程。有研究表明，蚯蚓腸道中富含大量與固氮、硝化、反硝化和氨化作用密切相關(guān)的細(xì)菌群落[51]。Hussain等[59]在赤子愛(ài)勝蚓腸道中發(fā)現(xiàn)2種固氮菌，經(jīng)鑒定后為沙雷氏菌屬(Serratia)和芽孢桿菌屬，并且首次分離出具有固氮功能的抗壞血酸克呂沃爾氏菌(Kluyveraascorbata)。Wüst等[61-62]發(fā)現(xiàn)陸正蚓后腸排放氧化亞氮的能力高于前腸和中腸，亞硝酸鹽的含量則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，隨后對(duì)蚯蚓腸道不同位置的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)后腸中反硝化細(xì)菌(denitrifying bacteria, DNB)群落物種多樣性顯著高于前腸和中腸反硝化細(xì)菌的群落，同時(shí)證實(shí)不同種類的蚯蚓(粉正蚓、Aporrectodearosea、Octolasioncyaneum和Octochaetusmultiporus)均能排放氧化亞氮(圖2)。Depkat-Jakob等[63]通過(guò)對(duì)編碼硝酸還原酶的基因(narG)、編碼亞硝酸還原酶的基因(nirK)和編碼氧化亞氮還原酶的基因(nosZ)的序列進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道中存在的反硝化菌主要來(lái)自于攝入的土壤菌群，其中占主導(dǎo)地位的為根瘤菌目(Rhizobiales)，證明土壤中根瘤菌的存在是蚯蚓排放氧化亞氮的重要原因之一。氨氧化菌是硝化作用的主要參與者，可以將氨氧化為硝酸[64]。在Singh等[12]的研究中，分別在赤子愛(ài)勝蚓和掘穴環(huán)爪蚓腸道中檢測(cè)出24%和14%的氨氧化菌，同時(shí)，還在2種蚯蚓腸道中檢測(cè)到固氮菌(7%和2%)、亞硝酸鹽還原菌(15%和9%)的存在。因此，蚯蚓腸道內(nèi)生菌群是土壤氮循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)因素。

細(xì)菌通過(guò)碳固定和甲烷代謝等過(guò)程參與土壤中的碳循環(huán)，對(duì)全球氣候變化和陸地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有著重要的作用。蚯蚓腸道是富含糖類的厭氧環(huán)境，給腸道細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)甲烷反應(yīng)創(chuàng)造了便利的條件，對(duì)土壤碳循環(huán)有一定的促進(jìn)作用[65]。Depkat-Jakob等[65]通過(guò)對(duì)甲基-CoM還原酶相關(guān)的基因(mcrA)轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)Eudriluseugeniae具有排放甲烷的能力是因?yàn)槟c道中含有球菌科(Methanosarcinaceae)、甲烷菌科(Methanobacteriaceae)和甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)等細(xì)菌；這些細(xì)菌可以參與腸道中的葡萄糖發(fā)酵，生成甲烷并伴有二氧化碳的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)碳的循環(huán)[60](圖2)。此外，蚯蚓還可通過(guò)加快有機(jī)質(zhì)的分解實(shí)現(xiàn)對(duì)碳的轉(zhuǎn)化。姜炳棋等[66]利用14C示蹤技術(shù)，探究了威廉腔環(huán)蚓(Metaphireguillelmi)對(duì)14C-土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究，結(jié)果表明，蚯蚓腸道對(duì)有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化有著顯著影響，并發(fā)現(xiàn)蚯蚓腸道內(nèi)生細(xì)菌對(duì)于原始有機(jī)質(zhì)的礦化具有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)礦化后的有機(jī)質(zhì)殘留物有穩(wěn)定化作用。蚯蚓腸道細(xì)菌不但可以礦化有機(jī)質(zhì)，還通過(guò)腸道糖發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳和甲烷實(shí)現(xiàn)對(duì)碳的轉(zhuǎn)化，對(duì)土壤的碳循環(huán)具有積極的影響。

土壤中95%～99%的磷是難溶性的，只有通過(guò)無(wú)機(jī)磷酸鹽的溶解和有機(jī)磷酸鹽的礦化之后才能轉(zhuǎn)化為可利用的形態(tài)[67]。有研究表明，蚯蚓腸道細(xì)菌具有溶解無(wú)機(jī)磷酸鹽、增加有效態(tài)磷的能力[30,59]。Biswas等[30]在土后腔環(huán)蚓腸道中分離出3株具有溶解磷酸鹽的細(xì)菌，經(jīng)鑒定后分別為Bacillusmegateriumstrain MF 589715、Staphylococcushaemolyticusstrain MF 589716和Bacilluslicheniformisstrain MF 589720；將這3種菌置于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)96 h后，分別產(chǎn)生214、194和222 mg·L-1的可溶性磷酸鹽，被視為可溶性磷酸鹽的潛在供體，具有非常高的利用價(jià)值(圖2)。另外，Hussain等[59]發(fā)現(xiàn)赤子愛(ài)勝蚓腸道中有溶磷菌的存在，如沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬，能將堆肥中的可利用磷含量由初始的46 mg·kg-1上升到215 mg·kg-1(第60天)。Sahariah等[68]的研究表明，蚯蚓腸道細(xì)菌能溶解磷酸鹽是因?yàn)椴糠旨?xì)菌能分泌磷酸酶(phosphatase)，將磷酸酯轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)磷。因此，利用蚯蚓腸道細(xì)菌溶解磷酸鹽是增加磷可利用態(tài)的有效途徑之一。

4 蚯蚓腸道細(xì)菌群落的功能基因多樣性(Functional gene diversity of earthworm intestinal bacterial communities)

反硝化作用是土壤生態(tài)系統(tǒng)中氮元素循環(huán)轉(zhuǎn)化的重要途徑，在厭氧環(huán)境中可以利用硝酸鹽還原酶(nar)、亞硝酸還原酶(nir)和一氧化亞氮還原酶(nos)等逐步還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，最終生成含氮?dú)怏w的過(guò)程，因此，nirS、nirK、narG和nosZ等基因豐度波動(dòng)情況可以反映反硝化菌的活性和數(shù)量變化[69-70]。Kotzerke等[69]為探究磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)對(duì)赤子愛(ài)勝蚓腸道反硝化菌的影響，將蚯蚓喂養(yǎng)在被磺胺嘧啶污染的環(huán)境中，2周后檢測(cè)到蚯蚓腸道中的nirK和nirS的豐度降低近一個(gè)數(shù)量級(jí)，進(jìn)而得出磺胺嘧啶對(duì)腸道中的反硝化菌的活性存在抑制作用；Depkat-Jakob等[70]對(duì)粉正蚓和陸正蚓腸道內(nèi)容物中narG和nosZ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)腸道和土壤上層的narG轉(zhuǎn)錄物與放線菌門有較高的同源性，同時(shí)蚯蚓腸道和土壤中nosZ的轉(zhuǎn)錄物與變形菌門具有較高的同源性。因此，得出腸道中反硝化菌源自土壤，并且絕大多數(shù)屬于放線菌門和變形菌門。蚯蚓腸道中的厭氧發(fā)酵菌(anaerobic fermentation bacteria, AFB)在[NiFe]和[FeFe]2種氫化酶的作用下參與發(fā)酵并產(chǎn)生氫氣。因此，對(duì)[NiFe]和[FeFe]2種氫化酶轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行多樣性分析可以推測(cè)腸道中厭氧發(fā)酵菌群[71](圖3)。Schmidt等[71]分別對(duì)陸正蚓腸道中2種氫化酶的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)178個(gè)[FeFe]轉(zhuǎn)錄物中有177個(gè)與梭菌目(Clostridiales)相關(guān)，而84個(gè)[NiFe]轉(zhuǎn)錄物中，79%與腸桿菌科(Enterobacteriaceae)有關(guān)。因此，得出梭菌目和腸桿菌科是腸道中活躍的發(fā)酵群。Wang等[72]對(duì)Metaphiresieboldi腸道中砷生物轉(zhuǎn)化基因(arsenic biotransformation genes, ABGs)進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)在16個(gè)砷生物轉(zhuǎn)化基因中，絕大多數(shù)為砷外排基因和砷氧化還原基因，進(jìn)而得出蚯蚓腸道砷生物轉(zhuǎn)化細(xì)菌(arsenic biotransformation bacteria, ABB)主要通過(guò)砷外排和氧化還原來(lái)減輕砷的毒害(圖3)。此外，當(dāng)蚯蚓受到外來(lái)污染物侵染，并且細(xì)胞受到氧化傷害時(shí)，為了抵御這種氧化應(yīng)激(oxidative stress, OS)，蚯蚓會(huì)通過(guò)調(diào)控一些功能基因的表達(dá)來(lái)維持自身機(jī)能的穩(wěn)定，例如，調(diào)控超氧化物歧化酶相關(guān)的基因(sod)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的基因(gst)[73]。Shi等[74]將赤子愛(ài)勝蚓培養(yǎng)在含400 mg·kg-1六溴環(huán)十二烷的土壤中，14 d后發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)sod和gst表達(dá)量分別是對(duì)照組的2倍和4倍。另外，蚯蚓還可以通過(guò)解毒基因削弱污染物帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)，例如，編碼細(xì)胞色素P450的基因(CYP450)。Li等[75]發(fā)現(xiàn)當(dāng)恩諾沙星的濃度為1 mg·kg-1時(shí)，CYP450表達(dá)量是對(duì)照的2倍，蚯蚓的解毒能力得以提升；而當(dāng)恩諾沙星的濃度為100 mg·kg-1時(shí)，基因表達(dá)僅為對(duì)照的一半，蚯蚓的解毒能力受到了抑制，因此，CYP450的表達(dá)狀態(tài)可以作為蚯蚓解毒能力的指示參考。綜上，蚯蚓腸道功能基因的豐度變化不但能用來(lái)指示腸道功能細(xì)菌結(jié)構(gòu)、數(shù)量、功能及活性，而且還可以作為化學(xué)物質(zhì)對(duì)蚯蚓毒理學(xué)作用的重要指標(biāo)。

圖2 蚯蚓腸道細(xì)菌對(duì)土壤物質(zhì)循環(huán)的影響Fig. 2 The effect of earthworm intestinal bacteria on soil substance circulation

圖3 蚯蚓腸道細(xì)菌群落的功能基因多樣性Fig. 3 Functional gene diversity of earthworm intestinal bacterial communities

5 總結(jié)與展望(Conclusion and prospect)

近年來(lái)關(guān)于蚯蚓腸道微生物群落組成的研究受到了越來(lái)越多的關(guān)注，然而針對(duì)蚯蚓腸道功能細(xì)菌及功能基因的研究還相對(duì)較少，仍有一些關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題需要闡明。(1)蚯蚓腸道菌群對(duì)土壤中污染物的降解與解毒機(jī)制。目前，已有較多研究表明，蚯蚓在促進(jìn)污染土壤的生態(tài)修復(fù)過(guò)程中扮演了重要的作用，但是關(guān)于蚯蚓腸道內(nèi)生細(xì)菌對(duì)有機(jī)污染物的降解及重金屬毒害的解毒機(jī)制仍有待進(jìn)一步探明。(2)蚯蚓腸道細(xì)菌功能基因的耦合作用機(jī)制。蚯蚓腸道細(xì)菌的生態(tài)功能與其功能基因的表達(dá)密不可分，目前，已有研究對(duì)蚯蚓腸道內(nèi)的硝化基因、反硝化基因和產(chǎn)甲烷基因賦存規(guī)律及表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行研究，然而針對(duì)腸道中有機(jī)污染物降解基因、抗生素抗性基因和重金屬解毒基因的報(bào)道卻相對(duì)較少，特別是針對(duì)不同功能基因之間的耦合作用機(jī)制，都是值得深入探究的科學(xué)問(wèn)題。(3)蚯蚓腸道微生物組在土壤物質(zhì)循環(huán)的作用機(jī)制。蚯蚓腸道微生物組囊括了內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、組成與功能多樣性和穩(wěn)定性的綜合特征，同時(shí)也包括腸道微生物群落中關(guān)于養(yǎng)分元素吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、同化和異化作用等系列功能基因的表達(dá)，這些都會(huì)直接影響蚯蚓對(duì)不同類型碳、氮、磷和硫等元素的轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而間接影響土壤物質(zhì)元素循環(huán)的周轉(zhuǎn)速率、遷移途徑與賦存形態(tài)，因此，蚯蚓腸道微生物組在土壤物質(zhì)循環(huán)的作用機(jī)制仍是今后關(guān)注的研究熱點(diǎn)。