楊蓉，馬梅，王子健

1. 北京市南水北調(diào)水質(zhì)監(jiān)測(cè)中心，北京 100093 2. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國(guó)科學(xué)院飲用水科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100190

最近數(shù)十年來(lái)，合成及天然化合物干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)這一問(wèn)題已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注，分析測(cè)試技術(shù)的發(fā)展和持續(xù)不斷的污染物排放也造成了水體中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)的檢出率和檢出濃度越來(lái)越高[1]。廣泛的證據(jù)表明，EDCs會(huì)對(duì)野生生物乃至人類(lèi)繁殖和發(fā)育產(chǎn)生不良效應(yīng)，而生物體在環(huán)境濃度(ng·L-1)的EDCs下長(zhǎng)期暴露所受到的影響備受關(guān)注[2-4]。

雌激素干擾物(estrogenic disruptors, EEs)是最先被研究的一類(lèi)EDCs。由于生物體對(duì)內(nèi)源雌激素高度敏感，雌激素在很低濃度下即可發(fā)揮作用，因此，環(huán)境中的EEs可以在低濃度下模擬或干擾雌激素的正常功能和生理過(guò)程，從而干擾免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等功能。EEs導(dǎo)致的人類(lèi)生殖系統(tǒng)腫瘤、野生生物的雙性化和雌性化、水生動(dòng)物種群生存力和資源量下降很早就引起科學(xué)界和大眾的關(guān)注。很多藥品、農(nóng)藥、工業(yè)產(chǎn)品和副產(chǎn)品都被證明具有雌激素干擾效應(yīng)，包括作為避孕藥主要成分的乙炔基雌二醇、效應(yīng)弱于天然激素但環(huán)境水平較高的雙對(duì)氯苯基三氯乙烷(DDT)[5-6]、塑料中常含有的雙酚A[7-8]、用作冷卻劑和潤(rùn)滑劑的多氯聯(lián)苯類(lèi)化合物[9]等。隨著在全世界的廣泛使用，EEs匯入或殘留在環(huán)境中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)健康造成威脅[10]。

單一化合物由于其在環(huán)境中非常低的濃度和效應(yīng)水平使得人們忽視其可能的環(huán)境和健康風(fēng)險(xiǎn)；然而，EEs通常不會(huì)在環(huán)境中單獨(dú)存在，而是和不同來(lái)源多種物質(zhì)共存，這就意味著可能對(duì)生物造成與單獨(dú)作用完全不同的聯(lián)合毒性，造成所謂的“something from nothing (無(wú)中生有)”和“a lot from a little (積少成多)”現(xiàn)象。因此，監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)環(huán)境中EEs的影響，僅通過(guò)測(cè)定一種或幾種典型污染物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。需要跳出傳統(tǒng)的毒性研究和環(huán)境管理思路，從整體毒性和聯(lián)合效應(yīng)的角度看待復(fù)合污染問(wèn)題。近年來(lái)，出于對(duì)EEs混合物的重視，科學(xué)界從數(shù)學(xué)和生理生化等角度開(kāi)展了大量研究。筆者總結(jié)和評(píng)述了這一領(lǐng)域常用的模型方法，并展望了未來(lái)的發(fā)展方向。

1 EEs與加和模型(EEs and additional models)

對(duì)環(huán)境中的EEs進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估，化學(xué)分析和生物測(cè)試都是常用的方法?；瘜W(xué)分析能對(duì)樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，離體生物測(cè)試一般是對(duì)樣品進(jìn)行快速初篩，確定其中是否含有效應(yīng)貢獻(xiàn)物，活體生物測(cè)試一般用于提供化合物與生物體更復(fù)雜詳細(xì)的相互作用信息。因此，化學(xué)分析和生物測(cè)試、不同的生物測(cè)試方法之間需要相互結(jié)合和互為補(bǔ)充，而對(duì)聯(lián)合效應(yīng)的探討在其中起到橋梁的作用。

1.1 常用的EEs聯(lián)合效應(yīng)研究方法及預(yù)測(cè)模型

目前，對(duì)于EEs的聯(lián)合效應(yīng)研究，離體(invitro)和活體(invivo)方法均有涉及(表1)。這些研究通過(guò)比較模型預(yù)測(cè)獲得的和實(shí)驗(yàn)測(cè)定獲得的混合物效應(yīng)，評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性，并考量所選模型的適用性[11-24]。

表1 雌激素與類(lèi)雌激素聯(lián)合效應(yīng)的研究Table 1 Published researches on combined effects of estrogenic agonists

由表1可知，雖然目前已有許多研究相互作用的方法被開(kāi)發(fā)和報(bào)道，但實(shí)際上在雌激素和類(lèi)雌激素聯(lián)合作用的研究中，基本還是用最經(jīng)典的濃度加和(concentration addition, CA)模型進(jìn)行混合物毒性描述。很多研究證明，EEs的聯(lián)合效應(yīng)符合CA模型，這一點(diǎn)在測(cè)試酶活性的重組酵母實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)卵黃蛋白原含量的魚(yú)類(lèi)暴露實(shí)驗(yàn)中更加常見(jiàn)。然而，盡管CA模型在混合物毒性研究中廣泛應(yīng)用，它并不適用于所有情況。當(dāng)生物過(guò)程涉及到多種作用方式(mode of action, MoA)時(shí)，例如以細(xì)胞增殖、性別決定和子宮增重作為測(cè)試終點(diǎn)，混合物會(huì)表現(xiàn)出非加和現(xiàn)象(non-additivity)。此時(shí)用CA模型預(yù)測(cè)聯(lián)合效應(yīng)會(huì)產(chǎn)生結(jié)果偏差，且偏離方向(協(xié)同作用或拮抗作用)與受試混合物中的組分有關(guān)。

例如，研究者發(fā)現(xiàn)使用雌激素、酚類(lèi)、鄰苯二甲酸酯和有機(jī)氯農(nóng)藥組成的二元混合物聯(lián)合染毒MCF-7細(xì)胞時(shí)，雌二醇和雙酚A具有明顯的協(xié)同作用，而其他8個(gè)混合物呈現(xiàn)出弱協(xié)同、加和和弱拮抗作用[15]。另一項(xiàng)針對(duì)天然雌激素、合成雌激素和酚類(lèi)化合物的聯(lián)合毒性研究表明，MCF-7細(xì)胞在包含雌二醇、乙炔雌二醇、染料木黃酮和雙酚A的三元和四元混合物暴露下的增殖符合CA模型，但當(dāng)添加了壬基酚和辛基酚時(shí)，觀察到出現(xiàn)拮抗作用[16]。因此，選擇哪個(gè)效應(yīng)終點(diǎn)開(kāi)展生物測(cè)試，在一定程度上決定了模型是否適用。在多重MoA的情況下，可采用CA模型作為基準(zhǔn)判斷相互作用方向，但當(dāng)研究中涉及混合物效應(yīng)預(yù)測(cè)，對(duì)CA的使用應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。

盡管如此，CA模型依然在環(huán)境管理中得到了最廣泛的應(yīng)用。它的數(shù)據(jù)處理方式相對(duì)簡(jiǎn)單，而且會(huì)在一定程度上高估聯(lián)合作用，有利于潛在風(fēng)險(xiǎn)的識(shí)別和預(yù)防，這些都是推廣過(guò)程中的天然優(yōu)勢(shì)[25]。與之相比，為深入闡釋聯(lián)合毒性開(kāi)展的毒理學(xué)過(guò)程研究涉及過(guò)多的效應(yīng)終點(diǎn)和MoA，形式復(fù)雜，目前基本限于實(shí)驗(yàn)室研究，距離解決實(shí)際問(wèn)題還有很長(zhǎng)的路要走。

1.2 CA模型的改進(jìn)

在長(zhǎng)久的實(shí)際應(yīng)用中，研究人員也在根據(jù)實(shí)際需要對(duì)CA模型進(jìn)行修正。傳統(tǒng)的CA模型及其衍生出的雌二醇當(dāng)量(estradiol equivalent, EEQ)法建立在一個(gè)前提下：混合物各組分僅與單一的作用位點(diǎn)(target of action, ToA)發(fā)生作用，所有物質(zhì)的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)具有相同的最大作用效力和斜率，沿x軸互相平行，僅在毒性強(qiáng)度上有所區(qū)別[26]。因此，僅需得到不同組分的半數(shù)效應(yīng)濃度(half-effective concentration, EC50)，即可通過(guò)下式計(jì)算雌激素效應(yīng)[27]：

式中：ci表示第i個(gè)化合物在聯(lián)合作用時(shí)的濃度，ECxE2和ECxi分別代表作為標(biāo)準(zhǔn)雌激素的17β-雌二醇(E2)和第i個(gè)組分在產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)的濃度，此處一般為EC50。

這一前提在完全誘導(dǎo)物(如類(lèi)固醇激素)上是適用的。然而，還存在大量的部分誘導(dǎo)物(如酚類(lèi)化合物)，它們?cè)谌魏螡舛认露歼_(dá)不到完全誘導(dǎo)物的最大效應(yīng)，這種最大作用效力上的差異完全不在CA模型的考量之內(nèi)，導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果不夠全面。為解決這個(gè)問(wèn)題，廣義濃度加和模型(generalized concentration addition, GCA)將最大作用效力也納入考量，便可更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)含有部分誘導(dǎo)物的混合物或環(huán)境樣品的整體效應(yīng)[28]。其可表示為：

式中：Emix表示混合物的聯(lián)合毒效應(yīng)，ci、ai和EC50i分別表示組分i的暴露濃度、最大作用效力和EC50值[29]。

在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步的是完全Logistic模型(full logistic model, FLM)，它將劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)幾乎所有擬合參數(shù)(包括混合物組分的最大和最小作用效力、EC50、斜率)全部囊括其中。即使這些參數(shù)各不相同，F(xiàn)LM也能提供令人滿(mǎn)意的預(yù)測(cè)結(jié)果[30]。其可表示為：

式中：Emix表示混合物的聯(lián)合毒效應(yīng)，Maxi、Mini、ci、EC50i和pi分別表示組分i的最大作用效力、最小作用效力、暴露濃度、EC50值和曲線(xiàn)斜率。FLM甚至可以將模擬天然激素作用的誘導(dǎo)物和拮抗這一作用的拮抗物納入一個(gè)體系，認(rèn)為拮抗物是部分誘導(dǎo)物的極端情況(最大作用效力為零)，只能結(jié)合受體，但無(wú)法啟動(dòng)后續(xù)生物過(guò)程[31]。

Schlotz等[32]用受體結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬比較了CA、GCA和FLM這3種方法的預(yù)測(cè)能力，結(jié)果表明，CA模型更適合預(yù)測(cè)毒性強(qiáng)度(EC50)，GCA在預(yù)測(cè)最大作用效力上更有優(yōu)勢(shì)，而FLM在計(jì)算機(jī)模擬混合物毒性方面表現(xiàn)良好，且集合了CA和GCA的優(yōu)點(diǎn)。我們經(jīng)常探討CA模型的適用性和適用范圍，強(qiáng)調(diào)為特定情況選擇合適的模型。但從另一個(gè)角度，不斷發(fā)展和修正CA，讓這個(gè)在接近100年前提出的模型適應(yīng)更多的實(shí)際情況，不斷煥發(fā)出新的活力，這也具有非常重要的意義。

2 EEs混合物暴露下的生物過(guò)程(Action mechanisms under exposure to EEs mixture)

經(jīng)過(guò)數(shù)十年的應(yīng)用，CA模型在環(huán)境管理的角度解決了混合物風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和評(píng)估的很多現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。然而，作為一個(gè)數(shù)學(xué)模型，CA模型幾乎不對(duì)生物體的復(fù)雜性進(jìn)行描述。生物在其框架下只是一個(gè)黑箱，CA模型負(fù)責(zé)在單一MoA的假設(shè)下給出計(jì)算結(jié)果。

當(dāng)混合物毒性研究進(jìn)一步發(fā)展，終歸無(wú)法繞開(kāi)對(duì)生物過(guò)程和信號(hào)通路的詳細(xì)探索。研究者需要得知混合物中的每個(gè)組分在生物體內(nèi)是如何影響通路和改變酶活性，進(jìn)而改變生物大分子的濃度水平，最終影響測(cè)試終點(diǎn)的。

通常而言，EEs可以通過(guò)以下幾種作用方式在生物體內(nèi)發(fā)揮作用：

(1) 與雌激素受體(estrogen receptor, ER)直接結(jié)合：可以模擬天然激素與ER相互作用的受體誘導(dǎo)物，稱(chēng)為雌激素或類(lèi)雌激素[33]；

(2) 與天然激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體：同ER有親和力、但結(jié)合受體后不進(jìn)行后續(xù)生物過(guò)程、對(duì)基因轉(zhuǎn)錄沒(méi)有明顯影響的受體拮抗物，稱(chēng)為抗雌激素[34]；

(3) 影響受體的數(shù)量：某些EEs(如酚類(lèi)化合物)的存在會(huì)干擾ER的合成與分解代謝，從而導(dǎo)致受體體內(nèi)水平的改變[35]；

(4) 影響激素的合成-分布-代謝-排出(absorption-distribution-metabolism-excretion, ADME)過(guò)程：不與受體發(fā)生作用，而是通過(guò)干擾信號(hào)調(diào)節(jié)、干擾受體合成、刺激激素或受體表達(dá)等過(guò)程影響內(nèi)分泌系統(tǒng)；

(5) 影響內(nèi)分泌系統(tǒng)與其他系統(tǒng)的調(diào)控作用：使神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等受到傷害，干擾神經(jīng)發(fā)育過(guò)程，引發(fā)免疫毒性和致癌性，對(duì)認(rèn)知功能、情感反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)均有影響，甚至導(dǎo)致腦組織形態(tài)發(fā)生變化[36]。

經(jīng)常有化合物同時(shí)具有幾方面的作用機(jī)制，其本身就在體內(nèi)多個(gè)靶位點(diǎn)上產(chǎn)生影響。這使混合物的作用更加復(fù)雜，若選擇較為綜合的效應(yīng)終點(diǎn)，如致死率、孵化率等，會(huì)大大增加解釋和預(yù)測(cè)結(jié)果的難度。

2.1 抗雌激素的聯(lián)合作用

抗雌激素可以干擾或阻斷天然激素在體內(nèi)與生物大分子的作用過(guò)程，抑制雌激素效應(yīng)。在經(jīng)典的基因組通路中，抗雌激素和天然激素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體，但不具有激素的生理效應(yīng)，降低了內(nèi)源激素的作用[34]。因此，雌激素和類(lèi)雌激素在“具有相同的MoA和ToA”的分類(lèi)框架下屬于同一類(lèi)物質(zhì)，而抗雌激素屬于另一類(lèi)[37]。因此，絕大部分EEs聯(lián)合作用研究的受試物都是雌激素和類(lèi)雌激素。針對(duì)不同種類(lèi)EEs(如雌激素和抗雌激素)所組成的混合物的研究較少。

部分涉及抗雌激素聯(lián)合作用的研究常使用特定濃度的雌激素和抗雌激素分別和共同暴露。在一篇EEs混合物對(duì)斑馬魚(yú)胚胎聯(lián)合毒性的報(bào)道中，研究者考察了固定濃度的類(lèi)雌激素2-(2-氯苯基)-2-(4-氯苯基)-1,1,1-三氯乙烷(o,p’-DDT)和3個(gè)濃度梯度抗雌激素氟維斯群?jiǎn)为?dú)以及聯(lián)合暴露時(shí)胚胎的孵化率、孵化時(shí)間、畸形率和相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化[38]；另一項(xiàng)研究采用了相似的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，受試物是固定濃度的雌二醇和3個(gè)濃度梯度的來(lái)曲唑或他莫昔芬混合物，效應(yīng)終點(diǎn)包括日本青鳉的孵化率、孵化時(shí)間、性別比、血漿卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)濃度和vtg1基因表達(dá)量[39-40]。

這種雌激素濃度保持不變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更適用于研究和評(píng)估藥效，描述抗雌激素藥物如何降低生物體內(nèi)特定雌激素水平。名為考察二者的聯(lián)合效應(yīng)，實(shí)際上重點(diǎn)考察了抗雌激素對(duì)雌激素效應(yīng)的拮抗效果。實(shí)際環(huán)境中情況更加復(fù)雜，更常見(jiàn)的是隨著樣品濃縮和稀釋?zhuān)珽Es混合物的各組份濃度同比例變化。在這種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，重組基因雙雜交酵母測(cè)試結(jié)果證明，抗雌激素的存在會(huì)改變測(cè)試結(jié)果的劑量效應(yīng)曲線(xiàn)，當(dāng)其與雌激素達(dá)到某一比例時(shí)能完全掩蔽雌激素的作用[41]。因此，不僅是環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和人類(lèi)健康，從環(huán)境監(jiān)測(cè)和管理的角度看，對(duì)抗雌激素聯(lián)合效應(yīng)的評(píng)估也需要受到關(guān)注。

更進(jìn)一步地，上文所述FLM方法從數(shù)學(xué)角度給出了更加普適的解決方案。雌激素和抗雌激素進(jìn)入生物體內(nèi)，第一步都是結(jié)合ER，導(dǎo)致受體構(gòu)象發(fā)生改變。二者區(qū)別在于第二步，配體-受體復(fù)合物暴露的結(jié)合位點(diǎn)可募集不同的輔助調(diào)節(jié)因子，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[42]：雌激素、ER和共激活因子的復(fù)合物可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，抗雌激素、ER和共抑制因子的復(fù)合物則可抑制轉(zhuǎn)錄。若從“受體親和性”和“作用效力”2個(gè)維度考察EEs，它們的關(guān)系如圖1所示?？勾萍に乇豢醋鳌白饔眯Я榱恪钡拇萍に?，弱雌激素則可以在“作用效力和受體親和性都比較低的雌激素”和“這2項(xiàng)均遠(yuǎn)低于雌二醇，因此在體內(nèi)共存時(shí)表現(xiàn)出一定拮抗能力”的2個(gè)角色之間轉(zhuǎn)換，全部通過(guò)FLM的體系進(jìn)行預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)。

圖1 雌激素、弱雌激素和抗雌激素的關(guān)系Fig. 1 Relationship between estrogen, weak estrogen and anti-estrogen

要注意的是，抗雌激素并不是全部通過(guò)基因組作用發(fā)揮拮抗效力。例如，與和雌二醇競(jìng)爭(zhēng)受體的他莫昔芬不同，來(lái)曲唑可在體內(nèi)抑制睪酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化，降低雌激素濃度水平，通過(guò)干擾激素的ADME過(guò)程引起雌激素調(diào)節(jié)紊亂[39]。這種類(lèi)型的拮抗用FLM方法是無(wú)法處理的。

2.2 生物體的復(fù)雜通路：以MCF-7細(xì)胞為例

MCF-7細(xì)胞增殖試驗(yàn)是一種識(shí)別雌激素活性物質(zhì)的簡(jiǎn)單有效的方法，被廣泛用于各種化合物的雌激素效應(yīng)評(píng)估[43-44]和環(huán)境樣品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[45-46]，可在細(xì)胞水平上反映EEs的作用。目前已有很多研究關(guān)注雌激素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞增殖的機(jī)理，大多數(shù)研究者相信雌激素是通過(guò)結(jié)合細(xì)胞核中的ERα，通過(guò)雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element, ERE)與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期控制有關(guān)的關(guān)鍵基因，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖。但除此之外，也有報(bào)道指出人體內(nèi)大約1/3能被ER調(diào)控的基因中并不含ERE片段，說(shuō)明ER還可通過(guò)其他機(jī)理調(diào)節(jié)基因表達(dá)[47]。甚至有研究證明，雌激素可以不直接通過(guò)受體和DNA發(fā)揮作用，而是通過(guò)抑制一些調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白活性(如MLK3和NFκB)導(dǎo)致癌細(xì)胞失控生長(zhǎng)[48]。

增殖相關(guān)的主要MoA可分為以下3類(lèi)：(1) ER通過(guò)ERE與DNA直接結(jié)合；(2) ER與DNA通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)間接結(jié)合，可與前者合稱(chēng)為基因組作用；(3) 非基因組作用，雌激素配體受體復(fù)合物在細(xì)胞核外誘導(dǎo)一系列蛋白激酶的變化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖[49]。后2個(gè)MoA擴(kuò)充了傳統(tǒng)上對(duì)ER的MoA的認(rèn)知：與DNA間接結(jié)合的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明不含ERE的基因也可受到ER調(diào)節(jié)，使一大部分參與細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)的基因進(jìn)入我們的關(guān)注范圍；而非基因組作用說(shuō)明ER和配體的復(fù)合物甚至不需要進(jìn)入細(xì)胞核與DNA作用，就可在細(xì)胞質(zhì)里直接調(diào)控蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化。因此，細(xì)胞增殖是數(shù)量繁多的受體、酶和基因在配體的存在下相互作用的綜合結(jié)果，這加大了分析和預(yù)測(cè)EEs混合物誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用的難度，也預(yù)示著活體生物聯(lián)合毒性研究的難度。

有研究者考察了EEs暴露對(duì)核受體、非核受體及PI3K/AKT通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)以17β-雌二醇為代表的雌激素主要通過(guò)調(diào)節(jié)核受體ER發(fā)揮作用，而以雙酚A為代表的酚類(lèi)化合物主要通過(guò)影響非基因組作用的G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30, GPR30)產(chǎn)生效應(yīng)。當(dāng)二者聯(lián)合暴露時(shí)，混合物對(duì)PI3K/AKT通路的數(shù)個(gè)基因顯示出部分加和、部分等效、部分拮抗等復(fù)雜影響，導(dǎo)致細(xì)胞增殖的結(jié)果偏離了CA，而效應(yīng)加和模型能更好地描述其結(jié)果[24]。但是就研究清楚17β-雌二醇和雙酚A對(duì)MCF-7的增殖效應(yīng)而言，僅PI3K/AKT通路的數(shù)據(jù)還不夠，甚至轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，因此尚有大片的空白需要填補(bǔ)。

2.3 新方法的探索

環(huán)境中的EEs數(shù)量眾多，生物通過(guò)食物、飲水和呼吸等多種途徑暴露其中。我們無(wú)法測(cè)試所有的污染物組合，現(xiàn)有的完全混合物的毒性數(shù)據(jù)局限在有限數(shù)目的混合物上，基于組分的評(píng)價(jià)方法也缺乏大量的毒性、劑量效應(yīng)和MoA等基礎(chǔ)資料。所以，我們需要能提供更多信息并綜合處理這些信息的實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算工具。

在這些新方法中，毒代動(dòng)力學(xué)、離體測(cè)試方法、組學(xué)(包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組)和定量構(gòu)效關(guān)系(quantitative structure-activity relationship, QSAR)等都可以補(bǔ)充缺乏的混合物暴露和毒性的數(shù)據(jù)資料。這些信息被綜合到有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的研究框架內(nèi)，從每個(gè)混合物組分的分子起始事件(molecular initiating event, MIE)開(kāi)始，通過(guò)一系列關(guān)鍵事件(key event, KE)導(dǎo)向有害結(jié)局(adverse outcome, AO)(圖2)[50]。這種數(shù)據(jù)整合還可以逆向快速識(shí)別導(dǎo)致AO和聯(lián)合效應(yīng)的化合物組分，找到數(shù)據(jù)缺乏的位置，并計(jì)劃之后的測(cè)試需求；也可用于基于MoA的化合物分組，這是混合物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的一個(gè)重點(diǎn)步驟。

圖2 有害結(jié)局路徑(AOP)框架整合單一化合物的毒性信息Fig. 2 Toxicity information of mixture components under the adverse outcome pathway (AOP) frameworkNote: MIE stands for molecular initiating event; KE stands for key event; AO stands for adverse outcome; QSAR stands for quantitative structure-activity relationship.

目前，環(huán)境組學(xué)、AOP和QSAR等方法還未得到足夠的驗(yàn)證和充分的發(fā)展，而且缺乏政策和立法的推動(dòng)[51]。但即使如此，業(yè)界也普遍承認(rèn)它們未來(lái)的價(jià)值。有研究者利用離體測(cè)試和毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)推測(cè)雙酚A、染料木黃酮和4-正壬基酚在活體測(cè)試中的雌激素效應(yīng)，最后發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)際結(jié)果有偏離。作者認(rèn)為偏離的原因?yàn)檠芯恐袃H考慮了肝臟清除速率，對(duì)ADME這一復(fù)雜過(guò)程考慮得不夠全面[52]。但這種嘗試對(duì)推動(dòng)EEs及EEs混合物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是有益的，也符合綜合組學(xué)、靶向測(cè)試技術(shù)和計(jì)算毒理學(xué)方法來(lái)取得突破性成果的研究方向。

3 展望(Perspective)

EEs的聯(lián)合毒性研究是一個(gè)意義非凡而又極具挑戰(zhàn)性的課題。一方面，對(duì)EEs混合物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的研究早已廣泛開(kāi)展，無(wú)論是針對(duì)水體、土壤等環(huán)境樣品的整體混合物方法還是以加和模型為代表的基于組分的方法均有大量的研究和應(yīng)用；另一方面，通過(guò)生物測(cè)試和模擬計(jì)算對(duì)EEs生物行為的詳細(xì)探討也取得了諸多成果，有利于深入了解組分之間的相互作用，以降低聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測(cè)結(jié)果的偏離。

然而，現(xiàn)實(shí)中這兩者經(jīng)常是割裂的。由于體內(nèi)代謝、靶位點(diǎn)和MoA等數(shù)據(jù)和資料的缺乏，與生物過(guò)程相關(guān)的聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)方法很少得到實(shí)際應(yīng)用，且它們復(fù)雜的公式和計(jì)算工具令人望而生畏。因此，我們需要系統(tǒng)地、有計(jì)劃地開(kāi)展代表性EEs的生理毒理信息獲取及匯總；同時(shí)，對(duì)新方法的研發(fā)需要更多地考慮其應(yīng)用，仔細(xì)評(píng)價(jià)它與舊模型預(yù)測(cè)效果的差異，尋找推廣的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。不可否認(rèn)，CA模型擁有簡(jiǎn)單易用的公式和在一定范圍內(nèi)完全可接受的預(yù)測(cè)效果，這種便捷有效在很大程度上沖淡了它的模糊粗糙等缺點(diǎn)，就算新方法的預(yù)測(cè)精度極高，一旦使用不易，CA還是很難被其替代。

在我國(guó)，科學(xué)界對(duì)EEs的研究已有20多年，在此期間就其環(huán)境分布、遷移轉(zhuǎn)化、生物效應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等方面獲得了大量數(shù)據(jù)。但目前EEs還未受到監(jiān)測(cè)部門(mén)的關(guān)注，我們面臨的現(xiàn)狀是，相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)如《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838—2002)、《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749—2006)都是10多年前頒布的，不能反映近年來(lái)對(duì)新型污染物的重視。另外，我國(guó)的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)是建立在單一污染物的濃度限值之上，而環(huán)境中工業(yè)、農(nóng)業(yè)和生活來(lái)源的多種物質(zhì)都具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，如何從復(fù)合污染的角度控制EEs排放，保護(hù)人體健康，也是管理部門(mén)需要思考的問(wèn)題。對(duì)監(jiān)測(cè)單位而言，對(duì)EEs的管理和監(jiān)控還需轉(zhuǎn)變一味關(guān)注目標(biāo)化合物的思路，以效應(yīng)為導(dǎo)向的方法結(jié)合主要貢獻(xiàn)物識(shí)別和溯源可能是未來(lái)的發(fā)展方向。