宋廣浩 沈 瀚 寧明哲

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多系統(tǒng)損害為表現(xiàn)的自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制涉及眾多免疫細(xì)胞與因子。目前研究[1]認(rèn)為，淋巴細(xì)胞亞群分布改變參與SLE發(fā)病，CD4+T細(xì)胞的數(shù)量和功能異常是SLE患者T細(xì)胞免疫功能異常的重要原因。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17, Th17)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是CD4+T細(xì)胞接受不同的刺激信號分化而來，兩者功能相互抑制，在體內(nèi)保持平衡。白細(xì)胞介素-35(interleukin-35，IL-35)是新發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，與IL-12、IL-23、IL-27共同組成IL-12細(xì)胞因子家族[2]，對于維持Th17/Treg的平衡有重要的作用。研究[3]認(rèn)為，SLE患者體內(nèi)存在著Th17/Treg的失衡，但是關(guān)于IL-35在SLE中的作用報(bào)道較少。因此，本文旨在探究新發(fā)SLE患者IL-35與Th17/Treg平衡的關(guān)系，為SLE的診治提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至4月在南京鼓樓醫(yī)院就診的54例新發(fā)SLE患者為研究對象，其中男性4例，女性50例，年齡19～67歲，平均 (39.0±13.3)歲。按照SLE疾病活動度[4](systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)分為，輕度活動組(SLEDAI：5～9)：26例，男性2例，女性24例，平均年齡(38.6±10.8)歲；中度活動組(SLEDAI:10～15)：10例，男性1例，女性9例，平均年齡(36.8±12.5)歲；重度活動組(SLEDAI：>15)：18例，男性1例，女性17例，平均年齡(40.3±12.7)歲。另外選取同時(shí)期我院體檢中心健康體檢者共30例，其中男性3例，女性27例，年齡21～63歲，平均年齡(37.4±12.6)歲。4組研究對象年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F=0.277，P=0.842；P=1.000*(使用Fisher確切概率法)]，具有可比性。

1.2 SLE患者納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診療指南》[5]者；②未接受免疫治療者；③患者病情處于活動期(SLEDAI≥5)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其它自身免疫性疾?。虎诮诩毙愿腥菊?；③腦血管意外者；④肺結(jié)核者；⑤有精神疾病史；⑥糖尿病者；⑦惡性腫瘤者；⑧接受免疫治療者。

1.3 SLE患者治療 SLE患者按照《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診療指南》[5]選擇治療方案，54例患者中有15例在規(guī)范治療15 d后再次采血檢測，初步分析治療藥物對患者體內(nèi)IL-35、Th17 及Treg的影響。

1.4 方法

1.4.1 試劑與儀器 IL-35 ELISA檢測試劑盒(購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，CD4、CD25、FoxP3、Th17流式抗體、細(xì)胞刺激劑、紅細(xì)胞裂解液(購自BD公司)；細(xì)胞培養(yǎng)液(購自Hyclone公司)；Th17細(xì)胞固定劑與破膜劑、Treg 染色固定劑與破膜劑(購自Invitrogen公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(購自Theromo Fisher 公司)，流式細(xì)胞儀(購自BD公司)。

1.4.2 IL-35血清含量檢測 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取受試者外周靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min獲得血清，嚴(yán)格按照IL-35 ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中IL-35的水平。

1.4.3 Th17、Treg細(xì)胞流式檢測 另抽取EDTA抗凝血2 mL，預(yù)處理后使用流式細(xì)胞儀檢測外周血Th17與Treg細(xì)胞占T細(xì)胞的比例。流式數(shù)據(jù)分析使用BD Cellquest 軟件。

1.5 觀察指標(biāo) ①比較4組研究對象血清IL-35含量，以及外周血Th17、Treg與Th17/Treg的表達(dá)變化。②比較SLE患者治療前后上述指標(biāo)的變化。

2 結(jié)果

2.1 4組研究對象IL-35、Th17和Treg水平比較 SLE患者組Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg比值均高于對照組，SLE患者組IL-35水平、Treg細(xì)胞百分比低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SLE患者重度活動組Th17細(xì)胞百分比較中度活動組升高(P=0.040)，中度活動組較輕度活動組升高(P=0.031)； SLE重度活動組Treg細(xì)胞百分比較輕度活動組降低(P=0.012)，而重度與中度活動組、中度與輕度活動組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.356；P=0.290)；SLE重度與中度活動組Th17/Treg比值較輕度活動組升高(P<0.001；P=0.024)，而重度與中度活動組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.066)； SLE重度與中度活動組IL-35水平較輕度活動組降低(P<0.001；P<0.001),而重度與中度活動組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.097)。見表1。

表1 4組研究對象IL-35、Th17和Treg水平比較

2.2 IL-35與Treg 、Th17 、Th17/Treg和SLEDAI相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，SLE患者IL-35水平與Treg細(xì)胞百分比呈顯著的正相關(guān)性(r=0.373,P=0.006)；IL-35與Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg和SLEDAI呈顯著的負(fù)相關(guān)性(r=-0.563,-0.480,-0.686,P<0.001)。見圖1。

圖1 IL-35與Treg 、Th17 、Th17/Treg和SLEDAI相關(guān)性分析

2.3 15例SLE患者治療前后IL-35、Th17與Treg水平比較 15例SLE患者經(jīng)過15 d有效治療后IL-35與Treg表達(dá)較治療前升高，Th17與Th17/Treg的表達(dá)較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 SLE患者治療前后IL-35、Th17與Treg水平比較

3 討論

新型抑制性細(xì)胞因子IL-35屬于IL-12家族，是α鏈(p35)與β鏈(Ebi3)組成的異質(zhì)二聚體，通過Jak-STAT信號通路參與T細(xì)胞增殖與調(diào)節(jié)，發(fā)揮免疫抑制作用[2]，已有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在不同的自身免疫性疾病中觀察到患者外周血IL-35表達(dá)水平下降。本研究結(jié)果顯示，新發(fā)SLE患者血清IL-35水平低于健康對照組，并且重度與中度活動組IL-35水平較輕度活動組降低，雖然重度活動組與中度活動組相比IL-35水平未見明顯差異，但是相關(guān)性分析顯示血清IL-35水平與SLEDAI相關(guān)，這說明低表達(dá)的IL-35可能參與SLE的形成。

本研究檢測新發(fā)SLE 患者與健康對照組外周血 Th17/Treg 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)新發(fā)SLE 患者Th17的表達(dá)升高，Treg的表達(dá)降低，Th17/Treg表達(dá)升高，患者體內(nèi)存在著Th17/Treg失衡。Th17細(xì)胞具有強(qiáng)大的促炎作用，能分泌多種細(xì)胞因子，招募炎性細(xì)胞浸潤組織形成損傷。研究[8-9]證明，Th17細(xì)胞參與SLE的形成，而本研究分析發(fā)現(xiàn)不同活動組SLE患者Th17的表達(dá)均具有顯著的差異性，患者的病情活動度增加，Th17的水平也升高。此外IL-35對 Th17 細(xì)胞具有重要的抑制作用，它可以上調(diào)IFN-γ來阻斷 TGF-β與其受體結(jié)合，使TGF-β不能誘導(dǎo)RORγt，導(dǎo)致 Th17的分化受到抑制[10]；當(dāng)缺失Ebi3 亞基時(shí)，影響Th17分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平增高[11]，推測新發(fā)SLE患者體內(nèi)IL-35降低可能是Th17升高的原因之一。Treg細(xì)胞具有主動免疫的功能，通過多種途徑殺傷其他免疫細(xì)胞，調(diào)節(jié)體內(nèi)T細(xì)胞平衡，抑制免疫反應(yīng)。機(jī)制研究[2,12]認(rèn)為，Treg細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)IL-35的主要來源，分泌的IL-35可以刺激擴(kuò)增 CD4+CD25-Teff 和 CD4+CD25+Treg細(xì)胞，是Treg細(xì)胞發(fā)揮最大抑制效應(yīng)所必需。本研究結(jié)果顯示，新發(fā)SLE患者Treg細(xì)胞含量降低，這與譚國珍等[13]研究結(jié)果一致，推測Treg細(xì)胞分泌IL-35水平下降與抑制T細(xì)胞作用減弱可能與SLE的形成有關(guān)。在不同的SLE活動組中，重度與中度活動組、中度與輕度活動組Treg表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)镾LE患者Treg細(xì)胞異常不僅表現(xiàn)在數(shù)量上的減少，更存在功能上的缺失。Treg 細(xì)胞分泌IL-35功能受阻，反饋機(jī)體生成更多的IL-35,可能是重度與中度活動組IL-35水平?jīng)]有差異的原因。IL-35具有抑制Teff細(xì)胞活性和抑制Th17細(xì)胞分化的作用，對Treg細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本研究顯示，新發(fā)SLE患者Th17及Th17/Treg與患者的IL-35水平顯著負(fù)相關(guān)，Treg與 IL-35水平顯著正相關(guān)，提示低表達(dá)的IL-35可能不能有效的調(diào)控Th17/Treg平衡，導(dǎo)致Th17細(xì)胞與效應(yīng)因子亢進(jìn)，損傷組織，促進(jìn)SLE的形成，但是具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。此外本研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)SLE患者經(jīng)過短暫治療后IL-35與Treg表達(dá)較治療前升高，Th17與Th17/Treg的表達(dá)較治療前降低。另有學(xué)者[14]認(rèn)為，接受長期治療的SLE患者Treg細(xì)胞表達(dá)較健康者高。Cai等[15]研究發(fā)現(xiàn),免疫治療后SLE患者IL-35表達(dá)增強(qiáng)。激素與免疫抑制類藥物可能通過某些機(jī)制上調(diào)Treg細(xì)胞與IL-35的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用，緩解了SLE患者的病情。這提示增強(qiáng)患者體內(nèi)IL-35水平可能是治療SLE的新思路。

綜上所述，新發(fā)SLE患者體內(nèi)低表達(dá)的IL-35可能破壞了Th17/Treg平衡機(jī)制，參與SLE的發(fā)生。IL-35表達(dá)與SLE病程嚴(yán)重程度相關(guān)，可以作為潛在的預(yù)測SLE病程活動指標(biāo)。