趙 婧 徐微微 李會(huì)平 周紅艷

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hpatitis C virus,HCV)感染引起的病毒性肝炎，易轉(zhuǎn)變?yōu)槁员透窝?chronic hepatitis C,CHC)，且多數(shù)患者可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，對(duì)患者的生命健康造成極大危害[1]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類(lèi)具有調(diào)控功能的非編碼RNA片段，在丙型肝炎患者中存在不同的miRNA異常表達(dá)，miRNA可能與丙型肝炎的發(fā)病過(guò)程有關(guān)[2]。研究[3-4]指出，miR-155及miR-122表達(dá)水平與HCV的感染和致病密切相關(guān)，參與介導(dǎo)肝細(xì)胞的發(fā)育及肝細(xì)胞免疫應(yīng)答等多種生理功能，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)丙型肝炎患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平，分析miR-155及miR-122診斷肝癌的價(jià)值，以期為肝癌的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2020年1月河北省唐山市中心血站和唐山市人民醫(yī)院收治的128例HCV感染的丙型肝炎患者，根據(jù)《丙型肝炎防治指南》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，分為CHC組 (52例)、肝硬化組(45例)與肝癌組(31例)。另選擇同期健康體檢正常者50例作為對(duì)照組。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《丙型肝炎防治指南》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②自愿參與本次研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類(lèi)型肝病、感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病者；②孕婦或妊娠期婦女。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.3 方法 丙型肝炎患者在治療前采集標(biāo)本，對(duì)照組在體檢時(shí)采集標(biāo)本，所有研究對(duì)象均采集空腹靜脈血5 mL，置于未加抗凝劑的離心管中，以離心半徑13.5 cm，3 500 r/min離心10 min，分離血清，-80℃低溫冰箱保存待測(cè)。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)HCV-RNA載量。應(yīng)用日立7600 型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。采用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)miR-155及miR-122水平。反應(yīng)體系為20 μL∶1 μL 引物及探針Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67 μL雙蒸水；擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10 min、95℃變性15 s、60℃退火60 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-155及miR-122的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo) 觀察比較各組對(duì)象血清ALT、AST、HCV-RNA、miR-155及miR-122水平，分析血清miR-155及miR-122表達(dá)水平診斷肝癌的價(jià)值，并采用Pearson相關(guān)分析miR-155與miR-122的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 4組對(duì)象一般資料比較 與對(duì)照組比較，肝癌組、肝硬化組和CHC組ALT及AST水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；肝癌組、肝硬化組和CHC組ALT、AST及HCV-RNA水平兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組對(duì)象性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)及HCV-RNA等進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 4組對(duì)象一般資料比較

2.2 4組對(duì)象血清miR-155及miR-122表達(dá)水平比較 肝癌組、肝硬化組與CHC組患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；肝癌組患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平均高于CHC組和肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。CHC組和肝硬化組患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組對(duì)象血清miR-155及miR-122表達(dá)水平比較

2.3 miR-155、miR-122單項(xiàng)及聯(lián)合診斷肝癌的價(jià)值 以miR-155及miR-122為檢驗(yàn)變量，以肝癌為狀態(tài)變量(肝癌31例，CHC組、肝硬化組97例非肝癌患者為對(duì)照)，診斷金標(biāo)準(zhǔn)為肝癌病理結(jié)果，繪制ROC曲線，探討miR-155、miR-122單項(xiàng)及二者聯(lián)合對(duì)肝癌診斷的價(jià)值。其中miR-155及miR-122的曲線下面積(area under curve，AUC)均大于0.8，準(zhǔn)確性較高，將miR-155及miR-122二者聯(lián)合，其診斷肝癌的AUC為0.937，敏感度為97.24%，特異度為85.80%(P<0.001)。見(jiàn)表3、圖1。

2.4 肝癌組患者血清miR-155表達(dá)水平與miR-122的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，肝癌組患者血清miR-155表達(dá)水平與miR-122呈正相關(guān)(r=0.803，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

表3 miR-155、miR-122單項(xiàng)及聯(lián)合診斷肝癌的價(jià)值

圖1 miR-155、miR-122單項(xiàng)及聯(lián)合診斷肝癌的ROC曲線

圖2 肝癌組患者血清miR-155表達(dá)水平與miR-122的相關(guān)性

3 討論

丙型肝炎是臨床上常見(jiàn)的傳染病之一，已成為嚴(yán)重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。miRNA是一類(lèi)參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小分子 RNA，可通過(guò)與HCV RNA基因組的相互作用或通過(guò)間接控制與病毒復(fù)制相關(guān)的宿主途徑來(lái)直接調(diào)節(jié)HCV復(fù)制，從而最終誘發(fā)HCV相關(guān)的肝病[6]。研究[7]指出，miR-155在肝癌細(xì)胞中是一個(gè)直接的下游靶點(diǎn)和功能介質(zhì)，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡，可能成為肝癌的一個(gè)新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。馬仁舒等[8]研究表明，miR-122是肝癌的啟動(dòng)子，其在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞増殖、遷移、侵襲能力及預(yù)后相關(guān)，可能是肝癌診斷和預(yù)后的非侵入性生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，肝癌組、肝硬化組與CHC組患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且肝癌組高于CHC組、肝硬化組。提示miR-155及miR-122表達(dá)水平升高與丙型肝炎患者的病情進(jìn)展有關(guān)，可能參與丙型肝炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究[9]發(fā)現(xiàn)，CHC患者miR-155水平顯著高于健康對(duì)照組，提示miR-155可能參與CHC的發(fā)病過(guò)程，這有助于了解CHC的靶向治療。李華民等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，丙型肝炎患者血清miR-122的表達(dá)水平均升高，肝癌患者升高更顯著，miR-122調(diào)控異常與丙型肝炎密切相關(guān)，監(jiān)測(cè)miR-122表達(dá)可能有助于肝癌的診斷。本研究ROC曲線分析顯示，miR-155及miR-122二者聯(lián)合診斷肝癌的AUC最大，其敏感度最高。本研究結(jié)果顯示，肝癌組患者血清miR-155表達(dá)水平與miR-122呈顯著正相關(guān)。表明miR-155及miR-122表達(dá)水平二者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高肝癌的診斷效能。Ning等[11]研究顯示，與正常肝組織和健康對(duì)照者比較，肝癌組織和血清中miR-155表達(dá)水平升高，miR-155對(duì)肝癌的診斷具有較高的敏感度和特異度，可能是肝癌診斷的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物。另有研究[12]表明，在感染HCV患者中，血清miR-122表達(dá)水平升高，miR-122有望成為HCV相關(guān)性肝病新的抗病毒藥物靶點(diǎn)或新的診斷生物標(biāo)志物。

綜上所述，丙型肝炎患者血清miR-155及miR-122表達(dá)水平明顯升高，miR-155及miR-122二者聯(lián)合對(duì)診斷HCV感染導(dǎo)致的肝癌具有較好的價(jià)值。但本研究樣本量小，影響miR-155及miR-122因素較多，未來(lái)仍需更多的臨床研究來(lái)驗(yàn)證。