程庭峰,王 環(huán),陳世龍,王久利,師生波,沈建偉,周黨衛(wèi),5

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所高原生物適應(yīng)與進化重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所分析測試中心，青海 西寧 810008；3.青海省作物分子育種重點實驗室，青海 西寧 810008；4.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧 810007；5.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

麻花艽(GentianastramineaMaxim.) 為龍膽屬多年生草本植物[1]，《中國藥典》2015 年版將其和同為秦艽組(Sect.CruciataGaudi)的大葉秦艽 (G.macrophyllaPall.)、粗莖秦艽 (G.crassicaulisDuthie ex Burk.)、小秦艽 (G.dahuricaFisch.)一起列為中藥秦艽的4種基源植物，秦艽是一種傳統(tǒng)的中藏藥材，距今已有2000多年的歷史，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱等功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)生長在不同環(huán)境下的植物，經(jīng)過自然選擇和適應(yīng)，能夠在形態(tài)和生理特性等方面產(chǎn)生變異，最終形成特定的地理種源；麻花艽在我國主要分布于青藏高原及其周邊地區(qū)，推測不同種源麻花艽在長期的生長過程中也已經(jīng)形成了適應(yīng)多種生境的遺傳差異[3-4]。近年來，隨著市場需求量的增加，麻花艽野生資源遭到嚴重破壞，因此有必要開展麻花艽的人工栽培研究[5]。

鹽脅迫和干旱脅迫是植物最容易遭受的逆境脅迫，能夠通過滲透脅迫造成植物損傷，導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧積累，是植物生長的限制性因素之一。我國存在大量的干旱鹽漬土地，其中又以西北地區(qū)(青海、甘肅、新疆)為主[6-8]。當(dāng)前麻花艽人工種植在青海等地已經(jīng)廣泛開展，因此，對脅迫下不同種源麻花艽生理特性的研究，將有助于抗旱耐鹽種質(zhì)資源的篩選和培育，保證野生資源的可持續(xù)開發(fā)利用[9]。

目前，相關(guān)學(xué)者已經(jīng)對麻花艽、秦艽等植物脅迫下的萌發(fā)特性進行了研究，但脅迫對其生理特性的影響卻鮮有報道[10-11]。本試驗以不同采集地點的麻花艽種子為研究對象，分別通過PEG6000、NaCl以及兩者混合模擬干旱脅迫、鹽脅迫和混合脅迫，分析不同脅迫對不同種源麻花艽幼苗的形態(tài)、可溶性蛋白、丙二醇以及抗氧化酶活性的影響差異，闡明干旱和鹽脅迫對麻花艽生理特性的影響，為其馴化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

麻花艽種子于2018年分別取材自青海省海北站(HBZ)、德令哈(DLH)、河北鄉(xiāng)(HBX)、下藏科(XZK)和班瑪縣(BMX)5個區(qū)域。晾干后選取籽粒飽滿、大小均勻、成熟的種子作為實驗材料。

將麻花艽種子置于300 μmol·L-1的赤霉素中浸泡24 h，分別用無菌水漂洗3次，75%的酒精消毒1 min、2.5%的NaClO溶液消毒10 min后，再用無菌水漂洗5次。將消毒后的種子接入30 mL MS固體培養(yǎng)基中，所有的培養(yǎng)瓶放到人工氣候培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。大約3周后植株長至 2 cm 時，分別接入5 mL 10% PEG、150 mmol·L-1NaCl以及10% PEG+150 mmol·L-1NaCl混合溶液模擬干旱脅迫、鹽脅迫和混合脅迫，7 d后將材料取出，檢測麻花艽幼苗的株高、根長、鮮重以及鮮重下的可溶性蛋白和丙二醛含量、抗氧化酶活性等生理指標(biāo)。

1.2 各生理指標(biāo)的測定及其方法

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍 G-250染色法；丙二醇(MDA)測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，采用Excel 2010進行繪圖。生長指標(biāo)以 3次重復(fù)的平均值及其標(biāo)準誤差表示。利用相對可溶性蛋白、相對MDA和相對抗氧化酶活性等指標(biāo)，通過隸屬函數(shù)法對幼苗抗性進行綜合評價。

隸屬函數(shù)值的計算公式：

R(Xi) = (Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數(shù)值計算公式：

R(Xi) = 1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xi為實驗材料在某一脅迫下的測定值；Xmax和Xmin分別為該脅迫下所有材料中該指標(biāo)的最大值和最小值，計算完所有指標(biāo)的隸屬值后，通過累加求平均，平均值越大，表明其抗性越強[12-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脅迫對麻花艽幼苗生長的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，采集地、脅迫及兩者的交互顯著影響麻花艽的生長(表1)。

表1 麻花艽幼苗生長的雙因素方差分析結(jié)果

不同脅迫對麻花艽幼苗的生長具有不同影響，如表2所示。與對照相比，除河北鄉(xiāng)和鹽脅迫下的海北站外，3種脅迫下幼苗的株高都出現(xiàn)降低，且混合脅迫下抑制作用更明顯；所有材料的根長在脅迫下都出現(xiàn)降低；河北鄉(xiāng)幼苗的鮮重在干旱脅迫下出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)，其余地區(qū)材料有變化但無顯著性差異；海北站幼苗的根冠比在干旱脅迫下出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，其余材料出現(xiàn)變化但與對照間也無顯著性差異。

表2 脅迫對不同種源地麻花艽幼苗生長的影響

不同種源麻花艽種子對脅迫的響應(yīng)也具有一定的差異，干旱脅迫下德令哈地區(qū)幼苗的株高最高，為2.36 cm；鹽脅迫和混合脅迫下河北鄉(xiāng)和德令哈地區(qū)幼苗的株高均顯著高于其他地區(qū)(P<0.05)，且河北鄉(xiāng)均為最高，分別為2.49 cm和2.28 cm。3種脅迫條件下，海北站根長最長。干旱脅迫下河北鄉(xiāng)地區(qū)幼苗鮮重最大，為7.61 mg；鹽脅迫下海北站鮮重最大，為6.94 mg;混合脅迫下德令哈鮮重最高，為6.48 mg。干旱脅迫下班瑪縣幼苗根冠比最大，為0.20;鹽和混合脅迫下海北站根冠比最大，分別為0.33和0.29。

2.2 不同脅迫對麻花艽幼苗丙二醇含量的影響

如圖 1所示，與對照相比，除干旱脅迫下的德令哈外，其他采集地麻花艽幼苗的MDA含量均出現(xiàn)增加，3種脅迫條件下班瑪縣MDA增加量均為最高，分別增加了1 509.75%,605.29%和1 175.76%。其中海北站、德令哈和河北鄉(xiāng)幼苗的MDA含量在混合脅迫下增加更為明顯，分別增加了833.92%,23.93%和242.05%，下藏科幼苗在鹽脅迫下增加最為明顯，增加了600.29%。

圖1 脅迫對麻花艽幼苗丙二醇含量的影響

2.3 不同脅迫對麻花艽幼苗可溶性蛋白含量的影響

如圖 2所示，不同地理種源麻花艽幼苗可溶性蛋白的含量在脅迫下呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。與對照相比，干旱脅迫下海北站、德令哈和下藏科均顯著增加，分別增加了23.87%，46.52%和10.00%；鹽脅迫下德令哈的幼苗可溶性蛋白增加了12.15%，其余地區(qū)都出現(xiàn)降低，降幅不顯著；混合脅迫下所有材料可溶性蛋白都出現(xiàn)降低，其中海北站、德令哈和河北鄉(xiāng)顯著下降，分別下降了21.96%,18.32%和12.80%。

圖2 脅迫對麻花艽幼苗可溶性蛋白含量的影響

2.4 不同脅迫對麻花艽幼苗抗氧化酶活性的影響

如圖3所示，脅迫下不同地理種源麻花艽幼苗的抗氧化酶活性也出現(xiàn)不同變化。與對照相比，干旱脅迫下所有材料的SOD均出現(xiàn)降低，鹽脅迫下僅下藏科增加了17.23%，混合脅迫下僅德令哈地區(qū)增加了6.45%，其余地區(qū)均表現(xiàn)為降低(圖3A)。脅迫下POD活性也出現(xiàn)不同變化，干旱脅迫下除河北鄉(xiāng)外都出現(xiàn)增加，其中海北站增加最明顯，相較于對照增加了234.39%；鹽脅迫下除海北站增加了340.53%外，其余地區(qū)POD活性都出現(xiàn)下降；混合脅迫下除下藏科增加了88.18%倍外，其余地區(qū)也都出現(xiàn)下降(圖3B)。脅迫下多數(shù)地區(qū)幼苗的CAT活性出現(xiàn)降低，干旱和鹽脅迫下僅海北站分別增加了86.39%和127.86%，其余地區(qū)都出現(xiàn)下降；混合脅迫下海北站、德令哈和下藏科均出現(xiàn)顯著性增加，分別增加了12.83%、51.20%和26.57%(圖3C)。

圖3 脅迫對麻花艽幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

2.5 不同種源麻花艽幼苗的綜合抗性評價

不同地理種源麻花艽的抗性隸屬函數(shù)分析如表3所示，其中相對可溶性蛋白、相對抗氧化酶活性計算采用隸屬函數(shù)公式，MDA與幼苗生長表現(xiàn)為負相關(guān)，其計算采用反隸屬函數(shù)公式?？购敌跃C合評價順序為：德令哈>海北站>下藏科>河北鄉(xiāng)>班瑪縣，耐鹽性順序為：海北站>下藏科>德令哈>班瑪縣>河北鄉(xiāng)，混合脅迫抗性順序為：德令哈>下藏科>河北鄉(xiāng)>海北站>班瑪縣。

表3 不同地理種源麻花艽的抗性隸屬函數(shù)值及綜合評價

3 討 論

3.1 不同脅迫對麻花艽生長的影響

脅迫能抑制植物的生長，本研究發(fā)現(xiàn)不同脅迫下大多數(shù)材料的生長受到明顯抑制，鮮重?zé)o顯著性變化，且混合脅迫下對株高的抑制更為明顯，這與李靜怡等[14]對天仙子NaCl和PEG脅迫的結(jié)果相一致。雖然脅迫下植物的生長受到抑制，但相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，植物在水分脅迫下傾向于將更多的資源分配給根系，通過提高根冠比來適應(yīng)干旱的環(huán)境[15]。本研究中植物脅迫下的根冠比并未出現(xiàn)明顯增加，但海北站幼苗的根冠比在脅迫下顯著高于其他地區(qū)，說明其對脅迫環(huán)境具有一定的適應(yīng)性。

3.2 不同脅迫對麻花艽生理特性的影響

MDA能夠造成細胞膜的損傷，其含量高低可以作為植物抗性強弱的判定指標(biāo)之一，多數(shù)植物在脅迫下MDA含量都會出現(xiàn)明顯升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)班瑪縣麻花艽幼苗在3種脅迫條件下MDA含量都出現(xiàn)明顯積累，遠大于其他地區(qū)，表明脅迫對其影響較大。而德令哈的MDA變化卻不明顯，干旱脅迫下更是出現(xiàn)明顯下降，表明其對脅迫的耐受性較強。脅迫下植物可以通過增加可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量降低自身對水分的需求。本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下海北站和德令哈地區(qū)幼苗可溶性蛋白含量出現(xiàn)明顯增加，鹽脅迫下僅德令哈地區(qū)出現(xiàn)增加，說明該地區(qū)植物對脅迫表現(xiàn)出一定的生理適應(yīng)。李為民等[7]發(fā)現(xiàn)混合脅迫能夠?qū)е乱吧蠖節(jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖含量的降低，本研究發(fā)現(xiàn)混合脅迫下所有地區(qū)可溶性蛋白含量都出現(xiàn)降低，推測可能是由于強脅迫下，高濃度的Na+導(dǎo)致細胞內(nèi)外的離子平衡受到破壞，影響了可溶性蛋白的積累。

植物在脅迫條件下會出現(xiàn)活性氧的積累，其細胞膜結(jié)構(gòu)會遭到破壞，導(dǎo)致生長受到抑制，植物會通過在體內(nèi)建立一套相應(yīng)的抗氧化保護酶系統(tǒng)(SOD,POD和CAT等)以維持其體內(nèi)的活性氧動態(tài)平衡，實現(xiàn)對脅迫的耐受[7]。本研究中，大部分材料在鹽和混合脅迫下抗氧化酶活性都出現(xiàn)降低；干旱脅迫下POD活性出現(xiàn)增加，說明麻花艽對干旱具有一定的耐受性。陳鋒[17]對祁連山3種藥用植物抗旱性的研究也發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下麻花艽的SOD和POD出現(xiàn)升高，但隨著脅迫時間的增長，其抗氧化酶活性迅速降低，由此推測本研究中麻花艽幼苗抗氧化酶活性的降低，可能是由于強脅迫超過了保護酶系統(tǒng)的承受極限，導(dǎo)致抗氧化酶系統(tǒng)受到損傷[18]。雖然大部分麻花艽材料抗氧化酶活性出現(xiàn)了降低，但部分地區(qū)還是明顯升高，例如單純干旱和鹽脅迫處理下，海北站地區(qū)幼苗的POD和CAT活性出現(xiàn)明顯增加，混合脅迫下德令哈地區(qū)的SOD和CAT增加也最為明顯。說明這兩個地區(qū)的麻花艽在脅迫下抗氧化酶活力得到增強，其對脅迫的耐受性也強于其他地區(qū)的麻花艽。

3.3 不同種源麻花艽的抗逆性評價

模糊隸屬函數(shù)法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于品種的抗逆性評價上，能夠綜合所有指標(biāo)對植物進行客觀全面的評價，避免了單一指標(biāo)評價的片面性[12-13,19]。本研究中，通過對麻花艽種質(zhì)的抗逆性評價，發(fā)現(xiàn)德令哈和海北站的麻花艽抗旱性較強，海北站、下藏科和德令哈的抗耐鹽性較強，這也和形態(tài)指標(biāo)表現(xiàn)相一致，脅迫下海北站和德令哈的麻花艽具有較高的株高、根長和根冠比。有趣的是，雖然海北站麻花艽具有較強的抗旱耐鹽性，但在混合脅迫下，其抗性卻遠低于德令哈，說明麻花艽對逆境的響應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，并不是單一累加的結(jié)果[14]。不同種源麻花艽抗性的差異也與種質(zhì)所處的環(huán)境氣候條件相吻合，德令哈屬于柴達木盆地荒漠區(qū)，其年降水量較少，而班瑪縣則屬于川西藏東高山峽谷針葉林區(qū)，受印度洋季風(fēng)的影響，其年降水量較多[20]，說明各地理種源麻花艽經(jīng)過長期的自然選擇和環(huán)境適應(yīng)對脅迫響應(yīng)產(chǎn)生了一定的差異，原產(chǎn)地生長于寒冷干旱地區(qū)的植物, 對水分缺乏不敏感，例如德令哈、海北站地區(qū)。而溫暖濕潤地區(qū), 例如班瑪縣的麻花艽，其對水分缺乏則較為敏感[21]。

4 結(jié) 論

綜上所述，脅迫對麻花艽的生長具有一定的影響，但其能夠通過植物形態(tài)、生理生化等機制的調(diào)節(jié)實現(xiàn)對脅迫的耐受，且不同地理種源麻花艽對脅迫耐受性存在一定的差異，其中海北站和德令哈地區(qū)的麻花艽由于長期受自然環(huán)境的影響具有較強的抗性，主要通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、提高抗氧化酶活性等機制，實現(xiàn)了對脅迫的耐受。后續(xù)應(yīng)加強對具體調(diào)節(jié)機制的研究，擴大材料的選取范圍，為麻花艽優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的引進栽培提供理論依據(jù)。