陳 湜, 張沁園, 劉旭祥, 鄭敏琳, 季清娥*

(1.閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室， 福建福州350002；2.教育部生物農(nóng)藥與化學生物學重點實驗室， 福建福州350002；3.福建農(nóng)林大學作物病蟲生物防治研究所， 福建福州350002)

斑翅果蠅(Drosophila suzukiiMatsumura)隸屬于雙翅目果蠅科,是世界范圍內(nèi)藍莓、楊梅、葡萄、櫻桃等軟皮水果的重要害蟲(Asplenet al,2015)。 果蠅錘角細蜂(Trichopria drosophilaePerkins)屬膜翅目錘角細蜂科,是斑翅果蠅蛹期的主要寄生蜂之一,極具生物防治應用潛力(Gonzalez-Cabreraet al,2019；Ibouhet al,2019；Pfabet al,2018；Stacconiet al,2018)。 果蠅錘角細蜂的寄主范圍較廣,可寄生多種果蠅,但對斑翅果蠅有寄生偏好(Yiet al,2020)。 在這些寄主中,與斑翅果蠅同屬于黑腹果蠅種組的黑腹果蠅(Drosophila melanogasterMeigen)是遺傳學中的模式昆蟲,具有體型小、繁殖快、生長周期短、易于人工飼養(yǎng)等特性,適于作為果蠅錘角細蜂大量飼養(yǎng)的替代寄主(胡瑋等,2019；儀傳冬等,2019)。

本研究發(fā)明了一種快速大量收集黑腹果蠅老熟幼蟲的裝置,可獲得大量同日齡的蠅蛹供果蠅錘角細蜂寄生(陳湜等,2020a,2020b)。 但黑腹果蠅的老熟幼蟲體表和初化蛹的蛹表面具有粘液,蛹通常粘附于容器壁上或彼此黏連。 在大量收集后,蛹容易黏結(jié)成團。 彼此黏連一團的蛹在數(shù)粒儀中常常會被錯誤識別為單粒蛹,而且會影響蛹寄生蜂搜尋寄主,從而影響寄生蜂的飼養(yǎng)。 同時,在寄生蜂大量飼養(yǎng)過程中,不但需要對蠅蛹進行定量,以維持合適的寄生蜂與寄主比例,還需要分離寄生蜂的蛹和寄主的蛹,但其黏結(jié)在一起,影響分離。 綜上所述,如何避免黑腹果蠅老熟幼蟲和蛹相互黏連,是果蠅錘角細蜂大量飼養(yǎng)過程中的一個關鍵問題。

對于黏連的黑腹果蠅蛹,可行的分離手段有：加入不同的潤滑物質(zhì),輕柔揉搓,用清水洗除蛹表面的粘液等。 本研究分別采用直接揉搓法、滑石粉法、玉米淀粉法、水洗法4 種方法分離黑腹果蠅蛹,并測定這些分離方法對黑腹果蠅蛹的自動計數(shù)、果蠅錘角細蜂搜尋寄主、黑腹果蠅的羽化、蛹殼和蜂蛹的分離、果蠅錘角細蜂的羽化5 個方面的影響,以期篩選出最適于果蠅錘角細蜂大量飼養(yǎng)中黑腹果蠅蛹的分離方法。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

試驗所用野生型黑腹果蠅,2017 年采自福建省福州市,已在福建農(nóng)林大學作物病蟲生物防治研究所實驗室連續(xù)飼養(yǎng)30 代以上。 飼養(yǎng)條件：溫度(23±1) ℃,相對濕度75%±5%,光周期12 h ∶12 h(L ∶D) 。 采用陳湜等(2020a,2020b)的方法飼養(yǎng)和收集老熟幼蟲。

試驗所用斑翅果蠅寄生蜂果蠅錘角細蜂,2017 年采自福建漳州楊梅園,已在福建農(nóng)林大學作物病蟲生物防治研究所實驗室連續(xù)飼養(yǎng)30 代以上。 飼養(yǎng)條件：溫度(23±1) ℃,相對濕度75%±5%,光周期 12 h ∶12 h(L ∶D) 。

1.2 試驗材料

試驗所用主要試劑：滑石粉、玉米淀粉(食品級,市售)。 試驗所用儀器：SLY-A 微電腦自動數(shù)粒儀(杭州綠博儀器有限公司)；谷物吹殼器(購自淘寶聚鸚緣鸚鵡生活館)。

1.3 果蠅蛹的分離

用軟毛筆挑取500 頭黑腹果蠅老熟幼蟲,以紙巾包裹,在黑暗環(huán)境下靜置24 h,待老熟幼蟲化蛹、并且蛹表面的粘液干燥后,用4 種不同的方法進行分離。 以未經(jīng)分離的蠅蛹和手工逐一分離的蠅蛹為對照組。

直接揉搓法：以手指隔著紙巾輕搓至基本分離,打開紙包,將蠅蛹平攤于濾紙上。

滑石粉法：在包裹蛹的紙巾內(nèi)撒入1 mL 滑石粉,振蕩后,以手指隔著紙巾輕搓至基本分離。 將蠅蛹倒在篩孔尺寸為0.600 mm 的篩網(wǎng)上,輕輕抖動,篩去多余的滑石粉。 將蠅蛹平攤于濾紙上。

玉米淀粉法：與滑石粉法步驟相同,但將滑石粉替換為等量的玉米淀粉。

水洗法：將蠅蛹放置于篩孔尺寸為0.600 mm 的篩網(wǎng)上,用無菌水漂洗至蠅蛹完全分離。更換無菌水,重復3 次。 倒扣篩網(wǎng),將蠅蛹抖落在濾紙上,盡量攤散,于通風避光處陰干,而后將蠅蛹放置于紙巾上,以手指隔著紙巾輕搓至基本分離。

陰性對照：在500 頭老熟幼蟲化蛹,并且蛹表面的粘液干燥后,直接打開包裹的紙巾,將蠅蛹盡量攤散于濾紙上。

陽性對照：在500 頭老熟幼蟲剛化蛹,蛹表面粘液還未干燥時,用細毛筆逐一挑取蠅蛹,彼此隔開一段距離放置于濾紙上避免黏連,并于通風避光處晾干。

1.4 蠅蛹數(shù)量的測定

黑腹果蠅蛹依照上述方法分離處理后,靜置24 h。 依照自動數(shù)粒儀的操作說明對蠅蛹進行數(shù)粒。 每個處理均設置3 個重復。

1.5 果蠅錘角細蜂的寄生

黑腹果蠅蛹依照上述方法分離處理后,靜置24 h,供果蠅錘角細蜂寄生。

組一：取同日羽化的250 頭雌、100 頭雄果蠅錘角細蜂,共350 頭,放入23 cm×16 cm×16 cm的養(yǎng)蟲罐內(nèi),以插有棉芯的錐形瓶,盛裝有無菌水和充分吸收蜂蜜的醫(yī)用脫脂棉球進行飼養(yǎng)。由于果蠅錘角細蜂的懷卵量和產(chǎn)卵量在前4 天會逐漸上升(Wanget al,2016；Yiet al,2020),因此,在飼養(yǎng)至第5 天時,將放有500 粒蠅蛹的濾紙?zhí)峁┙o果蠅錘角細蜂,寄生24 h 后取出。每處理均設置3 個重復。

組二：取同日羽化的100 頭雌、40 頭雄果蠅錘角細蜂,共140 頭,以同樣方法飼養(yǎng)至第5 天。 將放有500 粒蠅蛹的濾紙?zhí)峁┙o果蠅錘角細蜂,寄生24 h 后取出。 每處理均設置3 個重復。

1.6 分離寄主蛹殼和尚未羽化的蛹

將組二寄生后的蛹分別放置于紗網(wǎng)封口的養(yǎng)蟲罐中,寄生后的第5 天,未被寄生的黑腹果蠅全部羽化并饑渴而死。 采用谷物吹殼器分離未被寄生的寄主羽化后的蛹殼和尚未羽化的蛹。 對于每個處理,均采用下述的方法獲得相應的最適風速：(1)風選機遠槽為暫存槽,近槽為好料槽,從50%風速開始做多輪風選,每輪風速以2%步進。 (2)每輪風選后,統(tǒng)計暫存槽中的未羽化蛹和蛹殼數(shù),判斷比例,若暫存槽內(nèi)的未羽化蛹數(shù)≤暫存槽內(nèi)的蛹殼數(shù),則將暫存槽內(nèi)的蛹和蛹殼都倒入廢料容器,使用好料槽的內(nèi)容物來進行下一輪風選；若暫存槽內(nèi)的未羽化蛹數(shù)＞暫存槽內(nèi)的蛹殼數(shù),則將暫存槽內(nèi)的蛹和蛹殼都倒入好料槽,并停止風選。 (3)分別統(tǒng)計廢料容器和好料槽中的未羽化蛹數(shù)和蛹殼數(shù),計算錯分率。

1.7 果蠅錘角細蜂寄生率、出蜂率和寄生蜂與果蠅的總羽化率的測定

當組一、組二的寄主全部羽化并饑渴而死后,統(tǒng)計羽化的黑腹果蠅數(shù)目。 將寄主分離后手工分揀出的未羽化蛹分別放置于紗網(wǎng)封口的養(yǎng)蟲罐中,直至不再有新的寄生蜂羽化為止,統(tǒng)計寄生蜂的數(shù)目。 此時將尚未羽化的蛹在水中泡開后,在體視鏡下解剖以確定是否為寄生蜂蛹。由于果蠅錘角細蜂的平均日產(chǎn)卵量為2～4 粒(Wanget al,2016),本試驗將組一得到的數(shù)據(jù)用于在寄生蜂過量存在的前提下,計算充分寄生時的寄生率；而組二得到的數(shù)據(jù)則用于在寄主果蠅蛹過量存在的前提下計算出蜂率和總羽化率,以盡可能地排除過寄生的影響。 其中,寄生率用于評估不同處理對寄生蜂搜尋寄主和寄生過程的影響,出蜂率用于評估不同處理對寄生蜂發(fā)育和羽化的影響,而寄生蜂和果蠅的總羽化率用于評估不同處理對蠅蛹的損傷程度。

1.8 統(tǒng)計分析

本試驗用SASJMP 9.0 進行統(tǒng)計分析,分別計算每個處理的平均值和標準誤,并采用LSD-t檢驗比較各處理之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分離方法對蠅蛹計數(shù)的影響

由表1 可知,自動數(shù)粒儀對陽性對照組的計數(shù)準確率達到93.86%±0.00%。 試驗中觀察到,當2 粒蛹隨機地一同通過自動數(shù)粒儀的光電窗時,會被識別為單粒蛹,因此自動數(shù)粒儀的計數(shù)總是穩(wěn)定地小于實際數(shù)目。 而陰性對照組的準確率最低,僅為42.20%±0.04%。 粘結(jié)成團的多粒蠅蛹會被自動數(shù)粒儀識別為單粒,同時團粒數(shù)量的隨機性導致了計數(shù)的不穩(wěn)定。 因此,粗略計數(shù)可以間接反映蛹的分離效果。

表1 分離方法對自動計數(shù)準確率的影響Table 1 Effect of pupae separation methods on automatic counting accuracy

在4 種分離方法中,直接揉搓法的自動計數(shù)準確率僅高于陰性對照,表明直接揉搓無法較好地分離粘結(jié)的蠅蛹。 滑石粉法和玉米淀粉法的計數(shù)準確率無顯著差異,二者均顯著高于水洗法,并低于陽性對照。 在試驗中觀察到,由于水的表面張力,經(jīng)水洗后的蛹更傾向于沿長軸方向平行相靠,并在干燥后兩兩黏連在一起,且輕柔揉搓對于破壞這種黏連的效果不佳。 因此,粉狀潤滑劑對蠅蛹的分離效果更優(yōu)。 經(jīng)2 種粉狀潤滑劑分離后的蠅蛹自動計數(shù)準確率分別為85.40%±0.01%和85.40%±0.02%,約為陽性對照的91%,且數(shù)值較為穩(wěn)定。

2.2 不同分離方法對蛹殼和未羽化蛹的風選分離效率的影響

由表2 可知,所有處理中,錯分到蛹殼中的未羽化蛹數(shù)均高于錯分到未羽化蛹中的蛹殼數(shù)。使用谷物吹殼機風選陽性對照組的錯分率僅1.07%±0.08%。 而陰性對照組的錯分率最高,達到10.27%±0.38%,表明蛹和蛹殼的彼此黏連對風選的影響較大。 試驗中觀察到,當未羽化蛹和蛹殼成團黏連時,若團粒中蛹殼比例相對較大,則會被分到蛹殼一側(cè),反之則會被分到未羽化蛹一側(cè),造成錯分。 在4 種分離方法中,直接揉搓法的錯分率僅低于陰性對照,與計數(shù)試驗的結(jié)果一致。 滑石粉法、玉米淀粉法和水洗法的錯分率無顯著差異,均顯著高于直接揉搓法,低于陽性對照。 經(jīng)這3 種方法分離后的黑腹果蠅蛹殼和未羽化蛹風選錯分率均低于5%。

表2 分離方法對蛹殼和未羽化蛹的風選分離效率的影響Table 2 Effect of pupae separation methods on the winnowing separation efficiency of host puparium and unemerged pupae

2.3 不同分離方法對果蠅錘角細蜂寄生率、出蜂率和寄生蜂與果蠅的總羽化率的影響

由表3 可知,陽性對照組的寄生率極顯著高于陰性對照組,但二者的出蜂率和寄生蜂與果蠅的總羽化率均無顯著差異。 這表明,在寄生蜂過量的情況下,蠅蛹的黏連對人工大量飼養(yǎng)條件下的寄生率有影響,原因是果蠅錘角細蜂的產(chǎn)卵器短小,無法接觸到位于黏結(jié)團粒中心的蠅蛹,從而影響寄生率。 但蛹的自然黏連不影響黑腹果蠅和果蠅錘角細蜂的發(fā)育和羽化。 在4 種分離方法中,除直接揉搓法外,其他幾種不同分離方法下的寄生率和出蜂率均與陽性對照無顯著差異。這表明在現(xiàn)有的飼養(yǎng)條件下,水洗和粉末對蛹表面性質(zhì)的改變并不影響寄生蜂尋找寄主和寄生的行為,同時也不影響寄生蜂在寄主蛹內(nèi)的發(fā)育和羽化。 直接揉搓法組的寄生率、出蜂率和寄生蜂與果蠅的總羽化率均是最低的,表明揉搓損傷了蛹,導致蛹包括寄生蜂不能繼續(xù)發(fā)育。 其他幾種分離方法影響不顯著的原因可能是：在粉狀潤滑劑存在,或已水洗去除粘液的情況下,蠅蛹之間的粘結(jié)較為松散,只需輕輕揉搓,短時間即分開；且潤滑劑的存在起到了一定的緩沖作用。

表3 分離方法對寄生率、出蜂率和寄生蜂與果蠅的總羽化率的影響Table 3 Effect of pupae separation methods on the parasitism rate, emergence rate of Trichopria drosophilae,and total emergence rate of T.drosophilae and D.melanogaster

3 結(jié)論與討論

本試驗中陰性對照組和陽性對照組之間的差異顯著,表明黑腹果蠅蛹的黏連對自動數(shù)粒、風選分離、蛹寄生蜂的寄生率均有較大的影響,是大量飼養(yǎng)中亟待解決的實際問題。 通過比較4 種分離方法對果蠅錘角細蜂大量飼養(yǎng)過程中5 個環(huán)節(jié)的影響,結(jié)果表明,直接揉搓法對黑腹果蠅蛹的分離效果相對較差,且揉搓過程對蛹造成的機械損傷明顯影響羽化率,從而降低了果蠅錘角細蜂的生產(chǎn)效率,不適于生產(chǎn)應用。 水洗法的分離效果略差于滑石粉法和玉米淀粉法,但三者在其他環(huán)節(jié)的表現(xiàn)無顯著差異。 然而,水洗法的工序在三者之中最為繁瑣,且陰干過程耗費的時間較長。 胡瑋等(2019)利用水流沖洗收集黑腹果蠅的蛹陰干后供寄生,在收集的同時能夠有效地分離蠅蛹。 但在應用陳湜等(2020a,2020b)的方法時,自動大量收集蠅蛹的前提下,滑石粉法和玉米淀粉法顯然更加簡便易行。 滑石粉法和玉米淀粉法在各個環(huán)節(jié)均表現(xiàn)出了僅次于陽性對照的良好效果,且二者之間沒有顯著差異。 滑石粉價格較玉米淀粉更為低廉。 它具有良好的疏水性、潤滑性和抗粘性,作為潤滑輔料廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中(殷代武等,2013)。 但是,滑石粉具有致癌性,且吸入滑石粉會對肺部造成損害,因此醫(yī)療、日化行業(yè)普遍以玉米淀粉替代滑石粉(Garlichet al,2011；Mac Quiddyet al,1948)。 因此建議,在勞保措施較為完善的工廠化大量生產(chǎn)中可以考慮使用滑石粉降低成本,而在實驗室大量飼養(yǎng)中則可以使用更加安全的玉米淀粉。 但是,本研究尚未對滑石粉和玉米淀粉的用量、搓捻力度和搓捻時間作定量分析。 在今后的研究中,可以設置梯度進行比較,找到分離效率相對高、對蛹的損傷相對小的最佳方案,并在此基礎上進一步將之機械化、自動化,以更加適應工廠化大規(guī)模生產(chǎn)果蠅錘角細蜂的需要。

本試驗首次嘗試應用自動數(shù)粒儀對黑腹果蠅蛹進行計數(shù)。 結(jié)果表明,市售SLY-A 型自動數(shù)粒儀對陽性對照組黑腹果蠅蛹的計數(shù)準確率僅有93%,遠低于對小顆粒種子計數(shù)的0.4%誤差。 這是由于黑腹果蠅蛹的橫截面直徑小于0.5 mm,超出該款數(shù)粒儀的設計應用范圍,使得兩粒蛹可以同時落下,導致漏檢。 在今后的研究中,可以通過改造自動數(shù)粒儀載料盤上的缺口形狀和改變?nèi)肓贤ǖ赖钠露葋硖岣哂嫈?shù)的準確度。 本試驗中,陽性對照組的標準誤低于0.01%,表明這類由儀器不適配導致的誤差是相當穩(wěn)定的。 考慮到在實際應用中可以將數(shù)據(jù)乘以一個由經(jīng)驗得來的系數(shù),以使之更加貼近實際數(shù)值,因此認為,在對精確度要求不高的情況下,目前市售的自動數(shù)粒儀也適用于大量生產(chǎn)中黑腹果蠅蛹的計數(shù)。

未被寄生的寄主羽化后殘余的蛹殼和寄生蜂蛹的自動風選分離已在多種實蠅類害蟲中獲得成功(Jacksonet al,1996)。 果蠅錘角細蜂的平均羽化時間較黑腹果蠅的羽化時間晚10 d 以上(Wanget al,2016)。 據(jù)此可以認為,在寄主羽化并饑渴而死后尚未羽化的蛹絕大部分為寄生蜂蛹,滿足風選分離的基本前提。 本試驗也是首次采用風選機對果蠅錘角細蜂的蜂蛹和未被寄生的寄主羽化后留下的蛹殼進行分離。 結(jié)果表明,在蛹和蛹殼彼此不黏連的前提下,黑腹果蠅蛹殼和未羽化蛹風選的錯分率可低于1%,其中未羽化蛹中摻雜的蛹殼比例更低。 這一比例明顯小于果蠅錘角細蜂的羽化率標準誤,幾乎不會影響成蜂頭數(shù)的估算。 因此,風選機可以用于大量生產(chǎn)中黑腹果蠅蛹殼和果蠅錘角細蜂蜂蛹的分離。

綜上所述,本研究提出了以黑腹果蠅作為替代寄主大量飼養(yǎng)果蠅錘角細蜂的一套流程：(1)在收集大量新鮮蠅蛹后,以玉米淀粉法或滑石粉法分離彼此黏連的蛹；(2)利用自動數(shù)粒儀計數(shù)蠅蛹,根據(jù)最佳的寄生蜂與寄主比例投放供寄生；(3)在寄主羽化后,采用風選機分離蜂蛹和蛹殼；(4)用自動數(shù)粒計數(shù)蜂蛹,以便釋放應用。 這套流程可為果蠅錘角細蜂的工廠化大規(guī)模飼養(yǎng)提供重要的理論基礎。