喬媛媛 張文明

成都鐵路衛(wèi)生學(xué)校 四川 成都 611741

紫草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,歷代諸家本草均有詳細(xì)記載。其性寒,味甘、咸,歸心、肝經(jīng),具有止血涼血之功效,用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、熱病斑疹、濕疹、尿血、血淋、血痢、熱結(jié)便秘、瘡瘍、丹毒、燒傷、惡瘡、癬等[1-2]?，F(xiàn)代的研究中,發(fā)現(xiàn)它含多種萘醌類化合物——紫草素及其衍生物,是目前為止研究抗腫瘤活性主要成分。由于惡性腫瘤的高發(fā)病率和高死亡率,天然藥物紫草活性成分的抗腫瘤作用越來越受到醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注,正成為當(dāng)前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本文通過對紫草系列化合物的抗腫瘤活性的篩選,并對其抑瘤機(jī)制進(jìn)行探討,為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 紫草(ZC)系列化合物(ZC-10、ZC-11、ZC-12、ZC-13、ZC-14、ZC-15、ZC-16、ZC-17、ZC-20-1、ZC-20-2、ZC-20-3、ZC-21、ZC-22-1),純度98%以上,由中國科學(xué)院成都生物研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人骨肉瘤細(xì)胞MG-63,由西南交通大學(xué)材料學(xué)院屈樹新老師實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基(Hy Clone公司);胰蛋白酶(Hy-Clone公司);胎牛血清(上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO)(美國Amresco公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Amresco公司);順鉑(美國Sig ma公司,p4394);青鏈霉素鏈霉素混合液(Beyoti me);PBS(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);Annexin V,FITC凋亡檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);人Bcl-2相關(guān)X蛋白ELISA Kit(美國RD公司);人B細(xì)胞淋巴因子2 ELISA Kit(美國RD公司)。

1.4 主要儀器 HR40-ⅡA2生物安全柜(Haier);倒置相差顯微鏡(OLYMPUS);CO2恒溫孵箱(ESCO);離心機(jī)(Heraeus);Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司);Elx-800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品篩選及其IC50的檢測 取對數(shù)生長期MG-63細(xì)胞,按1×105個(gè)/mL的標(biāo)準(zhǔn)分別接種到96孔培養(yǎng)板,200 ml/孔。24小時(shí)后加入藥品,分順鉑組、DMEM 組和樣品組,除空白組加入等體積的DMEM 培養(yǎng)基,其余濃度調(diào)制均50μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用MTT法,測定各孔的OD490

將效果明顯的樣品稀釋成5個(gè)濃度組：50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL,用同樣的方法測定其抑制率,并計(jì)算其IC50。

2.2 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)(Annexin V-FITC/PI雙染) 同樣方法將MG-63分別接種到6 孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h后,然后進(jìn)行加藥,濃度梯度采取50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL,陽性組順鉑濃度是50μg/mL。24h后,開始收集細(xì)胞,向收集好的細(xì)胞里邊加入500uL 稀釋過后的Annexin V Binding Buffer。然后依次加5uL Annexin V FITC 結(jié)合物和5uL PI。溫室下避光15 min,再加入400u LAnnexin V Binding Buffer,1h內(nèi)上機(jī)檢測。

2.3 Elisa法檢測細(xì)胞中Bax與Bcl-2蛋白的表達(dá) 前面步驟跟2.2步驟一樣,將細(xì)胞吸入到EP管中,然后按物理的方法將細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)凍融裂解,直至細(xì)胞完全破裂釋放細(xì)胞內(nèi)成分為止,3000r離心20 min,收集上清液。其他步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。計(jì)算結(jié)果用Bcl-2/Bax的形式表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ZC系列化合物的篩選及IC50的檢測 圖1我們可以看出ZC系類化合物均對MG-63有較強(qiáng)的抑制作用,以順鉑作為參照,與DMSO組相比有顯著差異(P＜0.05)。

圖1 ZC系列化合物初篩MG-63

ZC系列化合物對MG-63有較高的抗腫瘤活性,進(jìn)一步檢測樣品IC50值,其中ZC-10、ZC-14、ZC-15、ZC-17、ZC-20-1、ZC-20-2、ZC-20-3、ZC-22-1的IC50為7.073μg/mL、9.568μg/mL、6.875μg/mL、5.465μg/mL、5.203μg/mL、9.449μg/mL、7.677μg/mL、2.696μg/mL,順鉑的IC50為16.592μg/mL。ZC-17

為單一化合物,純度相對較高,其IC50為5.465μg/mL;其他化合物純度較低,故不做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)經(jīng)鑒定ZC-17為紫草呋喃A(圖3)

圖3 紫草呋喃A化學(xué)結(jié)構(gòu)

3.2 ZC-17誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的檢測 由圖4可以看出,順鉑能誘導(dǎo)MG-63凋亡,凋亡率在22.1%,而DMSO 對細(xì)胞有較小的影響凋亡在5%附近。另外,ZC-17也能誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡,在濃度為50μg/mL、10μg/mL、2μg/mL時(shí),凋亡率分別23%、15.5%、13%,凋亡率同濃度成正相關(guān)。

圖4 ZC-17對MG-63作用散點(diǎn)圖

3.3 ZC-17作用MG-63細(xì)胞對bax和bcl-2的影響 從表2可以發(fā)現(xiàn),順鉑作用于MG-63在濃度為50μg/mL時(shí),能明顯降低Bcl-2/Bax比值,與空白組對比有顯著差異(P＜0.05);ZC-17在濃度為50μg/mL 時(shí),能降低MG-63細(xì)胞Bcl-2/Bax比值,具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05);而ZC-17在濃度為10μg/mL、2μg/mLL時(shí),與空白組Bcl-2/Bax比值對比,無明顯變化(P＞0.05)。提示ZC-17高濃度可以降低MG-63細(xì)胞Bcl-2/Bax的比值。

表 ZC-17作用對MG-63細(xì)胞Bcl-2/Bax影響(s,%)

表 ZC-17作用對MG-63細(xì)胞Bcl-2/Bax影響(s,%)

注：與DMSO比較,*P＜0.05。

4 討論

紫草作為傳統(tǒng)中藥材,其應(yīng)用歷史悠久,作用廣泛。近年來,人們在紫草化學(xué)成分及藥理作用方面的研究取得了一定成果并逐步深入,其中以紫草提取物以及以此為先導(dǎo)化合物合成的抗癌藥物體外抗癌作用的研究報(bào)道最引人注目。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是能量依賴的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞“自殺”是由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過程。1972年由Kerr等首次提出細(xì)胞凋亡的概念,從此開啟了對細(xì)胞凋亡的探索之路。細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制十分復(fù)雜。目前認(rèn)為至少有3條通路參與：即線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路,其中以線粒體通路最為經(jīng)典。Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內(nèi)膜的通透性,因此是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控者,它們通過激活一系列下游基因發(fā)揮調(diào)節(jié)凋亡作用[3]。Bcl-2家族分為3類：促凋亡蛋白(如Bak和Bax)、抗凋亡蛋白(如Bcl-2和Bcl-x L)以及Bi m、Bid等BH3-only蛋白。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白共同作用導(dǎo)致細(xì)胞凋亡結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)法測定ZC-17能引起細(xì)胞凋亡,且凋亡率與濃度正相關(guān);同時(shí),用Elisa法測定細(xì)胞中bcl-2、bax表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)ZC-17能降低bcl-2/bax。因此可推斷ZC-17誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2。

綜上所知,紫草系列化合物有抗腫瘤作用,ZC-17能促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且凋亡機(jī)制可能跟線粒體通路有關(guān),通過上調(diào)bax和下調(diào)bcl-2來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。