王星，張華，2，張淼，王小杰，談重芳

（1.鄭州大學(xué)物理學(xué)院（微電子學(xué)院）河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450052；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品生物工程學(xué)院，鄭州450046）

0 引 言

乳酸菌是指能夠通過發(fā)酵碳水化合物即糖類產(chǎn)生乳酸的無芽孢、不運(yùn)動(dòng)或少運(yùn)動(dòng)、革蘭氏呈陽性、過氧化氫呈陰性的一類細(xì)菌的總稱[1]，具有耐酸耐膽鹽、抑制致病微生物、抗氧化活性[2]、調(diào)節(jié)腸道微生物群[3]，提高人體免疫力[4]等多種功效，并且能夠幫助預(yù)防、治療或輔助治療多種疾病的發(fā)生。

生物膜是一種有組織的、具有功能性的細(xì)菌群體，是由菌體外的大量胞外基質(zhì)與細(xì)菌團(tuán)塊組成的微生物集合體[5]。自然界中的微生物在一定適當(dāng)情況下幾乎都能形成生物膜，當(dāng)細(xì)菌形成生物膜時(shí)，對(duì)抗生素或宿主本身免疫防御系統(tǒng)的抵抗作用將會(huì)增強(qiáng)[6]，所以目前對(duì)生物膜的研究大多集中在細(xì)菌生物膜的耐藥性及生物膜的清除方法[7]上面。

對(duì)于乳酸菌是益生菌這一說法，人們?cè)缫蚜私獠?duì)其進(jìn)行了廣泛利用，但目前人們對(duì)乳酸菌等益生菌生物膜作用機(jī)制的研究還很有限。生物膜具有黏附性，耐藥性，移動(dòng)性等特點(diǎn)[8]，如果病原菌形成生物膜，便會(huì)給臨床治療帶來很大困難[9]，但如果益生菌形成生物膜，則能更好的黏附到人體，更好地發(fā)揮益生作用。生物膜形成可以使乳酸菌菌體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，顯著提高自身抗逆性[10]，可以幫助乳酸菌抵御外界的不利因素等[11]。但生物膜的形成和發(fā)展受多種因素的影響，本文主要對(duì)乳酸菌生物膜的形成以及影響乳酸菌生物膜形成的因素進(jìn)行了闡述。

1 乳酸菌生物膜的形成及其影響

1.1 組成

生物膜的結(jié)構(gòu)及成分極其復(fù)雜，其形成和發(fā)展受到多重因素影響，成熟的生物膜主要包括細(xì)菌分泌的胞外聚合物和細(xì)菌生命體等[12]。胞外聚合物主要是指細(xì)菌分泌的各種生物大分子物質(zhì)如多糖，蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)能夠加強(qiáng)微生物細(xì)胞對(duì)外界的抵抗能力，同時(shí)還對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[13]有一定影響。

1.2 形成機(jī)制

乳酸菌生物膜的形成與細(xì)菌生物膜的形成一樣，都是動(dòng)態(tài)發(fā)展的過程，主要包括以下5個(gè)階段[11]。

（1）生物膜的可逆黏附：細(xì)菌成熟生物膜形成的首要要求就是要先與物體進(jìn)行接觸，首先菌體黏附到物體的表面，物體表面準(zhǔn)備形成生物膜，在這一階段，細(xì)胞的黏附強(qiáng)烈依賴于細(xì)菌細(xì)胞表面的物理化學(xué)性質(zhì)。

（2）生物膜的不可逆轉(zhuǎn)黏附期：當(dāng)進(jìn)行黏附的細(xì)菌不斷增多，使一些特定基因得到表達(dá)，由此生物膜開始形成，與此同時(shí)，大量的多聚物被分泌到胞外，細(xì)菌的黏附由細(xì)菌與表面的弱相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榕c胞外多糖的永久性結(jié)合[14]。

（3）生物膜結(jié)構(gòu)的早期發(fā)展：在細(xì)菌與物體的黏附變?yōu)椴豢赡婧?，?xì)胞大量聚集形成微生物菌群，這是微生物積累和生物長的共同結(jié)果，是產(chǎn)生胞外多糖的主要階段[15]。這些胞外多糖可以使微菌落的結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)固，從而使得生物膜變厚。

（4）生物膜的成熟：進(jìn)入成熟期的生物膜會(huì)形成有組織的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)的形成是由于類似蘑菇狀或株?duì)畹募?xì)菌團(tuán)塊不斷累加堆積導(dǎo)致的,從而使得生物膜變得更加厚,并開始圍繞著菌落旁的輸水管道進(jìn)行著養(yǎng)料、酶、代謝產(chǎn)物的運(yùn)送傳輸以及廢物的排出。

（5）生物膜的分散：分散是指將生物膜或載體表面的細(xì)菌解離釋放出來。生物膜結(jié)構(gòu)成熟后，生物膜細(xì)胞將從物體表面脫離，并且立刻恢復(fù)為浮游生物，開始尋找新的結(jié)合位點(diǎn)，在物體的表面進(jìn)行新一輪生物膜的形成。

1.3 乳酸菌生物膜的影響

1.3.1 乳酸菌生物膜對(duì)其耐受性的影響

乳酸菌生物膜在形成過程中，涉及到多種基因的表達(dá)及電荷轉(zhuǎn)移等物理化學(xué)變化，經(jīng)歷各種外界環(huán)境壓力，導(dǎo)致其相關(guān)應(yīng)激基因表達(dá)量提高，且對(duì)環(huán)境適應(yīng)及耐受能力也得到提高[10]。張國麗等人[16]的研究表明，植物乳桿菌SCP53 生物膜成熟后對(duì)溫度、酸堿度、鹽度的耐受力都得到顯著提升。王坤等人[17]的研究表明了類似的結(jié)果，乳酸菌混菌生物膜與游離菌株相比對(duì)酸和高溫具有更高的抗性，且能夠穩(wěn)定釋放游離菌株。Hiromi Kubota 等人[18]對(duì)成膜后的植物乳桿菌的研究表明，與浮游細(xì)胞相比，成膜后的菌株對(duì)機(jī)酸、乙醇或次氯酸鈉具有更高的抗逆性。這些結(jié)果表明，生物膜的形成使乳酸菌具有更高的耐受性。

1.3.2 乳酸菌生物膜對(duì)其抑菌能力的影響

乳酸菌附著于腸道表面形成一定的生物膜，與其他物質(zhì)競爭營養(yǎng)物質(zhì)和空間，從而抑制有害菌的黏附并分泌過氧化氫，有機(jī)酸等物質(zhì)來抑制病原菌的生長[19]。Barbarb 等[20]研究者發(fā)現(xiàn)，在乳酪生產(chǎn)中四種乳酸菌（植物乳桿菌DSM1055，干酪乳桿菌DSM20011，彎曲乳桿菌DSM20019，副干酪乳桿菌DSM20207）混菌生物膜可以有效地抑制李斯特菌的生長。Elena等[21]的研究表明乳酸菌黏附于口腔黏膜及成為牙齒生物膜一員競爭牙齒病原菌，來抑制病原菌的生長。

1.3.3 乳酸菌生物膜對(duì)發(fā)酵工業(yè)的影響

乳酸菌形成生物膜后具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在工業(yè)化發(fā)酵工程中具有良好的潛能。Rangaswamy 等[22]人利用德氏乳桿菌形成的生物膜填充到反應(yīng)器中來生產(chǎn)乳酸，極大地提高了乳酸的生產(chǎn)效率。Furukawa 等[23]的研究表明，釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜的形成促進(jìn)米醋發(fā)酵。除此之外，釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜可作為一個(gè)穩(wěn)定高效生產(chǎn)酒精的手段，不需要人工操作即可通過不到20%的葡萄糖便能產(chǎn)生足夠的乙醇[24]。

2 影響乳酸菌生物膜形成的因素

2.1 葡萄糖對(duì)乳酸菌生物膜形成能力的影響

葡萄糖作為乳酸菌生長的重要能量來源以及生物膜的組成部分，為其提供生長所必須的營養(yǎng)，因此影響著乳酸菌的生長及其生物膜的形成。張立東等[25]研究了四株乳酸菌生物膜形成的影響因素，表明在無葡萄糖的MRS 培養(yǎng)基上乳酸菌的生長受到顯著抑制，且?guī)缀鯚o法形成生物膜。因此，組成生物膜的胞外多糖是由菌體自身分泌的，葡萄糖的有無影響著乳酸菌的生長，從而影響乳酸菌生物膜的形成能力。任曉鏷等[26]對(duì)戊糖乳桿菌生物膜的研究也得出類似的結(jié)果，雖然乳酸菌的生長能力隨著葡萄糖濃度的增加會(huì)加強(qiáng)，但其成膜能力則先增強(qiáng)后下降，由此說明了適于乳酸菌形成生物膜的葡萄糖濃度有一定范圍，濃度過高或過低都會(huì)產(chǎn)生不利的影響。

2.2 金屬離子對(duì)乳酸菌生物膜形成能力的影響

金屬離子如Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Na+等與生物膜的形成關(guān)系密切。在任曉鏷等[26]對(duì)戊糖乳桿菌生物膜的研究中顯示出一定濃度的Ca2+對(duì)可以影響其生物膜的形成，當(dāng)Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，對(duì)戊糖乳桿菌生長情況的影響并不大，但其生物膜的形成能力在Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)0.5%時(shí)就基本被完全抑制。王堯禹等[27]的研究顯示出類似的結(jié)果，其研究表明氫氧化鈣能夠通過抑制糞腸球菌毒力因子等的表達(dá)來抑制其生物膜的形成。Lukas Gritsch 等[28]研究表明Cu2+和Cu+對(duì)生物膜的形成能力都有一定的抑制作用，其中Cu+對(duì)生物膜具有更強(qiáng)的抑制作用。張國麗等[29]研究表明，Cu2+通過抑制生物膜分泌胞外多糖達(dá)到破壞生物膜穩(wěn)定性，抑制生物膜形成的目的。

Mn2+對(duì)乳酸菌生物膜的形成具有促進(jìn)作用，在Yanjun Yong 等人[30]的研究中，Mn2+的存在能夠促進(jìn)植物乳桿菌CCFM436 分泌胞外蛋白，增加乳酸菌生物膜的穩(wěn)定性。Soma Nozaka 等[31]人對(duì)植物乳桿菌及混合菌生物膜形成能力的研究中，同樣表明了錳離子的添加能夠促進(jìn)植物乳桿菌單菌及混合菌形成致密的生物膜。Mg2+是多種酶的輔基，林雅茵等[32]認(rèn)為Mg2+能夠使細(xì)菌的早期黏附能力得到加強(qiáng)，還能影響生物膜初期和成熟期的結(jié)構(gòu)，因此Mg2+的添加會(huì)使得生物膜變得更為復(fù)雜。

多數(shù)的乳酸菌分離株都能耐4.0%和6.5%的NaCl[33]，其在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%和6.5%的氯化鈉中的生長情況是鑒別其有關(guān)屬的一項(xiàng)重要指標(biāo)[34]，因此NaCl濃度的大小也影響著乳酸菌生物膜的形成。在徐文生等[35]就NaCl 對(duì)長雙歧桿菌生物膜形成能力的影響研究中，表明一定濃度的Na+對(duì)形成生物膜有促進(jìn)作用，該結(jié)果與任曉鏷等[36]對(duì)植物乳桿菌生物膜的研究結(jié)果一致。Knobloch 等[37]指出NaCl 能夠抑制用于阻止生物膜形成的icaR 基因的表達(dá)，還能激活用于誘導(dǎo)生物膜的形成SigB 和RsbU 因子，從而促進(jìn)形成生物膜。

2.3 pH 對(duì)乳酸菌生物膜形成能力的影響

pH 值在微生物生物膜形成過程中有著非常大作用，有研究稱，pH 對(duì)生物膜的影響主要是通過影響電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的[38]，因而適合生物膜形成的pH 范圍極窄。對(duì)于乳酸菌來說，乳酸菌本身能夠產(chǎn)生乳酸，因此在pH 值偏酸性條件下，乳酸菌能夠生長并形成膜。任曉鏷等[26]、張國麗等[29]通過對(duì)乳桿菌進(jìn)行研究，表明乳桿菌生物膜形成能力最強(qiáng)時(shí)的pH 值為5.5～6.8，在pH 值小于3.8 或大于6.8 時(shí)其生長及生物膜形成能力會(huì)受到明顯的抑制。在Lebeer S 等[39]對(duì)鼠李糖乳桿菌的研究中提及，pH 能夠通過影響鼠李糖乳桿菌的細(xì)胞表面，從而影響生物膜的發(fā)育，其研究結(jié)果顯示，鼠李糖乳桿菌在初始pH 為4.0 時(shí)其生物膜的形成會(huì)受到抑制。這些都說明了每種微生物都有最適合自身生長的pH 值，pH 值過高或過低都會(huì)產(chǎn)生不利影響，會(huì)導(dǎo)致微生物生長速率過慢，菌體產(chǎn)生數(shù)量過低，從而不易于膜的形成[33-37]。

2.4 不同食品添加劑對(duì)乳酸菌生物膜形成能力的影響

乳酸菌是食品中常見的益生菌，影響發(fā)酵食品的生成，而食品添加劑在食品發(fā)酵過程是必不可少的，因此添加不同的食品添加劑會(huì)對(duì)乳酸菌形成生物膜產(chǎn)生不同的影響。日常生活中最常用常見的食品添加劑是酸味劑和增稠劑，這些添加劑存在不僅使得食品的口感變得更好，還改變了發(fā)酵食品中微生物的生存環(huán)境。

在任曉鏷等[26]對(duì)戊糖乳桿菌生物膜形成因素的研究結(jié)果中表明，不同的食品添加酸及其不同濃度對(duì)乳酸菌的生長和生物膜的形成有著不同的影響。乳酸作為乳酸菌最主要的代謝產(chǎn)物，還用作食品中的酸味劑，它對(duì)食品有一定的防腐保鮮的功能，低濃度的乳酸就會(huì)抑制乳酸菌形成生物膜。但對(duì)于其他的酸味劑檸檬酸、蘋果酸、磷酸等，其體積分?jǐn)?shù)必須達(dá)到一定程度才會(huì)影響乳酸菌的生長及其生物膜形成。

通常為了保持產(chǎn)品的形狀，會(huì)添加一定的增稠劑，明膠和果膠是最為常見的增稠劑，它們對(duì)乳酸菌生物膜的影響各不相同。在張國麗等[29]對(duì)植物乳桿菌生物膜形成條件的研究中表明，與明膠相比果膠對(duì)生物膜形成有著更強(qiáng)的促進(jìn)作用。對(duì)于果膠來說，生物膜的形成量會(huì)隨著果膠添加量的增加而增加，但也會(huì)存在一個(gè)上限，當(dāng)其添加量大于5.0 mg/mL 時(shí)，生物膜的形成量會(huì)開始降低。

3 結(jié) 語

生物膜的形成可以幫助菌體更好的適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)自身的免疫能力，幫助其對(duì)抗抗生素，從而免于被免疫系統(tǒng)所吞噬[40]。對(duì)于益生菌來說，生物膜的存在可以幫助有益微生物抵抗不利環(huán)境的脅迫[41]，除此之外，還可以通過生物膜的形成來進(jìn)行益生菌的聚集，從而使發(fā)酵菌種具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性與活性，因此生物膜對(duì)于食品的加工和安全有極其重要的研究價(jià)值。本文通過對(duì)影響乳酸菌生物膜性形成的因素進(jìn)行綜述，希望能為利用生物膜更好地增強(qiáng)乳酸菌的益生活性提供一定的理論依據(jù)和研究方向。