胡元森 田萍萍 李棒棒 張帥兵 魏 閃 呂揚(yáng)勇

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

糧食是具有生命活性的有機(jī)體，在長(zhǎng)期儲(chǔ)藏過(guò)程中，籽粒內(nèi)部會(huì)發(fā)生諸如組織結(jié)構(gòu)松弛、呼吸速率下降、酶活性降低、生活力減弱等系列的物理、化學(xué)及生物學(xué)性狀的變化，從而造成其食用品質(zhì)和種用品質(zhì)持續(xù)劣變[1,2]。當(dāng)外界溫、濕、氣等環(huán)境因子適宜時(shí)，糧食以其自身蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)，使能夠引起糧食生理性變質(zhì)的有毒物質(zhì)積累[3]。例如：代謝產(chǎn)生的部分游離自由基及一些脂類(lèi)氧化產(chǎn)物與其他脂類(lèi)發(fā)生次級(jí)反應(yīng)使細(xì)胞膜破裂、蛋白質(zhì)降解、酶活性喪失等，最終導(dǎo)致細(xì)胞畸形和解體、呼吸減弱、生活力下降等生理性變質(zhì)[4,5]。糧食倉(cāng)儲(chǔ)實(shí)踐表明，采用低溫、干燥、缺氧等多種人工調(diào)控措施可有效降低糧食生理活動(dòng)，延緩生命活動(dòng)進(jìn)程，達(dá)到保質(zhì)保鮮的效果。糧食生理性變質(zhì)與糧食籽粒的生理活動(dòng)狀態(tài)密切相關(guān)，糧食生理活動(dòng)強(qiáng)弱與其品質(zhì)性狀劣變快慢呈正相關(guān)。本文介紹糧食儲(chǔ)藏生理研究現(xiàn)狀，為糧食綠色、安全儲(chǔ)藏及耐儲(chǔ)藏糧食品種的改良和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 糧食儲(chǔ)藏劣變過(guò)程中胚部微觀結(jié)構(gòu)

1.1 種胚結(jié)構(gòu)

種胚中的可溶性糖、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，是種子生命活動(dòng)集中發(fā)生的區(qū)域。儲(chǔ)藏劣變過(guò)程中，糧食種胚形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生漸進(jìn)性改變[6]。

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，小麥籽粒劣變從胚根開(kāi)始發(fā)生，沿胚軸逐漸蔓延到胚芽[7]。小麥種胚中顆粒狀物質(zhì)不斷降解，種胚切面平整光滑，胚部細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞內(nèi)容物溢出至胚細(xì)胞間隙，表明籽粒衰老過(guò)程中細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生崩解，細(xì)胞完整性受到破壞[8, 9]。水稻在儲(chǔ)藏中其種胚結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)相似的變化，韓瑞等[10]研究表明，正常的水稻種胚細(xì)胞的膜系統(tǒng)(質(zhì)膜、核膜、線粒體膜)清晰完整，細(xì)胞內(nèi)分布有清晰可見(jiàn)的線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，但在老化種胚細(xì)胞內(nèi)，其細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，數(shù)量減少，線粒體腫脹變形，膜破損及解體，脂質(zhì)體和脂質(zhì)發(fā)生團(tuán)聚集等現(xiàn)象。隨著劣變加深，溶酶體破裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞全面解體。

1.2 胚乳結(jié)構(gòu)

小麥、玉米等糧食籽粒屬于淀粉質(zhì)種子，胚乳中含有豐富的淀粉等貯藏物質(zhì)。對(duì)不同硬度小麥籽粒橫切面的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，軟質(zhì)和硬質(zhì)小麥種子的糊粉層細(xì)胞差異不明顯，但胚乳結(jié)構(gòu)差異較大。軟質(zhì)小麥胚乳淀粉粒間較分散，基質(zhì)蛋白與淀粉粒呈分離狀態(tài)，整體性差；硬質(zhì)胚乳的基質(zhì)蛋白與淀粉粒間結(jié)合緊密，淀粉粒被蛋白質(zhì)包裹，結(jié)構(gòu)緊湊[11]。小麥籽粒硬度大小可能與基質(zhì)蛋白和淀粉粒間的結(jié)合程度有關(guān)。王若蘭等[12]研究發(fā)現(xiàn)，電子束輻照后小麥胚乳淀粉和基質(zhì)蛋白結(jié)合松散，而稻谷胚乳出現(xiàn)裂紋。Tian等[9]用掃描電鏡觀察了25 ℃自然老化(發(fā)芽率大于90%)與45 ℃高溫人工老化10個(gè)月的種子(發(fā)芽率低于20%)的胚乳結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，與自然老化狀態(tài)相比，高溫人工老化的小麥種子胚乳淀粉顆粒變得疏松，蛋白基質(zhì)減少甚至消失。

2 糧食儲(chǔ)藏劣變過(guò)程中貯藏物質(zhì)變化

糧食中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為籽粒正常呼吸及種子萌發(fā)提供能量。糧食儲(chǔ)藏劣變是一個(gè)包含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化在內(nèi)的由量變到質(zhì)變的復(fù)雜生物化學(xué)過(guò)程。種子在儲(chǔ)藏過(guò)程中需要消耗呼吸作用提供的能量以維持正常的生命代謝。Ochandio等[13]發(fā)現(xiàn)，大豆種子在高溫高濕條件下儲(chǔ)藏時(shí)，氧氣消耗速度遠(yuǎn)高于正常條件，增強(qiáng)水解酶的作用能夠增加呼吸速率。呼吸活動(dòng)的增強(qiáng)導(dǎo)致活性氧(ROS)產(chǎn)生增多，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化破壞質(zhì)膜，降低同一底物線粒體能量產(chǎn)生的效率[14,15]。另外，ROS含量增多會(huì)誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化，蛋白質(zhì)羰基化，使其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生變化[16]。研究表明，老化種子中羰基化的蛋白質(zhì)明顯高于正常蛋白質(zhì)[17]，由于蛋白質(zhì)的降解，種子中的蛋白質(zhì)含量降低，隨之釋放出用于新陳代謝和呼吸的氨基酸，導(dǎo)致生存能力降低[18]。

2.1 可溶性糖

糧食中可溶性糖主要有棉子糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等，是糧食進(jìn)行呼吸供能的主要底物?？扇苄蕴怯兄诰S持糧食籽粒細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性[19]。Bruni等[20]發(fā)現(xiàn)二糖與膜結(jié)構(gòu)和儲(chǔ)藏蛋白有關(guān)，影響種子細(xì)胞質(zhì)玻璃化。

在老化過(guò)程中，不同種子中可溶性糖含量變化差異較大。油菜種子和山羊草種子的可溶性糖含量與種子老化程度呈正相關(guān)[21,22]。經(jīng)高溫高濕陳化處理的糯小麥可溶性糖含量增加[23]，而大麥中可溶性糖變化不明顯[24]。玉米和大豆中可溶性糖含量在儲(chǔ)藏過(guò)程中降低[25,20]。李瑞芳[26]研究發(fā)現(xiàn)老化會(huì)抑制玉米種子中淀粉的轉(zhuǎn)化，阻礙了種子萌發(fā)過(guò)程中蔗糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖的供應(yīng)。閆慧娟[27]研究發(fā)現(xiàn)，大豆種胚不同部位的糖含量變化也有差異。自然老化的大豆胚軸單糖(半乳糖、肌醇)含量基本不變，蔗糖含量下降，而子葉中單糖含量略增加，蔗糖含量先升后降，蜜二糖含量略有下降。

2.2 蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞骨架和維持生命活動(dòng)的一類(lèi)重要的生物大分子，參與執(zhí)行生物體基因表達(dá)、形態(tài)建成、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等多種重要的生理功能。在儲(chǔ)藏過(guò)程中，ROS既可以直接介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，也可以先誘導(dǎo)脂類(lèi)物質(zhì)氧化和加速非酶糖基化，再利用中間活性產(chǎn)物介導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化[28]。蛋白質(zhì)發(fā)生氧化的部位通常在主鏈、脂肪族氨基酸側(cè)鏈殘基和芳香族氨基酸側(cè)鏈殘基[29]。蛋白質(zhì)的氧化會(huì)造成其二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性、活性巰基及二硫鍵等發(fā)生變化，從而使其功能性質(zhì)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞和組織功能紊亂[30]。

研究表明，糧食貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)總含量基本保持穩(wěn)定，但蛋白種類(lèi)會(huì)發(fā)生變化。Rao等[31]研究發(fā)現(xiàn)，新收獲小麥中含有大量的低分子量醇溶蛋白，隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，谷蛋白含量增多，醇溶蛋白含量減少，這種變化與小麥品質(zhì)逐步改善密切關(guān)聯(lián)。在40 ℃和4 ℃貯藏1年的稻谷中，水溶性蛋白和鹽溶性蛋白明顯下降，醇溶性蛋白也有下降趨勢(shì)。在品質(zhì)上表現(xiàn)為米粒間松散，適口性和黏彈性變差[32]。Zhang等[33]運(yùn)用蛋白組學(xué)方法對(duì)不同生理活力種子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在鑒定的65種差異蛋白中，超過(guò)95%的蛋白參與新陳代謝(23%)、蛋白質(zhì)合成加工(22%)、能量代謝(18%)、細(xì)胞防御和救援(17%)、作為儲(chǔ)存蛋白(15%)以及維持細(xì)胞生長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(3%)。在水稻、大麥、小麥、油菜籽等研究中，學(xué)者通過(guò)人工老化試驗(yàn)確定了影響種子活力的基因位點(diǎn)[34-37]。此外，對(duì)玉米種子的蛋白質(zhì)分析揭示了種子在人工衰老過(guò)程中具有共同特征[38]。

2.3 脂類(lèi)

糧食籽粒中脂類(lèi)變化主要有兩個(gè)方面作用。一是氧化作用，脂類(lèi)在細(xì)胞內(nèi)外被氧化產(chǎn)生過(guò)氧化物及羰基化合物，如醛、酮類(lèi)物質(zhì)。二是水解，在脂肪酶作用下水解成甘油和脂肪酸[32]。

胚和胚乳中的中性脂以糖脂和磷脂的形式構(gòu)成細(xì)胞膜基本骨架，其中多不飽和脂肪酸的氧化改變了細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)持續(xù)外滲[39]。脂類(lèi)過(guò)氧化的次級(jí)代謝產(chǎn)物如丙二醛通過(guò)Maillard反應(yīng)和Amadori反應(yīng)進(jìn)一步破壞胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸，使糧食籽粒細(xì)胞酶活性喪失和遺傳物質(zhì)變性[40]。娜荷雅[41]研究了油菜、大豆和燕麥對(duì)高溫脅迫的耐受性，發(fā)現(xiàn)種子內(nèi)生成的Maillard反應(yīng)產(chǎn)物能加速種子的老化進(jìn)程。過(guò)氧化作用還會(huì)引起其它生理過(guò)程遭受破壞，如脂肪酸過(guò)氧化產(chǎn)生的自由基引起蛋白結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變[42]，攻擊染色體DNA，使DNA鏈中的堿基和脫氧核糖氧化發(fā)生雙鏈斷裂，阻滯細(xì)胞有絲分裂起始[43]。許多研究結(jié)果也表明，脂肪氧化往往伴隨著小麥籽粒發(fā)芽率及酶活性下降。

糧食籽粒細(xì)胞膜含有油酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸，自由基與不飽和脂肪酸作用降低其在細(xì)胞膜中的含量，使細(xì)胞膜完整性喪失[44]。然而，在不同作物中的研究結(jié)果有較大差異，花生高溫陳化后發(fā)現(xiàn)其籽粒中油酸與亞油酸的相對(duì)含量并沒(méi)有發(fā)生變化[45]，而在大豆中這兩種脂肪酸增加了2倍[46]。也有學(xué)者研究提出，糧食變質(zhì)可能由于糧食細(xì)胞壁游離酚酸物質(zhì)的釋放改變了細(xì)胞壁的完整性，同時(shí)通過(guò)抗氧化活性影響了與淀粉糖結(jié)合的酚酸物質(zhì)的形成而對(duì)糧食加工品質(zhì)帶來(lái)不利[47,48]，部分研究也表明，種子中抗氧化活性物質(zhì)消失對(duì)糧食種子生活力影響較大，對(duì)其種用品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。

3 呼吸作用與能量代謝

線粒體是糧食籽粒進(jìn)行呼吸作用的主要場(chǎng)所，為種子新陳代謝提供基本能量來(lái)源。在老化過(guò)程中，線粒體發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和化學(xué)變化，這些變化主要是由這些細(xì)胞器內(nèi)產(chǎn)生的ROS引起的[49]。線粒體中ROS引起的結(jié)構(gòu)改變從內(nèi)膜開(kāi)始，然后線粒體嵴縮短并塌陷，呼吸鏈的復(fù)合物轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)膜上分離的蛋白質(zhì)開(kāi)始混合。隨著老化的進(jìn)行，嵴完全消失，內(nèi)部膜蛋白失去內(nèi)聚力，導(dǎo)致膜破裂，細(xì)胞色素c和囊泡膜滲漏至胞漿[50]。Miquel等[51]首次提出種子衰老的線粒體學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為，種子衰老過(guò)程中活性氧不斷積累導(dǎo)致線粒體脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生氧化損傷，引起細(xì)胞生理異常。糧食籽粒衰老時(shí)，線粒體膜結(jié)構(gòu)受損傷，導(dǎo)致ATP合成酶活性降低，線粒體呼吸和ATP合成功能受到影響。韓瑞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，水稻種子老化時(shí)其線粒體膜膨脹、破損及解體。Gidrol等[52]也發(fā)現(xiàn)老化的大豆和豌豆種子中線粒體膜受損，ATP含量下降，ATP合成受阻。Amable等[53]研究表明，老化的大豆種子耗氧量下降，進(jìn)而提出線粒體是種子最先老化的部位。在人工加速老化的甜菜種子中發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)的主要酶如蘋(píng)果酸脫氫酶活性隨老化程度加深而大幅降低[54]。上述研究揭示，種子衰老影響線粒體呼吸酶活性下降，活性氧增多，使得氧化損傷加劇，ATP合成不足，最終影響種子活力。

4 遺傳物質(zhì)的變異

在儲(chǔ)藏過(guò)程中，種子的DNA損傷主要來(lái)自氧化應(yīng)激[49]，過(guò)量的ROS在細(xì)胞和分子水平上引起氧化損傷[55]。當(dāng)DNA長(zhǎng)期暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境時(shí)，ROS誘導(dǎo)的DNA損傷就會(huì)發(fā)生，損傷可能會(huì)引起細(xì)胞停止生長(zhǎng)，導(dǎo)致突變甚至細(xì)胞死亡[56]。此外，RNA由于其單鏈結(jié)構(gòu)和缺乏修復(fù)系統(tǒng)，更容易被ROS氧化[57]。被氧化的mRNA會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成和降解，這與種子壽命的縮短有關(guān)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，種子RNA受損傷加劇，影響RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量[58,59]。Robert等[60]研究不同發(fā)芽率黑麥草種子中胚部DNA含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽率95%以上的黑麥草種子胚中DNA含量比活力較低的種子高出3倍。Kazimierz等[61]研究蠶豆種子老化時(shí)發(fā)現(xiàn)，RNA及多核糖體的合成能力在不斷下降，隨儲(chǔ)藏年限延長(zhǎng)，遺傳多樣性指數(shù)、遺傳位點(diǎn)的等位基因數(shù)量都有明顯下降。Parzies[62]研究了不同儲(chǔ)藏年限的大麥種子，發(fā)現(xiàn)大麥種子的遺傳多樣性、等位基因數(shù)量也有類(lèi)似的變化。水稻、玉米種子老化過(guò)程中，RNA完整性被破壞，RNA降解為小分子量的RNA。隨著玉米種子老化，DNA合成酶和DNA聚合酶的活性均呈降低趨勢(shì)[63,64]。Joice等[65]對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)間的大豆種子中的RNA進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏時(shí)間長(zhǎng)的種子中出現(xiàn)更嚴(yán)重的組織損傷，損傷主要是由較長(zhǎng)鏈的RNA斷裂引起的。種子衰老過(guò)程中的基因損傷必然導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯錯(cuò)誤，老化種子在萌發(fā)過(guò)程中常發(fā)生染色體畸變、斷裂等情況，在實(shí)際生產(chǎn)中也會(huì)出現(xiàn)植株幼苗瘦弱、矮小、早衰等現(xiàn)象。

5 細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)作用

種子生理劣變與其體內(nèi)活性氧不斷積累并對(duì)細(xì)胞器造成損傷有關(guān)。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物細(xì)胞形成了一系列有效的抗氧化機(jī)制以清除活性氧等有害物質(zhì)。抗氧化防御體系包括抗氧化酶體系和非酶體系?？寡趸瘎┓烙到y(tǒng)的主要酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化物還原酶(Prx)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)和谷胱甘肽還原酶(GR)[66-70]。非酶體系主要是抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)。

過(guò)氧化氫酶是生物體抗衰老、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的一種保護(hù)酶，普遍存在于生物細(xì)胞中，是最早發(fā)現(xiàn)與種子活力有關(guān)的氧化酶之一[71]。過(guò)氧化氫酶活性間接反應(yīng)種子活力，是評(píng)判糧食籽粒新鮮程度的一個(gè)重要指標(biāo)。過(guò)氧化物酶可消除植物細(xì)胞內(nèi)的自由基，延緩細(xì)胞衰老。稻谷儲(chǔ)藏期間，過(guò)氧化物酶及過(guò)氧化氫酶活性快速消失，而蛋白酶、脂肪酶及脂氧合酶活性不斷升高[72]，這表明稻谷儲(chǔ)藏后期營(yíng)養(yǎng)物水解轉(zhuǎn)化速度加快，而有害代謝物清除能力減弱。細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞氧化磷酸化過(guò)程中的重要酶，存在于線粒體內(nèi)膜上，其活性高低往往作為細(xì)胞氧化代謝的重要指標(biāo)。在對(duì)甜菜的衰老研究中發(fā)現(xiàn)，伴隨種子活力的降低，細(xì)胞色素氧化酶的活性也不斷下降[73]。

抗壞血酸在老化過(guò)程中始終發(fā)揮清除活性氧的作用，ROS產(chǎn)生速率和H2O2含量的增加是種子老化劣變的重要原因[24]。Xin等[74]研究表明，老化的大豆種子線粒體功能紊亂主要是由于線粒體和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)活性降低，ROS積累的結(jié)果，抗氧化系統(tǒng)能阻止種子老化過(guò)程中ROS的累積。這與前人研究大豆[75]、向日葵[76]的抗氧化系統(tǒng)活性降低引起種子老化的結(jié)果相似。

6 結(jié)語(yǔ)

糧食生理活動(dòng)改變了籽粒營(yíng)養(yǎng)物化學(xué)組成與組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響食用品質(zhì)，如大米貯藏中游離脂肪酸增多而致米飯變硬；糧食籽粒生命活動(dòng)的有害代謝產(chǎn)物在種胚中積累，如蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的胺類(lèi)、呼吸作用形成超氧自由基等對(duì)種子活力損傷作用明顯，部分有害代謝物與細(xì)胞內(nèi)特定位點(diǎn)生物大分子如酶蛋白等發(fā)生作用，使之活性鈍化或喪失，能量分子ATP不能正常生成；籽粒老化不可避免的導(dǎo)致遺傳物質(zhì)合成減少，基因表達(dá)和蛋白翻譯出錯(cuò)，從而使糧食籽粒的生活力減弱。從前人研究可看出，儲(chǔ)糧生理活動(dòng)是引發(fā)其生理性劣變的關(guān)鍵要素。然而，糧食籽粒是具有生物活性的有機(jī)體，種子活力是衡量糧食價(jià)值的重要指標(biāo)。健全的細(xì)胞防御酶系統(tǒng)是延緩糧食老化和保持活力的有效因素，如細(xì)胞過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等保護(hù)酶能有效清除籽粒代謝產(chǎn)生的自由基等有害物在胚部的積累。此外，部分糧食品種有提高籽粒脫水耐受性的特定保護(hù)性分子，例如熱激蛋白、非還原糖等。

小麥生理劣變與食用品質(zhì)變劣間的關(guān)系還不十分明確，如何從糧食儲(chǔ)藏生理劣變視角提出育種要求也鮮見(jiàn)報(bào)道。從微觀角度分析種子衰老與細(xì)胞衰老關(guān)系的研究尚未形成體系。從糧食儲(chǔ)藏生理特性出發(fā)，深入開(kāi)展糧食生理活動(dòng)與其品質(zhì)劣變間的機(jī)制研究，將有助于揭示糧食儲(chǔ)藏生理性變質(zhì)的生物學(xué)機(jī)理，也為延緩品質(zhì)劣變，完善糧食儲(chǔ)藏方法與技術(shù)奠定新型理論基礎(chǔ)。