謝彩霞，汪志文，魯義善，湯菊芬，簡紀常

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院//廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東 湛江 524088）

羅非魚（Oreochromis）是全世界廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟魚類，有生長快、食性雜、適應性強等特點。我國是羅非魚生產(chǎn)大國，但隨著羅非魚種質(zhì)退化及養(yǎng)殖環(huán)境污染，各種疾病暴發(fā)，特別是無乳鏈球菌病，對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成較大影響[1-2]。無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）感染羅非魚后最明顯癥狀是，部分病魚眼球突出、周圍充血，鰓蓋內(nèi)側發(fā)紅、充血或出血，病魚死亡率高達25%～80%[3-7]。

免疫機制研究已成為魚類疾病預防的熱點，PI3K/Akt 信號通路是細胞內(nèi)極其重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）為該信號通路上主要調(diào)節(jié)蛋白，參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。IA 類PI3K 是一種專性異二聚體，由一個催化亞基（p110）和調(diào)節(jié)亞基（p85）組成[8]，其中p110 由pik3ca基因編碼，p85 由pik3r1基因編碼。pik3r1是磷酸肌醇信號通路的重要調(diào)控基因，在哺乳動物中已證實參與多種免疫途徑，目前對該基因的研究報道主要是在人的癌癥[9-11]、腫瘤[12-13]、胰島素調(diào)控[14]等方面，但在水產(chǎn)方面鮮有報道。筆者從尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）脾臟組織中克隆得pik3r1基因，研究該基因在健康及經(jīng)無乳鏈球菌刺激的羅非魚中的表達情況，為pik3r1在羅非魚鏈球菌病防控方面研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用尼羅羅非魚 [(100 ± 10)g]購自湛江市東風市場，在（28±2）℃條件下暫養(yǎng)4 周后備用；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 和無乳鏈球菌（S.agalctiaeZQ0910）菌種由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室提供；克隆載體pMD18-T Vector、Ex Taq 酶購自TaKaRa 公司（大連）；引物由廣州生工合成，DNA 膠回收試劑盒購自ThermoFish 公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA 提取和cDNA 合成 取健康尼羅羅非魚脾臟組織10～ 20 mg，按照上海生工UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒說明書提取羅非魚脾臟的總RNA；按照TaKaRa 公司的Reverse Transcriptase M-MLV 說明書將提取到的羅非魚脾臟組織的總RNA 反轉(zhuǎn)成cDNA 第一鏈用于后續(xù)試驗。無乳鏈球菌誘導試驗中，實驗組腹腔注射磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸的無乳鏈球菌（1×107CFU/mL）0.1 mL，空白對照組注射滅菌的0.1 mL PBS，然后在4、8、12、24、48、72、96 h 取羅非魚頭腎、肌肉、脾臟、鰓、皮膚、腸道、腦、胸腺等8 個組織約10～ 20 mg，同法進行羅非魚總RNA 提取和cDNA 合成。

1.2.2 羅非魚pik3r1 基因的分子克隆 依pik3r1基因編碼區(qū)利用 PrimerPremier 5.0 設計引物On-pik3r1-1F、On-pik3r1-2190R（表1），然后進行PCR 擴增，反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min 10 s，33 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃下保存，對PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，目的條帶經(jīng)切膠回收后與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（E.coil）DH5α 中，最后進行菌落PCR鑒定，陽性克隆送廣州生工測序。

表1 實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 羅非魚pik3r1基因的生物信息學分析 用SeqMan 軟件對陽性克隆的送測結果進行拼接，獲得On-pik3r1 編碼序列。分別用ExPASy(http://expasy.org/tools/)，InterProScan 程序（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）進行蛋白質(zhì)分析和結構域預測；利用UCSC 預測內(nèi)含子外顯子；蛋白質(zhì)二級，三級結構的預測網(wǎng)址分別為PORTER (http://www.distill.ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/inter active)。Clutalx 和Genedoc 程序被用于氨基酸同源序列比對。通過MEGA6.0 軟件，用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 用qRT-PCR 分析pik3r1的組織表達 熒光定量特異性引物 q R T-P I K 3 R 1-1 3 0 4 F、qRT-PIK3R1-1514R 見表1，以β-actin作為內(nèi)參基因，每個樣本設置3 個平行復孔，使用熒光定量PCR儀對健康魚組織及經(jīng)無乳鏈球菌感染后的組織分別進行qRT-PCR。反應條件參考TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 試劑盒：預變性94 ℃30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s。采用2-ΔΔCt法計算On-pik3r1在健康魚及經(jīng)無乳鏈球菌感染后組織中的相對表達量，并使用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 On-pik3r1 克隆結果及序列分析

On-pik3r1編碼區(qū)長2 190 bp，編碼729 個氨基酸（圖1），理論分子質(zhì)量為83.99 ku，5′端UTR 為542 bp，3′端UTR 為2 248 bp，理論等電點為5.73，分子式為C3728H5839N1029O1136S23；脂肪系數(shù)為80.26，不穩(wěn)定指數(shù)為50.56，歸類為1 個不穩(wěn)定蛋白；該蛋白總平均親水值為-0.689；ProtScale 分析（圖2）表明，On-pik3r1 蛋白親水性氨基酸含量較高，親水區(qū)域較大，為親水性蛋白，與理化分析結果一致，因此推測On-pik3r1基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白。Signal P 4.1 Server 預測該序列不存在信號肽；TMHMM Server 2.0 預測該蛋白為胞外蛋白，不存在跨膜區(qū)。對On-pik3r1的亞細胞定位預測結果為細胞質(zhì)。ProtParam 在線分析顯示，On-pik3r1 推導的氨基酸序列中亮氨酸 (Leu) 含量最高，為10.2%；谷氨酸(Glu) 含量次之，為8.6%，色氨酸 (Trp) 含量最低，為1.2%。帶正電荷氨基酸 (Arg+Lys) 95 個，帶負電荷氨基酸 (Asp+Glu) 110 個。SoftBerry-Psite 預測該序列功能位點（圖1），發(fā)現(xiàn)該序列N-糖基化位點6個，酪蛋白激酶II 磷酸化位點15 個，酪氨酸激酶磷酸化位點1 個，蛋白激酶C 磷酸化位點13 個，酰胺化化位點3 個，N-豆蔻?；稽c3 個，戊基結合位點3 個，C-末端定位信號序列微體10個。InterProScan程序預測pik3r1結構域由SH2、SH3 和RhoGAP 組成（圖3）。UCSC 預測的內(nèi)含子外顯子結構如圖4。

圖1 尼羅羅非魚pik3r1 基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame and deduced amino acid sequences of pik3r1 gene in Nile tilapia

圖1 續(xù)（Continued）

圖2 pik3r1 蛋白親疏水性預測Fig.2 Predicted hydrophobicity of pik3r1 protein

圖3 pik3r1 功能結構域預測Fig.3 pik3r1 functional domain prediction

圖4 pik3r1 基因內(nèi)含子-外顯子基因結構Fig.4 Intron-exon gene structure of pik3r1 gene

2.2 二級結構和三級結構預測

On-pik3r1 蛋白的二級結構（圖5）中，α 螺旋含量為45.95%，β 折疊3.98%，無規(guī)則卷曲39.92%，延伸鏈為10.15%。On-pik3r1 三維結構如圖6 所示。

圖5 尼羅羅非魚pik3r1 蛋白質(zhì)對應的二級結構Fig.5 Secondary structure prediction domains of pik3r1 protein in Nile tilapia

圖6 羅非魚與人類pik3r1 蛋白三維結構Fig.6 Three-dimensional structures of pik3r1 in Nile tilapia and Homo sapiens

2.3 羅非魚On-pik3r1 同源性及系統(tǒng)進化樹分析

將pik3r1基因編碼的氨基酸序列進行BLAST比對（圖7），發(fā)現(xiàn)pik3r1較保守，與其他物種的同源性在70%以上，其中與斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）相似性最高，為98.53%，與虹鱒（Oncorhynchusmykiss）、電鰻（Electrophorus electricus）、歐加里托幾維鳥（Apteryx rowi）的相似性分別為87.96%、84.14%、79.38%。在系統(tǒng)進化樹中，羅非魚和同斑馬擬麗魚聚為一支，親緣關系最為相近（圖8）。

圖7 羅非魚pik3r1 與其他物種pik3r1 氨基酸序列比對Fig.7 Multiple alignment of the predicted On-pik3r1 with amino acid sequences in other species

圖8 鄰接法構建pik3r1 氨基酸系統(tǒng)進化樹Fig.8 Phylogenetic tree of pik3r1 by neighbour-joining method

2.4 On-pik3r1 的組織表達分析

熒光定量結果顯示，On-pik3r1基因在所有組織中均可表達，且在肌肉中表達量最高，其次是鰓、皮膚，在胸腺中表達量最低（圖9）。在滅活無乳鏈球菌刺激羅非魚后，在不同時間點，On-pik3r1基因表達量在鰓、脾臟、頭腎、腸道、腦部等5 個組織中的表達均極顯著下調(diào)，在胸腺中表現(xiàn)為4 h 時極顯著下調(diào)，24、48、72 h 時為顯著下調(diào)（圖10）。

圖9 羅非魚pik3r1 在不同組織中的表達情況Fig.9 Expression of pik3r1 of Tilapia in different tissues

圖10 無乳鏈球菌感染后羅非魚pik3r1 在各個組織中的時序表達Fig.10 Temporal expression of pik3r1 in different tissues after infected by S.agalactiae

3 討論

本研究克隆鑒定得pik3r1（命名為On-pik3r1），On-pik3r1基因編碼區(qū)為2 190 bp，5′ UTR 為542 bp，3′ UTR 為2 248 bp。進化樹中與斑馬擬麗魚親緣關系較近。在推導的On-pik3r1 序列中發(fā)現(xiàn)兩個SH2 結構域、一個SH3 結構域和RhoGAP 結構域，這些保守區(qū)域與其他物種序列較一致。經(jīng)比對，pik3r1 氨基酸序列在魚類、鳥類和哺乳動物中高度保守，這些結果表明，pik3r1 在這些物種中可能有類似的功能。

本研究中，On-pik3r1在健康尼羅羅非魚各組織中均有表達，但不同組織間表達量差異較大，肌肉最高，鰓、皮膚次之，胸腺最低，pik3r1在半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[15]的脾臟、肝臟、心臟、腸、腦、皮膚、腎臟、一側性腺、肌肉、鰓絲10 種組織中亦均有表達，且不同組織間表達量差異較大，說明pik3r1基因參與魚類的多種生理反應。胸腺是T 細胞成熟分化的場所，PI3K 信號可通過激活PKB、Rac 等信號途徑而參與T細胞的活化、分化[16]，PI3K 的激活主要依賴于p110 的活性，但p85 對p110 有抑制作用[17]，pik3r1表達量低，則p85對p110的抑制作用降低，有利于p110參與PI3K的激活，從而激活PKB、Rac 等信號途徑而參與T細胞的活化、分化。本研究中，On-pik3r1在羅非魚胸腺表達量低，表明pik3r1參與羅非魚T細胞的活化、分化，在羅非魚免疫調(diào)節(jié)中有重要作用。

經(jīng)滅活無乳鏈球菌刺激后，On-pik3r1的表達量在鰓、腸道、脾臟、頭腎、腦部等5 個組織中均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)，在胸腺中4 h 時極顯著下調(diào)，24、48、72 h 時為顯著下調(diào)，這可能與pik3r1的調(diào)控模式有關：pik3r1表達的下調(diào)激活了PI3K 信號通路，使炎癥的發(fā)生成為可能[18-19]，pik3r1可能對炎癥的發(fā)生發(fā)揮抑制作用。已在患有肝細胞癌的小鼠中驗證pik3r1的這種調(diào)控模式[20]，但在其他動物上并未得到證實。無乳鏈球菌在體內(nèi)大量繁殖時會引起急性炎癥反應。無乳鏈球菌侵染魚體時，最先是巨噬細胞首先對無乳鏈球菌吞噬作用，但當無乳鏈球菌繁殖速度比巨噬細胞吞噬速度快得多時，巨噬細胞中pik3r1的下調(diào)會損傷應答脂多糖（LPS）的NO和白介素（IL-12）的產(chǎn)生，使胞內(nèi)易受細菌感染[21]，巨噬細胞會攜帶著無乳鏈球菌突破血腦屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[22]，病原菌因而可逃避魚體免疫系統(tǒng)的清除作用，使鏈球菌更易擴散至其他器官和組織，引起多器官功能障礙和細菌性敗血癥，最后導致魚體死亡。因此，pik3r1的下調(diào)表達可能可作為魚體發(fā)生無乳鏈球菌病的有效征兆，通過進一步研究，pik3r1可能會給無乳鏈球菌病的治療提供新靶點。