陳 爽，梁 健，張榮慶,2,3

（1.蛋白質(zhì)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084；2.浙江省應(yīng)用酶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 嘉興 314006；3.嘉興大學(xué)生物化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 嘉興 314006）

合浦珠母貝（Pinctada fucata）隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)（Mollusca），瓣鰓綱（Bivalvia），珍珠貝目（Pterioida），珠母貝屬（Pinctada），主要分布于日本沿海和我國(guó)南海，是生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類(lèi)。海水珍珠養(yǎng)殖為我國(guó)一項(xiàng)重要產(chǎn)業(yè)，但在珍珠培育過(guò)程中，珍珠貝高密度、集約化、工廠化養(yǎng)殖已出現(xiàn)多種疫病防治難題[1-2]。為提高合浦珠母貝產(chǎn)珠質(zhì)量和產(chǎn)量，迫切需要對(duì)貝類(lèi)天然免疫中應(yīng)答過(guò)程機(jī)理開(kāi)展深入研究。

絲氨酸蛋白酶家族是一類(lèi)重要的蛋白水解酶，廣泛參與調(diào)整機(jī)體消化、受精、胚胎發(fā)育、血液凝結(jié)、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞免疫和體液免疫等生理和病理過(guò)程[3-5]。絲氨酸蛋白酶抑制因子（Serine protease inhibitor，SPI）是對(duì)絲氨酸蛋白酶家族有抑制活性的一類(lèi)蛋白質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物體，一般通過(guò)與蛋白酶相互結(jié)合，形成穩(wěn)定復(fù)合體來(lái)抑制絲氨酸蛋白酶活性[6]。無(wú)脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，天然免疫應(yīng)答是主要免疫系統(tǒng)[7]。在天然免疫過(guò)程中，絲氨酸蛋白酶及其抑制因子起重要作用，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、級(jí)聯(lián)放大、特異性免疫防御機(jī)制激活、抗菌肽合成等[8]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，SPI分為Serpin、Pacifastin、Kunitz、Kazal 和α2-巨球蛋白等74 個(gè)家族[9]。Serpin 家族的絲氨酸蛋白酶抑制因子有較為保守的抑制結(jié)構(gòu)域，即C 端反應(yīng)中心環(huán)（Reactive center loop,RCL），此結(jié)構(gòu)域可與絲氨酸蛋白酶形成serpin-蛋白酶復(fù)合體，導(dǎo)致蛋白酶失活[10]。20 世紀(jì)90 年代末，從果蠅、瘧蚊等無(wú)脊椎動(dòng)物中先后分離和鑒定出多種參與免疫反應(yīng)的SPI，并在血細(xì)胞等免疫器官中檢測(cè)到表達(dá)，驗(yàn)證了其參與免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活的過(guò)程[11]。近年來(lái)，一些貝類(lèi)中也發(fā)現(xiàn)了絲氨酸蛋白酶抑制因子，如太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、東方牡蠣（Crassostrea virginica）等，其在貝類(lèi)天然免疫中的作用已得到初步驗(yàn)證[12-14]。但迄今未在合浦珠母貝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這類(lèi)絲氨酸蛋白酶抑制因子。

近年來(lái)在骨免疫學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，成骨與免疫之間有重要的調(diào)節(jié)關(guān)系[15]。在貝類(lèi)中，貝殼和珍珠的生長(zhǎng)與哺乳動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)機(jī)制類(lèi)似，均為重要的生物礦化過(guò)程。在自然環(huán)境中，貝殼在外源砂礫入侵體內(nèi)環(huán)境時(shí)會(huì)通過(guò)天然免疫和生物礦化形成珍珠，但生物礦化與天然免疫之間的關(guān)系尚未闡明。雖已證明在天然免疫中發(fā)揮重要作用的賴氨酸基質(zhì)蛋白在合浦珠母貝天然免疫過(guò)程中表達(dá)量升高[16]，但關(guān)于在天然免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用的SPI 是否會(huì)參與生物礦化過(guò)程仍需進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)RACE技術(shù)在合浦珠母貝中克隆得一個(gè)Serpin 家族基因（命名為pfser1）的全長(zhǎng)序列，檢測(cè)該基因在合浦珠母貝不同組織中的表達(dá)，以及在貝體感染大腸桿菌（Escherichia coli）MG1655后的表達(dá)變化，并通過(guò)合浦珠母貝貝殼損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，研究該基因在合浦珠母貝天然免疫中的作用，探究該基因與生物礦化間的關(guān)系，為探索合浦珠母貝天然免疫與生物礦化之間的關(guān)系，研究合浦珠母貝天然免疫機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用合浦珠母貝購(gòu)自廣東省湛江市海濱養(yǎng)殖場(chǎng)，空運(yùn)至北京。在實(shí)驗(yàn)室水族箱中用人工海水（速得牌海水素，鹽度30）暫養(yǎng)1 周后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、活力較強(qiáng)的貝進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

大腸桿菌MG1655，取自清華大學(xué)海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，將菌種接種至LB 培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)10～ 12 h。將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，以3 000g、4 ℃條件離心10 min。用4 ℃下預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）重懸菌體，再次離心。重復(fù)兩次后，用PBS 重懸，稀釋至OD600值為1（1×108～ 2×108CFU/mL）后，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 合浦珠母貝總RNA 提取 取狀態(tài)良好的合浦珠母貝3 只，剖取外套膜組織，用TRIzol 法提取其總RNA，用Nanodrop 2000TM（ThermoFisher，美國(guó)）檢測(cè)RNA 濃度與質(zhì)量。

1.2.2 RACE 實(shí)驗(yàn)克隆基因全長(zhǎng) 通過(guò)對(duì)合浦珠母貝外套膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到1 個(gè)有絲氨酸蛋白酶抑制因子同源序列的基因片段。使用SMARTerTMRACE cDNA Amplification kit (TAKARA) 對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到RACE 實(shí)驗(yàn)?zāi)０?。根?jù)基因片段序列信息設(shè)計(jì)RACE 實(shí)驗(yàn)5′ 引物和3′ 引物，隨后分別進(jìn)行5′-RACE 和3′-RACE，將得到的結(jié)果拼接。最后，用驗(yàn)證引物cSer1F、cSer1R 對(duì)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，獲得pfser1的全長(zhǎng)基因序列。本實(shí)驗(yàn)使用的引物見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences used in the cloning and Realtime PCR

1.2.3 生物信息學(xué)分析 基因序列的比對(duì)，同源性分析在NCBI 網(wǎng)站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上 進(jìn) 行；利 用 ExPASy (http://web.expasy.org/protparam/) 在線分析理化性質(zhì)；通過(guò)SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用SMART (Small Modular Architecture Research Tool,http://smart.embl-heidelberg.de/) 在線分析結(jié)構(gòu)域；利用MEGA5.2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 組織分布檢測(cè) 取合浦珠母貝的足、外套膜中央膜、鰓、閉殼肌、生殖腺、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜邊緣膜、血液8 個(gè)組織分別提取RNA，檢測(cè)8 種組織中pfser1基因的相對(duì)表達(dá)量。具體操：提取RNA，使用SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit (TAKARA)對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用ABI 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (StepOnePlusTM，Life Technologies) 進(jìn)行檢測(cè)。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因[17]，用2-ΔΔCt法[18]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中使用的引物見(jiàn)表 1(GAPDH-F,GAPDH-R,qSer1F,qSer1R)。

1.2.5 細(xì)菌吞噬實(shí)驗(yàn) 取24 只合浦珠母貝分成兩組，分別向閉殼肌和外套膜間液中注射100 μL 大腸桿菌MG1655 菌液。在0、3、6、9 h 時(shí)分別從兩組中各取合浦珠母貝3 只，取其外套膜邊緣膜，提取RNA，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)pfser1基因的相對(duì)表達(dá)量。具體步驟同1.2.4。

1.2.6 貝殼損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn) 取24 只生長(zhǎng)狀況良好、大小相近的珍珠貝，分成8 組，每組3 只。在其邊緣剪一深約3 cm、破壞貝殼珍珠層的缺口，放回人工海水中培養(yǎng)。在0、6、12、24、36、48、72、96 h 后收集合浦珠母貝外套邊膜樣品，提取RNA，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)pfser1基因的相對(duì)表達(dá)量。具體步驟同1.2.4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，使用t-test 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的顯著性，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 合浦珠母貝pfser1 基因的 cDNA 的序列分析

通過(guò)RACE 技術(shù)獲得pfser1基因全長(zhǎng)序列（圖1），該基因全長(zhǎng)為1 240 bp，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)73 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)132 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度1 035 bp，編碼344 個(gè)氨基酸。在線預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，pfser1基因編碼的蛋白理論分子質(zhì)量為38.5 ku，理論等電點(diǎn)5.52，1～ 322 位氨基酸屬于SERPIN 結(jié)構(gòu)域，且在pfser1末端有一個(gè)保守的反應(yīng)中心環(huán)（reactive center loop，RCL），故確定pfser1是Serpin 型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員（圖2）。信號(hào)肽分析未顯示pfser1 蛋白有信號(hào)肽序列。進(jìn)化樹(shù)分析顯示該基因與牡蠣中蛋白酶抑制因子(leukocyte elastase inhibitor)相似性較高（圖 3）。

2.2 pfser1 基因在不同組織中的表達(dá)分布

足、外套膜中央膜、鰓、閉殼肌、生殖腺、內(nèi)臟團(tuán)、外套膜邊緣膜和血液中pfser1基因表達(dá)情況見(jiàn)圖4。圖4 顯示，pfser1在外套膜邊緣膜表達(dá)量最高，大約是足中表達(dá)量的4 倍；鰓組織次之，約為足中表達(dá)量的2 倍；在血細(xì)胞中表達(dá)量最少，約為足中pfser1基因表達(dá)量的1/20。

圖1 pfser1 基因的核酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acids sequences of pfser1 gene from Pinctada fucata

圖2 SMART 軟件預(yù)測(cè)的pfser1 蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域Fig.2 Structure of pfser1 protein analyzed by SMART

圖3 N-J 法構(gòu)建pfser1 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of pfser1 by neighbour-joining method

2.3 細(xì)菌吞噬實(shí)驗(yàn)

向合浦珠母貝外套膜間液中注射大腸桿菌MG1655 后，外套膜邊緣膜中的pfser1基因表達(dá)量急劇升高，在3 h 達(dá)到最高，約為對(duì)照組的58 倍，之后逐漸降低，在6 h 時(shí)是對(duì)照組的17 倍，到9 h時(shí)是對(duì)照組的3 倍（圖5）。向合浦珠母貝閉殼肌中注射大腸桿菌MG1655 后，外套膜邊緣膜中pfser1基因表達(dá)量逐漸升高，在3 h 時(shí)是對(duì)照組的18 倍，在6 h 附近達(dá)到峰值（約是對(duì)照組的32 倍），而后迅速降低，在9 h 已降至對(duì)照組的4 倍左右（圖5）。

圖5 外套膜間液和閉殼肌感染MG1655 后pfser1 基因表達(dá)量變化Fig.5 Expression of pfser1 after adductor and muscle injected by MG1655

2.4 貝殼修復(fù)過(guò)程中pfser1 基因的表達(dá)變化

將合浦珠母貝貝殼進(jìn)行損傷處理后，會(huì)刺激合浦珠母貝進(jìn)行生物礦化以修復(fù)貝殼。在貝殼損傷修補(bǔ)的過(guò)程中，pfser1基因表達(dá)量先上升，后下降至正常水平以下。在貝殼損傷約6 h 時(shí)，pfser1基因表達(dá)量達(dá)最大值，是正常水平的2 倍，在12 h 以后，pfser1基因的表達(dá)量均相較貝殼結(jié)構(gòu)未損傷時(shí)更低，在48 h 檢測(cè)到pfser1表達(dá)的最低值，約是正常水平的0.2%（圖6）。

圖6 pfser1 基因在貝殼損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)量變化Fig.6 Expression of pfser1 in the shell notching test

3 討論

據(jù)估計(jì)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白酶抑制因子占血漿蛋白總量的10%，其中絲氨酸蛋白酶抑制因子的Serpin 家族占有很大比例[19]。當(dāng)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物受到微生物感染后，其體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶可快速激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫效應(yīng)，殺滅入侵的病原菌。通常這個(gè)反應(yīng)過(guò)程受絲氨酸蛋白酶抑制因子Serpin 家族的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，Serpin可參與無(wú)脊椎動(dòng)物很多重要生理過(guò)程，如鱟（Tachypleus tridentatus）的血淋巴凝集反應(yīng)和節(jié)肢動(dòng)物的天然免疫反應(yīng)[20-21]。當(dāng)機(jī)體損傷或者受到病原微生物感染時(shí)，一些甲殼動(dòng)物和昆蟲(chóng)體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶可通過(guò)激活聯(lián)級(jí)反應(yīng)過(guò)程和酚氧化酶途徑對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。

在細(xì)菌吞噬實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌MG1655 被注射到合浦珠母貝體內(nèi)后，其濃度持續(xù)降低，一段時(shí)間后被徹底清除，說(shuō)明MG1655 會(huì)引發(fā)合浦珠母貝的天然免疫反應(yīng)[22]。在本研究中，大腸桿菌MG1655感染合浦珠母貝后，pfser1基因在外套膜邊緣膜中被誘導(dǎo)表達(dá)，表明其參與了合浦珠母貝的天然免疫過(guò)程。在哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物的研究中，天然免疫系統(tǒng)啟動(dòng)后，體內(nèi)一些通路產(chǎn)生激活反應(yīng)，并產(chǎn)生一些效應(yīng)分子。而機(jī)體內(nèi)蛋白酶的釋放必須精確控制，所產(chǎn)生的過(guò)多蛋白酶對(duì)機(jī)體自身造成損害，這時(shí)需絲氨酸蛋白酶抑制因子來(lái)調(diào)控，確保蛋白酶維持正常水平[23-25]。Serpin 型蛋白多以自殺性底物的方式參與到蛋白酶的調(diào)解反應(yīng)中，并以一種不可逆方式抑制特定的靶蛋白[26]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的pfser1基因的表達(dá)特征，判斷在合浦珠母貝受到大腸桿菌MG1655 刺激后可迅速開(kāi)啟天然免疫過(guò)程，在3 h內(nèi)啟動(dòng)天然免疫的聯(lián)級(jí)反應(yīng)。隨后絲氨酸蛋白酶抑制因子會(huì)得到大量表達(dá)，以調(diào)控體內(nèi)天然免疫的精細(xì)過(guò)程，避免自身機(jī)體受到傷害。在6 h 及之后，絲氨酸蛋白酶抑制因子基因表達(dá)量降低，但相對(duì)0 h的對(duì)照組仍有較高表達(dá)量，這表明合浦珠母貝體內(nèi)在天然免疫過(guò)程啟動(dòng)后，較長(zhǎng)時(shí)間都會(huì)提高pfser1基因的表達(dá)量，可能結(jié)合降低體內(nèi)因抗菌產(chǎn)生的蛋白酶。外套膜間液位于珠母貝貝殼和外套膜之間，在貝殼形成中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)間液蛋白在珠母貝貝殼形成及珍珠層與棱柱層的相互轉(zhuǎn)化中起著關(guān)鍵作用，且在體外對(duì)CaCO3的成核及沉積起雙重作用[26]。本研究中，在間液受到大腸桿菌MG1655刺激后，外套膜邊緣膜分泌的絲氨酸蛋白酶抑制因子的表達(dá)變化，較閉殼肌受到大腸桿菌MG1655 刺激下，反應(yīng)更為強(qiáng)烈，對(duì)細(xì)菌的刺激有更快的響應(yīng)機(jī)制。

軟體動(dòng)物在貝殼損傷后有自我修復(fù)能力。貝殼受到損傷后，軟體動(dòng)物可啟動(dòng)一些途徑，實(shí)現(xiàn)貝殼的再生過(guò)程，這個(gè)過(guò)程和貝殼的形成過(guò)程類(lèi)似，在有機(jī)基質(zhì)的指導(dǎo)下，碳酸鈣晶體可在損傷的部位有序沉淀，形成新的貝殼[28]。本研究中，檢測(cè)到合浦珠母貝絲氨酸蛋白酶抑制因子基因在貝殼損傷修復(fù)過(guò)程中表達(dá)發(fā)生了變化，表達(dá)量先高后低。相較于細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)，pfser1基因表達(dá)雖檢測(cè)到升高，但升高幅度小得多。在48～ 96 h 實(shí)驗(yàn)組內(nèi)，pfser1的表達(dá)量持續(xù)低于對(duì)照組，且在48 h 組出現(xiàn)最低值，約是正常表達(dá)量的0.2%。結(jié)合絲氨酸蛋白酶抑制因子的功能特征推測(cè)，這可能是合浦珠母貝生物礦化過(guò)程中，前期需要抑制特定的蛋白酶，而在后期（尤其在48 h 左右）需要分泌過(guò)量的特定蛋白酶時(shí)參與生物礦化過(guò)程，因此48 h 組絲氨酸蛋白酶抑制因子基因的表達(dá)顯著降低?；谶@些結(jié)果，認(rèn)為絲氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因也參與了合浦珠母貝的生物礦化相關(guān)的調(diào)節(jié)過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究克隆得合浦珠母貝絲氨酸蛋白酶抑制因子pfser1基因，研究其序列表達(dá)特征，以及其在細(xì)菌吞噬實(shí)驗(yàn)和貝殼損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，其參與了合浦珠母貝天然免疫過(guò)程，并與生物礦化過(guò)程有一定聯(lián)系。本研究為探索合浦珠母貝天然免疫機(jī)理，以及天然免疫與生物礦化之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。