黃 丹，楊濱夢(mèng)，段玉敏

(1.沈陽(yáng)師范大學(xué) 糧食學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)前與初等教育學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

胃癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)胃癌發(fā)病率僅次于肺癌，位居第2位。而我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率和死亡率均居第2位，高于世界平均水平，高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是其主要死因[1 ]。中醫(yī)藥防治惡性腫瘤方面，近年來(lái)顯示出一定優(yōu)勢(shì)，并越來(lái)越受到關(guān)注。青龍衣具有多種抗癌活性，作為一種抗癌中藥，對(duì)于肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、白血病、乳腺癌、宮頸癌等多種癌癥具有抗癌作用，在改善病人生存質(zhì)量，增加病人生存期方面效果顯著[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察青龍衣有效組分對(duì)人胃腺癌細(xì)胞BGC-823裸鼠原位移植瘤生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)環(huán)氧合酶-2(COX-2)和前列腺素-2(PGE-2)表達(dá)的影響，探究其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)BALC/c雄性裸鼠20只，鼠齡6～8周，體重18～20 g，均為雄性，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)SCXK(京)2017-0013。每組5只，小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水，定時(shí)清理鼠籠。

1.2 藥物和細(xì)胞株

青龍衣有效組分由沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。消癌平，南京中科藥業(yè)有限公司，批號(hào)Z20070017。人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.3 主要試劑與儀器

1640培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物制品有限公司；胰酶，賽默飛世爾生物制品有限公司；兔抗鼠COX-2單克隆抗體，Cell Signaling Technology公司；免疫組化試劑盒PV9000、DAB顯色劑，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PGE-2 ELisa試劑盒，上海源葉有限公司；脫水機(jī)，Hestion有限公司；Image Scanner，美國(guó) Bio-Rad公司。

1.4 小鼠胃癌模型制備

1.4.1 小鼠胃癌原位移植瘤(供瘤體) 人胃癌細(xì)胞株BGC-823，細(xì)胞均成功培養(yǎng)及細(xì)胞傳代，達(dá)到實(shí)驗(yàn)用量，經(jīng)胰酶消化后，臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生理鹽水調(diào)整為5.4×107個(gè)/mL細(xì)胞密度的單細(xì)胞懸液。用75%的乙醇棉球?qū)⑿∈蟮南赂共肯荆? mL的注射器對(duì)小鼠的下腹部腹腔注射0.3 mL的細(xì)胞懸液。觀察小鼠的腹水情況，當(dāng)小鼠腹部隆起后，抽取腹腔內(nèi)淡黃色細(xì)胞懸液。用75%的乙醇棉球?qū)⒓?xì)胞懸液接種于小鼠腋部皮下形成皮丘，當(dāng)皮下移植瘤長(zhǎng)至大約1 cm時(shí)剝?nèi)∫浦擦?，為?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牧鲈础?/p>

1.4.2 小鼠胃癌原位移植瘤模型 在無(wú)菌的環(huán)境下，從小鼠腋下取瘤組織，磨成勻漿備用。實(shí)驗(yàn)小鼠用7%的水合氯醛0.075 mL/10 g麻醉，常規(guī)手術(shù)，在胃大彎竇處用1 mL注射器將瘤組織勻漿0.3 mL緩慢注射入胃壁漿膜層，縫合腹膜及皮膚，關(guān)腹。20只小鼠均按照此方法造模，成功并存活。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方案

將原位胃癌移植裸鼠隨機(jī)分為模型組、消癌平組和青龍衣高、低劑量組，每組5只。消癌平陽(yáng)性對(duì)照組，灌胃給予消癌平和生理鹽水的混合液體，給藥劑量為0.234 g/kg，青龍衣有效組分低、高劑量給藥組，接種一周后給藥，灌胃給予青龍衣有效部分渾濁液(蒸餾水混合)，給藥量為0.75、0.375 g/kg灌胃，模型組用等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為0.2 mL/10 g，1次/d，連續(xù) 15 d。停藥當(dāng)日，摘取眼球血，保留血清，處死裸鼠，取瘤體用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.6 標(biāo)本收集

2周后，將所有組的鼠禁食不禁水24 h，取眼球血，脫頸處死裸鼠，分別取每只小鼠的胃部瘤組織，10%的福爾馬林固定過(guò)夜，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。

1.7裸鼠病理觀察

將“1.”6中的石蠟切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察。

1.8免疫組化檢測(cè)cox-2的表達(dá)

將石蠟切片置于60 ℃的烘箱烘干過(guò)夜，脫蠟水化，微波修復(fù)抗原，PBS沖洗3次×2 min，分別加入3%過(guò)氧化物酶16 min，PBS沖洗3次×2 min，胎牛血清工作液20 min孵育，滴加COX-2一抗(1∶800濕盒)4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次× 5 min，分別加入生物素標(biāo)記兔抗鼠及辣根酶標(biāo)記鏈酶工作液后，再次PBS沖洗3次×5 min，滴加 DAB顯色試劑，鏡下觀察 3～5 min，以胞質(zhì)出現(xiàn)黃色、棕黃色或褐色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，蘇木精復(fù)染 1 min，0.1%鹽酸酒精分化30 s，自來(lái)水沖洗至返回藍(lán)色，梯度乙醇脫水干燥，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察，拍照記錄，對(duì)照組用 PBS代替一抗陽(yáng)性判定。

組織圖像使用Image-Pro PLUS 6.9軟件學(xué)分析。每個(gè)分組取兩張組織切片進(jìn)行檢測(cè)，選擇陽(yáng)性顯色點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)40倍視野下切片的平均顯色點(diǎn)面積(area)、平均光密度(density)和累計(jì)光密度值(integreted optical density，IOD)。

1.9 ELISA法檢測(cè)PGE-2細(xì)胞因子水平

取“1.4”項(xiàng)下各組裸鼠的血液樣品，3 000 r·min-1，4 ℃，離心15 min，取上清液得到血清樣品，參照PGE-2的酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行具體操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)每組裸鼠血清中的PGE-2細(xì)胞因子水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 裸鼠病理情況

由圖1可知，模型組癌細(xì)胞間可見(jiàn)大量的毛細(xì)血管，血液供應(yīng)豐富，癌細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，增值速度快。各給藥組癌細(xì)胞明顯減少，增值速度緩慢，毛細(xì)血管數(shù)量明顯少于模型組。

圖1各組模型小鼠腫瘤組織病理形態(tài)(HE染色×40)

2.2 青龍衣有效組分對(duì)裸鼠胃癌細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與模型組比較，青龍衣高、低劑量組和消癌平組COX-2表達(dá)水平明顯降低，且青龍衣高劑量組優(yōu)于青龍衣低劑量組。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2青龍衣有效組分對(duì)人胃腺癌BGC-823裸鼠瘤組織中COX-2蛋白含量影響

注：A：模型組；B：青龍衣高劑量組；C：青龍衣低劑量組；D：消癌平組。密度(均值)用于檢測(cè)平均灰度等級(jí)；IOD(總和)用于檢測(cè)累積的光學(xué)密度切片。*P<0.05

圖3COX-2表達(dá)分析結(jié)果

2.3 對(duì)瘤裸鼠血清中PGE-2的影響

由表1可知，與模型組相比，青龍衣有效組分給藥組荷瘤裸鼠血清中PGE-2含量明顯降低(P<0.5)，且隨著藥物濃度的增加，呈劑量依賴關(guān)系。PGE-2作為COX-2的催化產(chǎn)物，與COX-2表達(dá)水平及活性密切相關(guān)，通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體作用，與COX-2共同作用參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤血管生成、抑制抗腫瘤免疫等機(jī)制調(diào)控多種腫瘤發(fā)生、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等。

表1 對(duì)胃癌裸鼠血清中PGE-2含量影響

組別PGE-2模型組290.69±22.94青高劑組257.56±20.94*青低劑組246.5925±9.8*消癌平組267.84±20.11

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜病理過(guò)程，是多因素、多步驟、多基因共同決定的。傳統(tǒng)的治療方法(手術(shù)及放化療)在胃癌的早期，治療會(huì)取得比較滿意的療效，但對(duì)于胃癌晚期并伴有局部轉(zhuǎn)移者，治療結(jié)果往往難以取得滿意。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性，也是腫瘤患者死亡的主要原因，胃癌也是如此。對(duì)于晚期胃癌患者尋找可以抗轉(zhuǎn)移的藥物是一個(gè)新趨勢(shì)[3]。近年來(lái)，諸多研究者致力于深層次探討中藥抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，從中尋找新型抗腫瘤藥物[4]。本實(shí)驗(yàn)選擇的青龍衣為胡桃科植物核桃楸(JugandmandshuricaMaxim.)和胡桃(JuglansregiaL.)的未成熟果實(shí)的外果皮，秋季采收，及時(shí)曬干而得。在《開(kāi)寶本草》及《本草綱目》中均有記載，其味辛、苦，性澀、平，中醫(yī)多以其清熱解毒、祛風(fēng)療癬、止痛止痢功效入藥，為我國(guó)十分重要的藥源植物，具有重要藥用價(jià)值[5]。在國(guó)內(nèi)，由于民間將青龍衣用于治療消化系統(tǒng)癌癥的驗(yàn)方而受到廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注，因此，對(duì)青龍衣更多開(kāi)展的是抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)、體內(nèi)外抗腫瘤作用及作用機(jī)理的深入研究[6]。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞懸液植入法成功建立人胃癌BGC-823裸鼠原位移植腫瘤模型，分組給予藥物，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出青龍衣組的COX-2和PGE-2含量均得到抑制，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示對(duì)胃癌組織的侵襲轉(zhuǎn)移有抑制作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量研究表明，COX-2的顯著表達(dá)與胃腸道的腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。COX-2作為炎性調(diào)節(jié)因子，是炎癥組織中催化花生四烯酸合成前列腺素(Prostaglandin，PG)的限速酶之一，在正常組織中一般不表達(dá)，在各種因素如癌蛋白、炎性刺激、細(xì)胞因子等的作用下，COX-2的表達(dá)顯著上調(diào)。前列腺素 E2(Prostaglandin E2)是 COX-2的下游產(chǎn)物，介導(dǎo)人體中炎癥、發(fā)熱及疼痛等病理過(guò)程，能夠通過(guò)促進(jìn)血管形成、細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞的免疫功能和凋亡，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化測(cè)定各組瘤體中的COX-2的表達(dá)和ELISA法測(cè)定血清中PGE-2的含量，發(fā)現(xiàn)青龍衣組瘤體中COX-2的表達(dá)和血清中PGE-2的含量均下降。由此，筆者認(rèn)為青龍衣有效組分可以抑制荷瘤裸鼠原位移植瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。探究其作用機(jī)制，可能為通過(guò)下調(diào)移植瘤瘤灶中COX-2和PGE-2的表達(dá)而抑制瘤體的轉(zhuǎn)移侵襲。