龔 鑫，石緒根，孫曉棠，鄭興汶，楊良波，崔汝強(qiáng)*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌330045；2.江西省廣昌縣白蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，江西 廣昌344900）

近年來蓮腐敗病的發(fā)生面積快速增加，尤其是長時間的連作導(dǎo)致土傳病原真菌逐漸積累，蓮腐敗病發(fā)生日益嚴(yán)重[1]。目前該病害很難通過農(nóng)事操作及化學(xué)防治達(dá)到有效控制，已經(jīng)成為蓮生產(chǎn)中的一種重要制約因素。在江西，白蓮主產(chǎn)區(qū)每年約有30%～70%的蓮田發(fā)生蓮腐敗病，其中有10%～15%的蓮田發(fā)病嚴(yán)重，甚至顆粒無收[2-3]。實驗室通過分離病原物和體外接種實驗證實，江西省廣昌縣蓮腐敗病的病原菌為尖孢鐮刀菌蓮?；停‵usarium oxysporumf.sp.nelumbicola）[2]。發(fā)病初期，蓮葉從葉緣處開始出現(xiàn)褐色病斑后逐漸向內(nèi)擴(kuò)展，后期葉片枯萎死亡，甚至整株枯死。

植物細(xì)胞壁是抵御病原菌侵入的主要屏障。病原菌通過分泌一系列的細(xì)胞壁降解酶降解寄主細(xì)胞壁，突破屏障入侵寄主植物[4]。在細(xì)菌、真菌和植物中廣泛存在的多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，通過降解植物細(xì)胞壁中的同源多聚半乳糖醛酸，引起植物組織浸解進(jìn)而導(dǎo)致原生質(zhì)體死亡[5]，在病原菌侵染寄主引起病害過程中起著關(guān)鍵作用[6-7]。本實驗室證實蓮腐敗病菌在侵染致病過程中能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶，其中PG活性最高，且強(qiáng)致病性菌株的PG活性顯著高于弱致病性菌株[3]，說明菌株致病力與PG酶活性密切相關(guān)，PG是重要的致病因子。本研究克隆了蓮腐敗病菌PG基因，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體以期進(jìn)一步分析PG基因的功能，探討該基因在病原菌浸染過程中的作用機(jī)理，為蓮腐敗病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蓮腐敗病菌（F.oxysporumf.sp.nelumbicola）為本實驗室分離鑒定并保存的菌種。挑取蓮腐敗病菌菌株于PSA 平板上28 ℃培養(yǎng)5～6 d 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA 提取與cDNA 第一鏈合成

利用GeneMark RNA提取試劑盒提取蓮腐敗病菌總RNA。根據(jù)TAKARA RNA PCR Kit合成cDNA[8]。

1.3 pg1 基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，pg1F和pg1R為引物擴(kuò)增目的基因pg1，目的基因PCR產(chǎn)物連接至載體pMD18-T后，送上海祥音科技公司測序[9]。

1.4 蓮腐敗病菌pg1基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)分析

1.4.1 載體構(gòu)建以獲得的全長陽性克隆質(zhì)粒為模板，用Not I及Xho I內(nèi)切酶雙酶切pPICZαA空載體和質(zhì)粒37 ℃過夜。用T4連接酶16 ℃過夜連接獲得目的基因和空載體片段，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，于37 ℃培養(yǎng)12 h，挑單克隆進(jìn)行PCR檢測，檢測為陽性的克隆送上海祥音科技公司測序[10]。

1.4.2 酵母轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定根據(jù)分子克隆中酵母菌的感受態(tài)細(xì)胞制備方法制備畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，并將重組載體pPICZαA-pg1通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，于30 ℃環(huán)境下靜置培養(yǎng)24 h，利用篩選培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，PCR方法檢測篩選陽性克隆，并送上海祥音生物技術(shù)有限公司測序鑒定[11]。

1.4.3 酵母誘導(dǎo)表達(dá)鑒定取經(jīng)PCR鑒定為陽性克隆的轉(zhuǎn)化子接種在BMGY培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)至OD值為2.6，離心棄上清液。沉淀加BMMY培養(yǎng)液重懸細(xì)胞振蕩培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)充甲醇連續(xù)誘導(dǎo)3 d，每24 h取菌液用于10%SDS-PAGE分析[11]。

1.5 重組蛋白Western blot

Western blot 方法參照文獻(xiàn)[11]提供的方法，采用BIO-RID 半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，采用Abcam 公司直標(biāo)抗體Anti-c-Myc（HRP）進(jìn)行標(biāo)記。

1.6 生物信息學(xué)分析

用BioXM 軟件(Ver.2.6) 預(yù)測LbMYB1 蛋白分子量和等電點(diǎn)，用Clustalx(Ver.1.83) 和BioEdit 軟件(Ver.7.1.3) 進(jìn)行多序列比對，用MEGA4.0.2 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取結(jié)果

利用GeneMark RNA提取試劑盒提取蓮腐敗病菌總RNA，電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2 pg1基因的擴(kuò)增

從GeneBank的鐮刀菌數(shù)據(jù)庫中下載pg1基因序列，利用Clustalx軟件進(jìn)行多序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)該基因在起始密碼子和終止密碼子位置附近具有較高的同源性，故在包含起始密碼子和終止密碼子的位置設(shè)計了pg1特異性全長引物并加入Not I及Xho I的酶切位點(diǎn)。

pg1F：5′-ctcgagaaaagaATGTTCTCTTCAACTGTCCTTCTC-3′，

pg1R：5′-gcggccgcGCAAGAGGCACCAGAGGG-3′

圖1 RNA 電泳

以cDNA 為模版，利用引物pg1F/pg1R 在不同退火溫度條件下擴(kuò)增pg1，在電泳圖譜上得到一條大小約為1 100 bp 的目的條帶，符合預(yù)期片段大小（圖2）。將目的基因cDNA 全長連接到克隆載體pEASY-Blunt Simple 上，對陽性克隆載體進(jìn)行挑斑鑒定。陽性克隆測序結(jié)果表明，pg1 基因包含完整的開放閱讀框1 113 bp，推測編碼了371 個氨基酸（GenBank No.MF563874）。預(yù)測的信號肽序列為MVRNIAALLPAAFAS。編碼的氨基酸序列分子量大小38 451.7 ku，理論等電點(diǎn)6.36，有27個帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu），25 個帶正電荷的殘基（Arg+Lys）。分子式為C1668H2635N465O554S12，含有原子總數(shù)5 334 個。脂肪系數(shù)為78.54，疏水平均值為-0.165。不穩(wěn)定系數(shù)為21.19，推測該蛋白為穩(wěn)定的蛋白。

2.3 PG同工酶基因的系譜分析

從GeneBank 上下載目前已克隆的尖孢鐮刀菌PG同工酶基因序列，利用Clustalx 和BioEdit 軟件進(jìn)行多序列比對，利用MEGA4.0.2 軟件構(gòu)建本實驗獲得的蓮腐敗病菌尖孢鐮刀菌蓮?；图捌渌怄哏牭毒腜G 同工酶基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示pg1 與尖孢鐮刀菌內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因的親緣關(guān)系較近，具有Glyco-hydro-28 家族的保守區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn)，如圖3所示。

圖2 不同退火溫度條件下pg1 的擴(kuò)增結(jié)果

圖3 PG同工酶基因的氨基酸比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4 轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot分析

將陽性克隆先后接種在BMGY 和BMMY 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后加甲醇誘導(dǎo)3 d。利用SDS-PAGE 和Western blot 鑒定。結(jié)果表明，pPICZαA-pg1 目的蛋白約為38 ku，與預(yù)測蛋白分子量大小相當(dāng)（圖4）。

圖4 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的Western blot 分析

3 結(jié)論與討論

研究表明，多數(shù)真菌的PG是由多基因編碼[13]。根據(jù)降解半乳糖醛酸的方式不同，可分為內(nèi)切型（endoPG）和外切型（exoPG）兩種。endoPG能降解細(xì)胞組織引起細(xì)胞死亡[14]，而且產(chǎn)生的寡聚半乳糖醛酸是激發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)的激發(fā)子[15]。exoPG能降解由endoPG產(chǎn)生的激發(fā)子物質(zhì)，并轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌?xì)胞壁降解酶的誘導(dǎo)劑[16]。序列分析發(fā)現(xiàn)真菌PG有11 個完全保守的芳香族的氨基酸殘基，endoPG和exoPG還有各自特異保守片段和殘基。這種結(jié)構(gòu)上的高度保守性，為更多地克隆和研究植物病原真菌PG基因的功能提供了途徑[17]。

目前已從不同屬的病原真菌中克隆了多個endoPG基因。氯氮卓青霉菌（Penicillium solitum）的PG在病原菌侵染寄主的前期起著重要作用[18]，辣椒疫霉（P.capsici）PG體外重組蛋白能侵染辣椒表現(xiàn)癥狀[19]；鏈格孢菌（Alternaria citr）endoPG突變降低了對柑橘和馬鈴薯的致病力[20]，灰葡萄孢Bcpg1 的缺失導(dǎo)致其在不同寄主上的致病力下降[21]、麥角菌（Claviceps purpurea）endoPG 失活，對黑麥幾乎喪失了致病力[22]。侵染柑橘果實的鏈格孢菌（A.alternata）[23]、侵染美洲栗的球叢赤殼菌(Cryphonectria parasitica)[23]、侵染玉米的旋孢腔菌（Cochliobolus carbonum）[24]的PG基因敲除或失活，對病原菌致病性沒有影響。目前已從尖孢鐮刀菌甜瓜轉(zhuǎn)化型F.oxysporumf.sp.melonis中克隆了pg1 基因[25]，從番茄?；虵.oxysporum.f.sp.lycopersici（FOL）中克隆了pg5[26]兩種endoPG 基因，但單獨(dú)缺失FOM pg1 和FOLpg5 對病原菌致病力均沒有影響。尖孢鐮刀菌有150 多個寄主?；?，而據(jù)報道，PG的進(jìn)化源于生態(tài)對策，是與植物的免疫反應(yīng)協(xié)同進(jìn)化的[27]。不同?；驮谂c寄主長期協(xié)同進(jìn)化的過程中，PG基因會不會在表達(dá)和功能上存在不同，尚不清楚。本研究克隆了蓮腐敗病菌PG基因，并通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，以期為進(jìn)一步分析PG基因的功能，探討該基因在病原菌浸染過程中的作用機(jī)理及蓮腐敗病的防治提供科學(xué)依據(jù)。