林凱麗,劉梅軒,麻昊然,潘思丹,喬紅偉,高虹

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京 100021)

目前,新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)在全球呈現(xiàn)爆發(fā)式流行,截止2020 年7 月初,全球已經(jīng)有196 個國家出現(xiàn)COVID-19 病例,累計確診病例達到1163 萬人。 在COVID-19 暴發(fā)初期,對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的生物學特性、流行病學特征、致病性、COVID-19 臨床表現(xiàn)等尚不明確,預防和治療手段也亟待解決,為加強對SARS-CoV-2 的認識,有效開發(fā)特異性診斷試劑,系統(tǒng)的評價機體的免疫網(wǎng)絡及組織病變,為臨床診斷、預防與治療、疫苗與藥物的篩選提供詳細的參考資料,開展病毒分離和動物感染實驗迫在眉睫。 根據(jù)目前所掌握的基本信息,該病原暫按照病原微生物危害程度分類第二類病原微生物進行管理,病毒培養(yǎng)和動物感染實驗均應當在生物安全三級實驗室內(nèi)操作[1]。

為應對新發(fā)再發(fā)傳染病、防范生物恐怖襲擊、防御生物武器攻擊,我國已經(jīng)規(guī)劃并建成一批高等級生物安全實驗室,作為國家生物安全體系的基礎支撐平臺,為人口健康與動物衛(wèi)生領域開展科研、生產(chǎn)和服務提供重要保障條件[2]。 在對SARS-CoV-2 有限認知的前提下,如何迅速、高效、有序的開展SARS-CoV-2 應急實驗活動,最大程度的控制潛在風險,保護實驗人員健康與安全,保障實驗室正常運轉,除了硬件設施外,規(guī)范化的管理措施也是生物安全三級實驗室安全運行的重要保障。

1 生物安全管理措施

系統(tǒng)、規(guī)范化的管理措施是生物安全三級實驗室高效、有序運行的重要保障,是降低實驗室意外事故發(fā)生的關鍵要素。 開展實驗活動前,實驗人員應充分了解實驗室活動涉及的任何危險,由于人類對SARS-CoV-2 的有限認知,無法對其進行充分的風險評估,因此管理部門應采取恰當?shù)墓芾泶胧?并為實驗人員提供如何在風險最小情況下進行工作的詳細指導[3],包括人員管理、活動管理、設施設備管理、消毒滅菌及意外事故處理等。

1.1 人員管理

在SARS-CoV-2 應急研究工作中,人員管理是保證實驗室安全、有效運行的關鍵環(huán)節(jié)。 開展實驗活動前,首先應成立法人負責的應急團隊,包括技術負責人、安全管理人員和項目負責人在內(nèi),落實組織管理責任,密切追蹤疫情的發(fā)展情況,完善風險評估、制定研究方案、分析研究結果、協(xié)調(diào)應急物資、調(diào)撥實驗人員,還要密切關注實驗人員的工作狀態(tài),及時做好人員的心理疏導和技術培訓。

項目組成員最好具有動物生物安全三級實驗室研究背景,熟練掌握病毒培養(yǎng)、動物飼養(yǎng)和感染的基本操作程序,充分了解實驗動物的習性,降低抓傷咬傷、動物逃逸等風險,必要時可佩戴防抓咬手套。 非人靈長類是研究SARS-CoV-2 理想的實驗動物之一,由于其體格較大、生理結構復雜,芯片植入、肺泡灌洗、動物解剖等操作對實驗人員的技術造成極大的挑戰(zhàn),因此要求實驗人員具有扎實的操作基礎。 其次,加強人員持續(xù)培訓,不僅能夠鞏固人員的實驗基礎,還能夠提高警惕性、加強風險意識,培訓重點不僅要包括人員防護、實驗室風險、意外事故處理、廢棄物的處置、清場消毒和緊急撤離等方面,還要階段性總結實驗室內(nèi)基本情況,及時反思前期出現(xiàn)的問題。 再次,管理人員要關注人員的身體健康和心理健康,通過交流與實驗人員建立良好的互信關系,充分了解實驗人員所承受得工作壓力和生活壓力,使其避免受到任何不利于其工作質(zhì)量的壓力或影響。

在應急工作中,往往時間緊、任務重,多個核心實驗室同時開展試驗活動,應有制度明確規(guī)定不同核心實驗室的研究人員退出時間需錯開半小時以上,以使公共區(qū)域得到充分自凈。 由于疾病流行初期,對COVID-19 缺乏有效的預防和治療方案,因此實驗活動前,人員要留取本底血清;實驗過程中,階段性采集咽拭子檢測核酸,如發(fā)生意外事故,一旦檢測結果呈陽性或出現(xiàn)與SARS-CoV-2 有關的臨床癥狀時,應立即上報、隔離、就診。

1.2 實驗活動管理

SARS-CoV-2 與SARS-CoV 相似性達到79.6%,通過細胞膜表面ACE2 受體進入細胞[4],我國暫時按照第二類病原微生物管理。 值得注意的是,《SARS-CoV-2 實驗室生物安全指南》 中明確指出未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料操作可在生物安全二級實驗室中操作,同時采用三級實驗室的個人防護[1],因此實驗室應急管理可參考SARS-CoV,遵循 “防護加強、程序減少” 的基本原則。

SARS-CoV-2 主要傳播途徑是呼吸道飛沫和接觸傳播,不排除氣溶膠、消化道和結膜感染等傳播途徑,因此除生物安全三級實驗室基本的防護外,實驗人員必須佩戴一次性N95 醫(yī)用防護口罩、護目鏡或者一次性面罩,佩戴N95 口罩可能存在邊緣漏氣的情況,因此每次佩戴時需要進行簡易的吹氣檢驗,根據(jù)操作者鼻部尺寸自行調(diào)整防護口罩的鼻金屬夾,吹一口氣,感覺口罩邊緣是否漏氣,保證呼出和吸入氣體確實通過口罩過濾。 實驗人員每年需要進行N95 口罩的個體適配性檢測,應同時適配兩款以上的口罩,當長時間開展實驗活動時可交替使用,避免人員臉部壓痕難以恢復的情況。 在實際使用過程中,護目鏡不僅容易起霧,而且反復消毒會導致鏡片模糊,影響人員操作安全和舒適性,因此推薦佩戴一次性防護面罩。 當實驗人員進行非人靈長類動物解剖實驗時,可能存在因動物咳嗽或排泄形成的大量氣溶膠或噴濺現(xiàn)象,實驗人員可以佩戴半身電送風正壓防護裝置,外穿一次性手術反穿衣,方便污染后隨時更換。

應急工作期間,實驗室仍然要按管理要求執(zhí)行實驗活動申請、審批制度,管理部門嚴格審查風險評估和標準操作程序、人員資質(zhì)、病原種類、動物種類和實驗活動內(nèi)容,鑒于實驗活動較多,同一項目可提交一個較長周期的實驗室使用申請,減少項目組的申請壓力,但是每次進動物前,項目組均需要提交經(jīng)過實驗動物管理委員會( IACUC) 批準的動物使用申請,確保管理部門掌握實驗活動進展和動物飼養(yǎng)情況,合理安排飼養(yǎng)籠位,協(xié)調(diào)各項目組實驗時間。 實驗活動中,病毒培養(yǎng)要嚴格控制單次的操作數(shù)量,建議少量多次,縮短操作時間,生物安全柜內(nèi)從左到右依次分為潔凈區(qū)、工作區(qū)和污物區(qū),不能遮擋排風口以免影響氣流或引發(fā)設備報警。動物感染實驗可以根據(jù)單次感染動物的數(shù)量,增加進入人數(shù),比如平時進入2 個人操作3 h 左右,應急期間可同時進入3～4 個人縮短操作時間,或者輪流操作,降低因人員疲倦發(fā)生意外的概率,每次進入時間嚴格控制在4 h 以內(nèi)。 為了減少人員在實驗室內(nèi)的停留時間,實驗前要制定完整的方案,包括給藥劑量、感染劑量和給藥途徑等,做好充分的實驗準備;實驗過程中,除病理解剖、動物臨床觀察等必須現(xiàn)場完成的記錄外,儀器設備記錄、感染性材料記錄等可在離開實驗室后補齊。

1.3 設施設備管理

設施設備是開展SARS-CoV-2 實驗活動的基礎保障,在實驗室正常運轉的情況下,開關門、局部排風設備的啟停以及房間溫濕度的變化等因素均能夠引起房間的壓力波動,在滿足現(xiàn)有生物安全實驗室建筑技術規(guī)范和設備生物安全性能評價技術規(guī)范的前提下,可根據(jù)實際情況提高設施運行的參數(shù),以增強實驗室對壓力波動的抗干擾能力,如增大房間換氣次數(shù),增加實驗室換氣次數(shù)到每小時15次或每小時20 次,通過增大換氣次數(shù)提高房間凈化能力。

病毒培養(yǎng)、動物觀察和解剖等常用設備是生物安全柜和負壓解剖臺,選用II 級A 型以上級別生物安全柜,部分生物安全柜可通過調(diào)節(jié)送排風按鈕增大系統(tǒng)送排風量,在生物安全柜內(nèi)的工作開始前和結束后,增加風機運行時間至10 min,保證工作前氣流穩(wěn)定和工作結束后安全柜內(nèi)空氣的凈化程度,工作結束后,增加紫外燈照射時間。 由于非人靈長類體格較大、呼吸量較大,感染后呼出氣體能夠產(chǎn)生氣溶膠,建議使用生物安全型飼養(yǎng)設備,可增加設備換氣次數(shù),降低實驗人員飼養(yǎng)過程中的暴露風險。

1.4 清場消毒

實驗室清場消毒是保護實驗人員、實驗環(huán)境和外部環(huán)境的重要環(huán)節(jié)。 所有移出實驗室的物品都需要經(jīng)過消毒處理,注明廢棄物類別、處理時間、處理人員等基本信息,放到專門設計的、專用的和有標識的危險廢物處置容器中[1],集中回收后按照要求處理。 高壓蒸汽滅菌是生物安全實驗室消毒滅菌的首選方法,適用于實驗室內(nèi)產(chǎn)生的廢棄物、動物尸體、墊料等,對于不能高壓的物品,比如儀器設備、動物標本等使用化學消毒法。

由于SARS-CoV-2 傳染性強、生物學特性尚不明確,建議在實驗活動操作中增加消毒頻次,延長消毒劑作用時間,有效氯含量為0.55%的含氯消毒劑是新型冠狀病毒的首選消毒劑[5]。 在操作感染性材料或動物解剖實驗活動前,需要在操作臺面鋪一次性吸水墊,表面噴灑不易揮發(fā)的消毒劑,一旦發(fā)生感染性材料的滴落,能夠被迅速吸附消毒。 實驗過程中,操作人員切勿將手頻繁移出生物安全柜,操作結束后對手部進行消毒,更換外層手套后,才能移出生物安全柜。

甲醛熏蒸是目前公認的能夠殺死所有微生物的消毒方法,由于其極大的刺激性和致癌風險以及對設施設備的損害,一般情況下不推薦使用,但是當實驗室設備故障出現(xiàn)壓力逆轉等現(xiàn)象,有潛在泄露風險時,應該立即終止實驗,封閉實驗室,在室溫不低于21℃、 相對濕度70% 的條件下使用甲醛(40%)10 mL/ m3熏蒸4 h 以上,作用時間需達到8 h 以上[1],保障實驗人員、實驗環(huán)境和外界環(huán)境的安全。

1.5 意外事故的預防與處理

在ABSL-3 實驗室內(nèi)從事動物實驗活動時,潛在的意外事故包括動物實驗器材扎傷,動物抓傷、咬傷,感染性物質(zhì)溢灑,動物逃逸,個人防護裝備污染等,因此實驗室應制定恰當?shù)念A防措施和處置方案。 比如為了避免人員扎傷,注射器排空時禁止蓋帽,可以在針頭上扎一個酒精棉球,吸附排空過程產(chǎn)生的氣溶膠;為了避免動物抓傷、咬傷,抓取動物時需佩戴防抓咬手套或者在動物麻醉狀態(tài)下進行操作;為防止感染性物質(zhì)溢灑而引起實驗室污染,核心間應配備溢灑工具箱( 內(nèi)含毛巾、消毒劑、鑷子、量杯、禁止進入的標識等),實驗人員進入核心間后應配置消毒液,將毛巾浸泡在里面,一旦發(fā)生感染性物質(zhì)溢灑,立即用浸有消毒液的毛巾覆蓋,消毒防護裝備表面后打開紫外燈離開實驗室,待核心間充分自凈后再返回處理;為了防止動物逃逸,核心間應配備捕捉桶和捕捉網(wǎng),分別用于捕捉嚙齒類動物和體型較大的動物,嚙齒類動物跌落至地面時會有3 秒鐘左右的反應延遲,實驗人員應充分利用該機會進行捕捉。

2 結語

在全國爆發(fā)COVID-19 疫情的時期,生物安全三級實驗室為人類認識病毒、有效開發(fā)診斷試劑、系統(tǒng)評價機體的免疫網(wǎng)絡及組織病變等方面提供了重要的硬件設施保障條件。 但是再好的硬件設施保障、再完美的防護條件,在實際操作層面上是無法取代人員自身的素質(zhì)和責任心,完善的管理措施能夠有效地預防實驗室生物安全事故的發(fā)生,是實驗室安全、穩(wěn)定、有效運行的重要保障。 因此,我們需要不斷完善應急措施,從實驗人員、實驗活動、設施設備、清場消毒和意外事故的預防與處理等幾個方面加強實驗室管理,保障實驗室安全、穩(wěn)定、有效的運行,為早日戰(zhàn)勝疫情貢獻自己的力量。