張 森，湯德元，曾智勇，黃 濤，王 彬，郭倩妤，廖少山

（貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是偽狂犬?。≒R）的病原，屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）、α-皰疹病毒亞科、水痘-帶狀病毒屬，是一種線狀雙股DNA 病毒[1]。該病毒可以感染多種哺乳動物，人對PRV 不易感，但近期報(bào)道有人疑似感染PRV 的病例出現(xiàn)[2]。豬是PRV 的儲存宿主，同時也是偽狂犬病的重要傳染源，成年豬感染后一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但PRV 會潛伏感染于豬的神經(jīng)系統(tǒng)中，三叉神經(jīng)節(jié)以及骶神經(jīng)節(jié)是其潛伏感染的主要部位。

信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個復(fù)雜的過程，其與細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、抗藥性、潛伏感染和癌癥等因素密切相關(guān)，且有研究表明病毒感染機(jī)體后會引起信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生變化而產(chǎn)生一系列反應(yīng)[3]。截至目前，已研究發(fā)現(xiàn)PRV 感染后發(fā)生反應(yīng)的信號通路主要 有PI3-K/Akt 通 路、NF-κB 通 路、p38 MAPK 通路、JNK/SAPK 通路、ATG 通路和IFN 通路等。本文主要對PRV 感染后引起的上述信號通路變化逐一闡述，分析由PRV 引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而產(chǎn)生的一系列反應(yīng)，為進(jìn)一步探究PRV 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提供參考。

1 PRV 感染后對PI3K/ Akt 信號通路的影響

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3-K/Akt）是抗細(xì)胞凋亡的主要途徑，由PI3K 及其下游因子Ser/Thr 蛋白激酶兩部分組成，PI3K/Akt 存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，是機(jī)體最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，該信號通路可在病毒感染細(xì)胞后被激活并產(chǎn)生作用[4]。其中Akt 是一種有效抑制細(xì)胞凋亡的分子，活化的Akt可以使caspase-9、BAD 等促凋亡相關(guān)因子磷酸化而失活[5-6]。因此，病毒可通過激活PI3K/Akt 通路抑制細(xì)胞凋亡從而在存活的細(xì)胞中大量增殖。

Us3 基因是PRV 重要的毒力基因，該基因在α皰疹病毒家族中十分保守，是皰疹病毒家族中重要的抗細(xì)胞凋亡基因之一，其不僅與核衣殼的包裹有關(guān)，且可編碼Us3 蛋白激酶（Us3PK）[7]。有研究表明，PRV Us3PK 具有抗細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)PRV 的傳播作用等特定功能，還可以參與PRV 和宿主細(xì)胞之間的各種相互作用[8]。Geenen 等將PRV 野毒株及PRV Us3 缺失株同時感染豬睪丸細(xì)胞并檢測其細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示PRV 野毒株細(xì)胞凋亡指標(biāo)明顯低于缺失株，表明Us3PK 可以使PRV 感染的細(xì)胞免于凋亡[9]。Chang 等研究顯示，PRV 感染宿主細(xì)胞的早期，會誘導(dǎo)PI3K/Akt 通路發(fā)生反應(yīng)，使抗凋亡相關(guān)因子表達(dá)量提高，從而抑制PRV 感染后的宿主細(xì)胞凋亡，這個結(jié)果也在動物體內(nèi)得以驗(yàn)證；同時將Us3 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，Us3 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后可誘導(dǎo)Akt 及其上游信號分子PDK-1 的磷酸化[10]。上述研究在與PRV同為α皰疹病毒家族且同樣具有Us3PK 的單純皰疹病毒1 型中也得到了驗(yàn)證[11]。以上研究表明Us3 對PRV 誘導(dǎo)PI3-K/Akt 信號通路抗細(xì)胞凋亡以促進(jìn)PRV的復(fù)制有直接聯(lián)系。

自噬是細(xì)胞在溶酶體中降解自身物質(zhì)的一種細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及抵抗病原微生物感染的保護(hù)措施，同時在先天和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞自噬與病毒感染的關(guān)系存在兩重性，許多病毒已經(jīng)進(jìn)化出了逃逸自噬的機(jī)制，有的甚至能夠利用自噬以促進(jìn)自身的感染[12]。PRV 是一種大型復(fù)雜的病毒，可在宿主體內(nèi)建立終身持續(xù)性感染[13]。Sun 等證明了PRV Us3PK 的新功能，其通過激活PI3-K/Akt 途徑來抑制細(xì)胞自噬，以達(dá)到長時間在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖的目的，表明PRV 可能存在一種通過拮抗宿主自噬以促進(jìn)其復(fù)制的方法[14]。綜上所述，PRV 感染后其表達(dá)的Us3PK 會誘導(dǎo)細(xì)胞PI3K/Akt信號通路阻止細(xì)胞的凋亡及自噬，從而使病毒在受感染細(xì)胞中大量增殖，對其進(jìn)行深入研究將為揭示PRV 如何在細(xì)胞中或機(jī)體內(nèi)潛伏感染提供參考。

2 PRV感染后對NF-κB信號通路的影響

核因子kB（NF-κB）家族是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在免疫應(yīng)答和炎癥的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用，其幾乎存在于所有哺乳動物細(xì)胞中[15]。NF-κB家族一共包括5 種蛋白，分別為NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、c-Rel 和RelB。一般情況下，NF-κB 在細(xì)胞中與其抑制蛋白IκB 結(jié)合形成p50/p65/IκB三聚體復(fù)合物并處于失活狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到如病毒、炎癥因子、紫外線等外界因素刺激時，IκB 被磷酸化并從三聚體中解離，或經(jīng)泛素化修飾后被降解，NF-κB信號通路由此活化并啟動相應(yīng)轉(zhuǎn)錄程序[16]。

PRV 的早期蛋白Eb0 具有泛素連接酶（Ubl）活性，通過操控泛素通路水解免疫蛋白的方式介導(dǎo)NF-κB 等信號分子的分解，從而抑制干擾素通路的激活，由此降低機(jī)體抵抗PRV 的能力[17]。Fan 等研究表明，PRV 在感染細(xì)胞的早期階段會激活NF-κB信號通路，雖然在感染的全過程中NF-κB 亞基（p50、p65 和c-Rel）和IκBα的總表達(dá)水平無變化，但在感染早期階段（50 min～120 min）的IκBα磷酸化水平增加，所有NF-κB 相關(guān)蛋白在感染后30 min～240 min 內(nèi)磷酸化均受到抑制，表明PRV 在感染的早期階段會顯著誘導(dǎo)NF-κB 信號通路從而增強(qiáng)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)；同時增加Us3 表達(dá)會促進(jìn)NF-κB 抑制蛋白I-κBα的磷酸化，表明US3 可能存在不同的機(jī)制協(xié)助PRV 對細(xì)胞的感染，這一點(diǎn)還需要未來進(jìn)一步研究[18]。Romero 等研究顯示，PRV 感染細(xì)胞后會激活NF-κB 信號通路，NF-κB 活化后可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子，這些炎癥因子可幫助細(xì)胞對抗PRV 的感染，所以該通路的激活有助于上調(diào)受PRV 感染細(xì)胞的早期炎癥反應(yīng)，提高細(xì)胞對PRV 感染的免疫應(yīng)答，但PRV 感染后在細(xì)胞中的增殖可能與NF-κB 信號通路無關(guān)[19]。Lee 等通過化學(xué)抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）實(shí)現(xiàn)了對NF-κB 信號傳導(dǎo)途徑的抑制，結(jié)果表明阻斷NF-κB 信號通路并沒有影響PRV 誘導(dǎo)的細(xì)胞病變（CPE）和細(xì)胞凋亡[20]。Yeh 等將PRV 感染使用顯性陰性IκBα或顯性陰性IκBβ處理的細(xì)胞后以探究PRV誘導(dǎo)NF-κB 信號通路與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果與上述一致，同樣認(rèn)為PRV 感染后誘導(dǎo)的NF-κB 信號通路與細(xì)胞凋亡無關(guān)[21]。由此可見NF-κB 通路可能也對PRV 引起的細(xì)胞凋亡無影響。

NF-κB 活化因子結(jié)合激酶（TANK1）在產(chǎn)生1 型干擾素（IFN-I）的抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。劉曉賀等將PK-15 細(xì)胞的TANK1 基因敲除，利用PRV 感染該細(xì)胞系后發(fā)現(xiàn)，IFN-β、ISG 15 及IL-1β的表達(dá)均被抑制，同時病毒基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)以及子代病毒的感染力均有所提高，從側(cè)面表明NF-κB 通路在機(jī)體參與抗PRV 感染的天然免疫反應(yīng)中的重要性[22]。Liu 等研究顯示木犀草素可以有效抑制由PRV 感染細(xì)胞后由NF-κB 誘導(dǎo)的NO、iNOS、COX-2 等體外促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，表明木犀草素可能對抗PRV 感染有一定作用，對PRV 未來通過NF-κB方向治療的研究提供了參考[23]。

3 PRV 感染后對p38 MAPK 信號通路的影響

促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）信號通路可以促使細(xì)胞釋放出多種外部信號，并使受體細(xì)胞作出適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)，p38 MAPK 通路對應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞的增殖和分化均具有重要意義[24]。p38MAPK 的活化與其他蛋白激酶類似，需要通過磷酸化來誘導(dǎo)自身構(gòu)象重組，促使其與底物的結(jié)合。有研究表明病毒感染細(xì)胞后可以通過p38MAPK途徑產(chǎn)生生理作用[25]。一般情況下，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的產(chǎn)生在一定程度上反映了p38 MAPK 通路的活化，當(dāng)抑制p38 MAPK 通路會顯著影響TNF-α的表達(dá)[26]。Lin 等發(fā)現(xiàn)PRV 感染后可以增加細(xì)胞內(nèi)TNF-α 轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌以及TNF-α受體表達(dá)，即PRV 感染細(xì)胞后可能會誘導(dǎo)p38 MAPK 通路活化[27]。Yeh 等利用MAPK抑制劑阻斷細(xì)胞內(nèi)MAPK 的信號傳導(dǎo)，然后用PRV 分別感染阻斷MAPK 通路細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組及未阻斷MAPK通路細(xì)胞的對照組并測定各組存活細(xì)胞及凋亡細(xì)胞，結(jié)果表明被病毒感染后的實(shí)驗(yàn)組僅有15%的細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對照組，且細(xì)胞凋亡數(shù)與對照組相比也減少，由此推測p38 MAPK 通路可能抑制了PRV在機(jī)體的潛伏感染[21]。

4 PRV 感染后對JNK/SAPK 信號通路的影響

JNK（c-Jun N 末端激酶）又被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK），是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，介導(dǎo)真核細(xì)胞通過活化蛋白激酶途徑以減少對非生物和生物應(yīng)激損傷的反應(yīng)，是真核生物進(jìn)化過程中一種相對保守的信號通路[28]。JNK/SAPK 通路可以被許多炎癥因子激活從而參與炎癥反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、自噬、凋亡等過程[29]。TNF-α與白細(xì)胞介素（IL）是影響該通路的重要炎癥因 子，有 研 究 表 明IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12 和TNF-α可介導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，隨之可誘導(dǎo)JNK/SAPK 信號通路，從而引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)[30]。Yeh 等研究顯示，PRV 感染細(xì)胞后會顯著誘導(dǎo)TNF-α的分泌，而對IL 等炎癥因子的分泌影響不大，并且感染的細(xì)胞中隨著感染時間的延長分泌的TNF-α?xí)S之增多；同時將PRV 感染阻斷JNK/SAPK通路后的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達(dá)和分泌被阻斷，同時發(fā)現(xiàn)抗TNF-α抗體會降低PRV 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明TNF-α抗體可能具有治療PRV感染的潛力[23]。

5 PRV 感染后對ATG 信號通路的影響

自噬相關(guān)蛋白（ATG）是促進(jìn)細(xì)胞自噬的重要物質(zhì)，長期以來人們認(rèn)為ATG 是細(xì)胞自噬所必需的，同時該類蛋白形成了一種復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)[31]。其中Beclin 1、ATG7 和ATG5 是3 種調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要蛋白。其中Beclin 1 是首個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的自噬基因，它是酵母自噬基因Atg6 的同源基因，是自噬機(jī)制的核心成分，通過激活Vps34 在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮核心作用[32]。胡林將PRV 感染PK-15 細(xì)胞，利用RT-qPCR 及western blot 檢測結(jié)果顯示，Be?clin 1 的mRNA 及蛋白水平均顯著增加，相關(guān)蛋白水平也呈現(xiàn)明顯上升趨勢，表明PRV 感染后細(xì)胞表達(dá)的Beclin 1 可促進(jìn)細(xì)胞的自噬[33]。Xu 等為了進(jìn)一步研究自噬在PRV 復(fù)制中的作用，利用特異性靶向Be?clin1、Atg7 和Atg5 的siRNA 片段干擾N2a 細(xì)胞，以沉默內(nèi)源性的Beclin-1、ATG7 和ATG5 自噬蛋白，然后將PRV 同時感染該N2a 細(xì)胞與正常N2a 細(xì)胞，結(jié)果顯示經(jīng)過干擾的N2a 細(xì)胞與正常N2a 細(xì)胞相比病毒滴度顯著降低，將這3 種蛋白敲除后可以抑制病毒釋放。表明PRV 感染N2a 細(xì)胞后可通過經(jīng)典的Beclin 1-ATG7-ATG5 自噬途徑特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以增強(qiáng)PRV 復(fù)制[34]。這個結(jié)論與前文Sun 等人的研究結(jié)果相反，推測可能是感染病毒的毒力不同導(dǎo)致，也有可能是PRV感染后通過不同信號通路對機(jī)體產(chǎn)生的影響不同，再就是PRV感染神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制可能與感染其他細(xì)胞的機(jī)制不同，其中的機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

6 PRV感染后對IFN信號通路的影響

早期研究顯示，IFN 對PRV 感染的早期基因表達(dá)起到負(fù)調(diào)控作用，即IFN 對PRV 在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制有抑制作用，有關(guān)PRV 感染細(xì)胞后影響IFN 信號通路的研究目前正在迅速增多[35]。Kathlyn 等的研究顯示，IFN-I 在調(diào)節(jié)小鼠PRV 感染的早期神經(jīng)炎癥反應(yīng)和臨床癥狀中起關(guān)鍵調(diào)控作用，強(qiáng)毒力的PRV 會有效抑制IFN-I 的表達(dá)從而使病毒在細(xì)胞中復(fù)制和傳播，弱毒株能激活I(lǐng)FN 信號通路引起快速的IFN-I反應(yīng)以抑制病毒復(fù)制從而降低PRV 對細(xì)胞的損傷，該研究為PRV 感染后誘導(dǎo)IFN 信號通路發(fā)生反應(yīng)并調(diào)控機(jī)體免疫的原理提供有力支撐[36]。

Wei 等研究表明，將PRV 分別感染IFN 受體缺陷性小鼠及野生型小鼠，結(jié)果顯示IFN 受體缺陷性小鼠的存活率顯著降低，同時IFN-α及IFN-β表達(dá)量較野生型小鼠明顯減少，IFN 受體缺陷性小鼠與正常小鼠相比偽狂犬病癥狀更為明顯，且引起的神經(jīng)癥狀早24 h 出現(xiàn)，所以缺乏IFN 就失去了機(jī)體抵抗PRV 感染的一層屏障，表明IFN 的產(chǎn)生對機(jī)體抵抗PRV 感染起到重要作用[37]。干擾素刺激基因15（ISG15）是由IFN 誘導(dǎo)的泛素蛋白，在IFN 相關(guān)信號通路中起到重要作用。Liu 等發(fā)現(xiàn)ISG15 過表達(dá)可以抑制PRV 在PK-15 細(xì)胞中的復(fù)制，增強(qiáng)了IFN的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高了IFN-β的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)的表達(dá)，表明ISG15 可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)IFN 信號通路的活化從而在抗PRV 感染后發(fā)生的免疫反應(yīng)中起到了重要的作用，為未來PRV 的治療提供參考[38]。

Xie 等對豬干擾素刺激因子（poSTING）進(jìn)行了分子克隆及功能鑒定，并將該基因在幾種豬細(xì)胞系中表達(dá)，結(jié)果顯示poSTING 可激活I(lǐng)FN-β啟動子，從而誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)，表明poSTING 是豬先天免疫信號的重要調(diào)控因子，可能在抗dsDNA 病毒中發(fā)揮作用[39]。近期，侯璐等采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)將豬肺泡巨噬細(xì)胞系（3D4/21）中Sting 敲除，PRV感染該細(xì)胞系后，與未敲除Sting 的細(xì)胞相比，病毒基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的表達(dá)、子代病毒的感染力均有所提高，且IL-1β、IFN-β、ISG15 的轉(zhuǎn)錄水平下降，表明STING 在抗PRV 感染中起到重要作用[40]。如果將Sting 在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，是否可以提高細(xì)胞對PRV 的抗感染能力及弄清其引起的免疫逃避機(jī)制，還有待于進(jìn)一步研究。

7 小結(jié)與展望

綜上所述，當(dāng)PRV 感染豬或動物細(xì)胞時PI3-K/Akt 通路、NF-κB 通路、p38 MAPK 通路、JNK/SAPK通路、ATG 通路和IFN 通路均可發(fā)生作用并對細(xì)胞調(diào)控產(chǎn)生一定影響，研究這些通路的發(fā)展過程可以更加透徹的了解PRV 的致病機(jī)理并可為PRV 感染疾病的治療及預(yù)防提供一些新的思路。PRV 的潛伏感染是控制并消滅該病的難點(diǎn)所在，可以通過誘導(dǎo)某種信號通路或者通路中的關(guān)鍵分子，從而可能實(shí)現(xiàn)對PR 的靶向的治療及預(yù)防。

三叉神經(jīng)節(jié)（TG）是PRV 潛伏感染的關(guān)鍵區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)室目前致力于研究PRV 感染TG 后NF-κB 及PI3K/Akt 信號通路在其中的作用并取得一定進(jìn)展。本研究室將PRV 感染小鼠原代TG 細(xì)胞后，通過檢測某些指標(biāo)顯示，TG 細(xì)胞出現(xiàn)CPE 且PRV 在TG 細(xì)胞核內(nèi)吸附并增殖；ELISA 結(jié)果顯示，PRV 感染TG的36 h～60 h 時IL-1 的表達(dá)量達(dá)到峰值，而IL-6 的表達(dá)量則在PRV 感染早期即達(dá)到峰值，表明PRV 感染TG 后可能會誘導(dǎo)NF-κB 信號通路活化，從而提高了IL-1、IL-6 等炎癥因子的表達(dá)水平，增強(qiáng)了TG細(xì)胞的免疫應(yīng)答。未來可以考慮提高TG 中NF-κB信號通路及其上游炎癥因子的表達(dá)以增強(qiáng)宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而阻止PRV 在TG 中的潛伏感染。髓樣分化因子88（MyD88）和IFN-β TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）是NF-κB 信號通路的兩個上游因子，本研究室研究結(jié)果表明MyD88 和TRIF 均對PRV 感染TG后的炎癥因子的產(chǎn)生及誘導(dǎo)NF-κB 信號通路活化發(fā)揮著正調(diào)控作用，且二者是相互協(xié)同的關(guān)系。（數(shù)據(jù)未發(fā)表）

信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制錯綜復(fù)雜，不同通路之間相互聯(lián)系、互相影響，當(dāng)前對PRV 信號通路的研究較少，對不同信號通路之間的相互作用及其導(dǎo)致細(xì)胞因子、受體的變化也研究不足。因此，不僅需要對PRV 感染后誘導(dǎo)其他信號通路所產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，更要剖析其中關(guān)聯(lián)，這將有助于揭示PRV 的致病機(jī)制及開發(fā)預(yù)防和治療PR 的新方法提供參考。