郭琦，沈衛(wèi)鋒，樓寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所， 浙江 杭州 310021)

蝦肝腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoonhepatopenaei, EHP)，屬于真菌界、微孢子蟲(chóng)門(Microspora)、單倍期綱(Haplophasea)、壺孢目(Chytridiopsida)、腸胞蟲(chóng)科(Enterocytozoonidae)、腸胞蟲(chóng)屬(Enterocytozoon)[1-2]，是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生生物，其生活史一般包括感染期、增殖期和孢子繁殖期3個(gè)階段[3-4]。蝦肝腸胞蟲(chóng)成熟孢子呈橢圓形，大小約為0.7 μm×1.1 μm，孢子具有一個(gè)細(xì)胞核，極絲5～6圈，一個(gè)后位空泡，一個(gè)錨狀物粘附在極絲上，和較厚的電子致密的孢子壁[1，5]。EHP的孢子壁由3部分組成，分別是一層細(xì)胞膜，一層較厚的電子密度低的孢子內(nèi)壁(10 nm)和一層較薄的電子致密的孢子外壁(2 nm)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子外壁并不光滑，其上布滿細(xì)小褶皺和大量白色瘤狀物，疑似胞壁蛋白[1，5]。

2000年，研究人員在泰國(guó)生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)上發(fā)現(xiàn)了一種未知的微孢子蟲(chóng)[6]，其超微結(jié)構(gòu)特征符合腸胞蟲(chóng)科，胞原質(zhì)團(tuán)(plasmodia)在細(xì)胞質(zhì)中的位置以及小亞基核糖體RNA序列(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)與比氏腸胞蟲(chóng)(Enterocytozoonbieneusi)相比存在16%的差異，被認(rèn)為是一個(gè)新種，將其命名為蝦肝腸胞蟲(chóng)[1]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，EHP可以感染斑節(jié)對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)等養(yǎng)殖蝦類，導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢，且癥狀隨著感染的增加而加重，可能引起對(duì)蝦的慢性死亡[1，7-8]。

目前，EHP已經(jīng)在全世界各地的蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中被檢測(cè)到，而EHP流行已經(jīng)對(duì)印度、泰國(guó)、中國(guó)、越南、馬來(lái)西亞、印度尼西亞等亞洲各國(guó)的養(yǎng)殖蝦業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7，9-15]。本文重點(diǎn)就蝦肝腸胞蟲(chóng)的傳播途徑、檢測(cè)方法和防治方面研究進(jìn)展做綜述，旨在為今后高效檢測(cè)和防控EHP提供參考。

1 EHP的危害及傳播途徑

1.1 垂直傳播

EHP可以通過(guò)垂直傳播途徑即侵染親蝦的卵巢傳播至下一代。有研究發(fā)現(xiàn)，在感染EHP的凡納濱對(duì)蝦F1代的無(wú)節(jié)幼體、蚤狀幼體第一期和第二期中均能檢測(cè)到EHP的存在[16]。

1.2 水平傳播

EHP的水平傳播途徑相對(duì)復(fù)雜，目前已知健康蝦可以通過(guò)取食病蝦殘?bào)w、與病蝦合養(yǎng)等方式感染EHP，而在實(shí)驗(yàn)室條件下通過(guò)飼喂病蝦肝胰腺組織或者注射純化的EHP對(duì)蝦血淋巴中也可使健康蝦感染EHP[16-19]。自然條件下，EHP可能存在多種傳播介體，健康蝦可通過(guò)取食攜帶EHP的介體而被感染，目前已有研究顯示鹵蟲(chóng)可攜帶EHP[20]。在自然和實(shí)驗(yàn)室條件下感染EHP的凡納濱對(duì)蝦中，通過(guò)組織學(xué)檢驗(yàn)僅能在肝胰腺和中腸中觀察到EHP，而PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，凡納濱對(duì)蝦的所有組織和器官中均可檢測(cè)到EHP，包括肝胰腺、中腸、血淋巴、鰓、肌肉和心臟等[18，21]。

目前對(duì)于EHP在蝦體內(nèi)的侵染路徑尚無(wú)系統(tǒng)性研究，研究主要集中于EHP在蝦肝胰腺中的分布情況、EHP感染蝦肝胰腺的過(guò)程和該過(guò)程中參與的蛋白。EHP可以通過(guò)侵染斑節(jié)對(duì)蝦的肝胰腺上皮小管細(xì)胞進(jìn)入其細(xì)胞質(zhì)，并在其中完成生活史[1]。在EHP侵染蝦肝胰腺的過(guò)程中，EHP的胞壁蛋白EhSWP1可以和蝦肝胰腺上皮小管細(xì)胞表面的肝素(heparin)結(jié)合，再通過(guò)激發(fā)極管侵染蝦的細(xì)胞[22]。

1.3 EHP對(duì)宿主的影響

EHP被懷疑與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦和羅氏沼蝦的生長(zhǎng)遲緩癥狀相關(guān)[23]。EHP侵染凡納濱對(duì)蝦肝胰腺后，可以引起血淋巴中的總蛋白量和白蛋白量顯著上升，肝損傷指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(asparate transaminase, AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的量顯著上升，且感染EHP的蝦體質(zhì)量顯著低于健康蝦[18]。

2 EHP檢測(cè)方法

由于EHP孢子較小，在光學(xué)顯微鏡常規(guī)鏡檢下難以發(fā)現(xiàn)及鑒定，利用分子生物學(xué)技術(shù)是目前可行且具有靈敏度高、特異性好、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)的檢測(cè)方法。

2.1 PCR檢測(cè)技術(shù)

目前最常用的檢測(cè)蝦體內(nèi)攜帶EHP情況的方法即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)。研究人員已經(jīng)建立基于18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA，18S rRNA)基因[24]、小亞基核糖體RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因[25]和胞壁蛋白(spore wall protein，SWP)基因序列[26]的PCR檢測(cè)技術(shù)，為了提高靈敏度和特異性，多數(shù)EHP檢測(cè)過(guò)程中會(huì)采用巢式PCR(nested-PCR)的方法。國(guó)內(nèi)研究人員對(duì)這3種方法在檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦、鹵蟲(chóng)和水樣中EHP的結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)18S-PCR在第一步擴(kuò)增時(shí)的靈敏度最高，而后2種方法均未檢出條帶；在第二步擴(kuò)增上，SSU-PCR的靈敏度顯著高于SWP-PCR，但在分析了陽(yáng)性PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)SSU-PCR存在假陽(yáng)性條帶，因此，SWP-PCR的擴(kuò)增特異性最高[27]。國(guó)外學(xué)者對(duì)SSU-PCR和SWP-PCR的檢測(cè)靈敏度也進(jìn)行了比較，以連接SSU rRNA或SWP基因序列的pGEM-T質(zhì)粒為模板，利用巢式PCR技術(shù)，結(jié)果顯示，SSU-PCR技術(shù)只能檢測(cè)到質(zhì)?？截悢?shù)為106以上的模板，而SWP-PCR可以檢測(cè)最低拷貝數(shù)為104的模板；在對(duì)與EHP的SSU rRNA序列相似性較高的其他微孢子蟲(chóng)的PCR檢測(cè)過(guò)程中，SSU-PCR會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，而SWP-PCR的特異性很好[26]。因此，在檢測(cè)蝦攜帶EHP情況過(guò)程中，建議使用SWP-PCR技術(shù)。

2.2 定量PCR技術(shù)

目前已經(jīng)建立的用于EHP檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)方法分別是SYBR Green I和TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法[8，28]。以Ct值≤30時(shí)檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性，TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)EHP標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度為每μL 5.20×102拷貝數(shù)[28]，而SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的檢測(cè)靈敏度為每μL 8.3×103拷貝數(shù)[8]，因此TaqMan qPCR方法的檢測(cè)靈敏度約為SYBR Green I qPCR方法的10倍左右。利用定量PCR檢測(cè)方法，不僅可以更靈敏的檢測(cè)EHP，也可以研究體長(zhǎng)與EHP載量之間的關(guān)系，從而評(píng)估對(duì)蝦生長(zhǎng)速率的風(fēng)險(xiǎn)水平[8]。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)

由于巢式PCR檢測(cè)方法和SYBR或Taqman定量檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，花費(fèi)較高，且需要特定儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，2013年泰國(guó)學(xué)者建立了檢測(cè)EHP SSU rRNA基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，該方法使用納米金探針，所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間僅為50 min，靈敏度為巢式PCR的10倍，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接可視且特異性良好[29]。隨后，2017年印度學(xué)者建立了實(shí)時(shí)定量LAMP檢測(cè)方法，其靈敏度與實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)方法相當(dāng)，約為巢式PCR的100倍[30]。2018年印度學(xué)者建立了使用SYBR green I染料的可視化LAMP檢測(cè)方法，所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間更短，相比于巢式SWP-PCR檢測(cè)結(jié)果，LAMP的靈敏度約為其的95.31%，特異性約為98.98%，這對(duì)于田間檢測(cè)EHP來(lái)說(shuō)是一種可利用的方法[31]。

2.4 組織學(xué)檢測(cè)方法

除了分子生物學(xué)檢測(cè)方法之外，病理檢測(cè)也是一種診斷病原和觀察病原宿主組織病理變化的重要方法，而良好的染色方法有利于研究人員將病原體與組織區(qū)分開(kāi)，增加組織切片中病原的檢出率。目前最常用于檢測(cè)病理切片中EHP的染色方法為蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosin, HE)染色法[1，18，24]。研究人員為了篩選出一種適用于EHP病理切片檢測(cè)的最佳染色方法，對(duì)包括蘇木精-伊紅(HE)染色法、Masson染色、愛(ài)顯藍(lán)-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺藍(lán)(TB)染色法、偉赫夫范吉森(EVG)染色法、勞克監(jiān)牢藍(lán)(LFB)染色法、天狼星紅(Sirius red)染色和普魯士藍(lán)(PB)在內(nèi)的8種染色方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)HE染色法對(duì)孢子的染色效果較差、與背景顏色對(duì)比不明顯且單個(gè)視野檢出率較低，而Masson染色結(jié)果顯示孢子呈現(xiàn)品紅色、與組織顏色對(duì)比明顯且檢出率最高。Masson染色法最適用于EHP病理切片檢測(cè)[32]。

由于微孢子蟲(chóng)在HE染色處理后的病理切片中形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，難以區(qū)分EHP與其他微孢子蟲(chóng)，其特異性上不如分子生物學(xué)檢測(cè)方法，因此，研究人員建立了原位雜交(in situ hybridization，ISH)檢測(cè)方法用于EHP的病理切片檢測(cè)[24]。利用帶有地高辛標(biāo)記的EHP-18S rRNA探針進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，研究人員可以在感染EHP的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺上皮小管細(xì)胞中觀察到陽(yáng)性標(biāo)記，而使用棉蝦病探針進(jìn)行原位雜交時(shí)則沒(méi)有陽(yáng)性標(biāo)記，證明該方法具有特異性[24]。

3 EHP防治

目前尚無(wú)能夠有效防治蝦體內(nèi)EHP的報(bào)道，但根據(jù)EHP的流行病學(xué)特性，可以從以下幾個(gè)方面對(duì)EHP的傳播進(jìn)行干預(yù)。首先，由于EHP存在垂直傳播的特性，因此，需要從源頭對(duì)EHP進(jìn)行預(yù)防，即選育無(wú)EHP的親蝦，育種不攜帶EHP的蝦苗，同時(shí)科技人員需要檢測(cè)出廠的蝦苗，及時(shí)為農(nóng)戶提供信息。其次，由于EHP可以通過(guò)蝦的排泄物進(jìn)入水體，因此，對(duì)于使用時(shí)間比較長(zhǎng)的養(yǎng)殖塘，農(nóng)戶需要進(jìn)行嚴(yán)格消毒，以清除殘留在塘底淤泥中的病原物。Aldama-Cano等[33]發(fā)現(xiàn)，在幾種不同條件下可以完全抑制EHP的孢子釋放(spore extrusion)，當(dāng)在-20 ℃條件下處理2 h以上、在15 ppm的KMnO4溶液中處理15 min、在40 ppm的65%活性氯中處理15 min、在10 ppm的65%活性氯中處理24 h或在20%的乙醇中處理15 min時(shí)，EHP的孢子釋放率100%被抑制，這些方法對(duì)于蝦類養(yǎng)殖前的養(yǎng)殖場(chǎng)消毒或養(yǎng)殖過(guò)程中的循環(huán)水處理具有參考價(jià)值。此外，有研究發(fā)現(xiàn)控制水體的氨氮濃度在6.0～9.0 mg·L-1時(shí)可以有效減少凡納濱對(duì)蝦EHP的攜帶量[34]。由于病蝦可能在養(yǎng)殖過(guò)程中被健康蝦取食，EHP則可通過(guò)該途徑進(jìn)行水平傳播，因此，農(nóng)戶需要及時(shí)處理病死蝦或可通過(guò)套養(yǎng)魚(yú)類來(lái)取食行動(dòng)緩慢的病蝦，從而有效控制疾病擴(kuò)散。最后，可以通過(guò)增強(qiáng)養(yǎng)殖蝦的體質(zhì)來(lái)增加其對(duì)病原物的抵抗力，例如在飼料中添加水產(chǎn)用維生素和鈣片，或者利用RNA干擾的方法，提前讓蝦攝入抑制EHP孢子釋放的雙鏈RNA，增強(qiáng)蝦對(duì)EHP的抵抗力。綜上，防治蝦肝腸胞蟲(chóng)需要遵循“預(yù)防為主、防治結(jié)合”，優(yōu)先選育無(wú)EHP親蝦和蝦苗，結(jié)合養(yǎng)殖塘嚴(yán)格清理、水源控制、病蝦及時(shí)清理和增強(qiáng)蝦體質(zhì)，做到“無(wú)病預(yù)防，有病早治”。