李萌，夏長劍，楊金廣，王天玉，呂洪坤，吳會(huì)杰

1 鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州高新區(qū)科學(xué)大道136號(hào) 450000；

2 中國煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克Ｄ鲜『？谑屑t城湖路22號(hào) 571100；

3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào) 266101；

4 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南鄭州未來路最南端 450009

中國黃花稔曲葉病毒（Sida yellow mosaic China virus，SiYMCNV）于2005年在海南儋州表現(xiàn)黃化、花葉癥狀的雜草黃花稔（Sida acuta）上分離并命名[1]。SiYMCNV屬雙生病毒科（Geminiviridae）金黃色花葉病毒屬（Begomovirus），其病毒基因組由DNA-A和伴隨的衛(wèi)星DNA-β構(gòu)成[1]。除黃花稔外，該病毒還可侵染雜草勝紅薊 （Ageratum conyzoides）[2]。由于SiYMCNV僅侵染雜草，自2006年以后，未發(fā)現(xiàn)該病毒的研究報(bào)道。

2018年4月課題組在海南儋州雪茄煙栽培基地發(fā)現(xiàn)一些煙株呈現(xiàn)矮化、曲葉、脈突等典型的曲葉病毒病癥狀（圖1），病葉樣品中擴(kuò)增得到的DNA-A和DNA-β全長與Xiong等[1]2005年報(bào)道的SiYMCNV的DNA-A和DNA-β的序列相似度分別為99%和93%，表明煙草也是SiYMCNV的自然寄主[3]。SiYMCNV曲葉病毒病在海南儋州雪茄煙上的發(fā)病率約為1%～5%，發(fā)病植株完全喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成絕收。因此，本文以侵染海南雪茄煙的SiYMCNV分離物為材料構(gòu)建了SiYMCNV可高效侵染煙草的侵染性克隆，為分析該病毒對(duì)煙草的致病性及進(jìn)一步開展病原-媒介生物互作、煙草抗病性鑒定等研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

PCR 儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；MiniBIS Pro凝膠成像系統(tǒng)（以色列DNR公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒（洛陽吉恩特生物科技有限公司）；植物表達(dá)載體pCAMBIA1300（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組保存）；GV3101農(nóng)桿菌（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組保存）；高保真PCR酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）。

病葉于2018年4月采自海南儋州?？谘┣蜒芯克囼?yàn)田，染病植株顯著矮化、葉片扭曲，脈突明顯（圖1）；接種煙草品種為雪茄煙H382。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和條件

1.2.1 DNA提取

稱取20 mg病葉樣品放入1.5 mL離心管中，應(yīng)用玻璃研磨棒在離心管內(nèi)將病葉研磨成均勻漿液，按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA。

1.2.2 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆構(gòu)建

以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應(yīng)用引物 A-0.5-PstI-F 和 A-XbaI-R（表1）擴(kuò)增 0.5倍的DNA-A全長序列，回收的擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)Pst1和XbaI酶切的載體pCAMBIA1300用infusion酶連接，通過雙酶切和測(cè)序篩選pCAMBIA1300-0.5A陽性克??；以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應(yīng)用引物A1-XbaI-F和A-XbaI-R（表1）擴(kuò)增 DNA-A全長，回收的擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)XbaI酶切的pCAMBIA1300-0.5A載體用infusion酶連接，獲得含有1.5倍串聯(lián)重復(fù)DNA-A侵染性克隆pCAMBIA1300-1.5A。

圖1 海南田間感染中國黃花稔曲葉病毒植株癥狀Fig.1 Tobacco plant infected by Sida yellow mosaic China virus in the field in Hainan province

表1 構(gòu)建侵染性克隆和接種植物DNA-A和DNA-β檢測(cè)所用引物Tab.1 Primers for construction of infectious clones and for detection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated host plants

1.2.3 SiYMCNV DNA-β 侵染性克隆構(gòu)建

以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應(yīng)用引物β-PstI-F和β-BamH I-R擴(kuò)增DNA-β 全長序列，回收的擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)Pst I和BamH I酶切的載體pCAMBIA1300用infusion酶連接，通過雙酶切和測(cè)序篩選pCAMBIA1300-β陽性克?。灰愿腥静《镜难┣褵熆偦蚪MDNA為模板，應(yīng)用引物 β-BamH I-F和β-BamH I-R（表1）擴(kuò)增DNA-β全長，回收擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)BamH I酶切的pCAMBIA1300-β載體用infusion酶連接，獲得含有2倍串聯(lián)重復(fù)DNA-β全長侵染性克隆pCAMBIA1300-2β。

1.2.4 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

采用液氮凍融法分別將經(jīng)雙酶切和測(cè)序篩選測(cè)序確認(rèn)的pCAMBIA1300-1.5A和pCAMBIA1300-2β轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，篩選陽性克隆獲得攜帶1.5倍串聯(lián)重復(fù)DNA-A的農(nóng)桿菌GV3101-A和2倍串聯(lián)重復(fù)DNA-β 全長的農(nóng)桿菌 GV3101-β。

1.2.5 農(nóng)桿菌侵染煙草

分別將 GV3101-A 和 GV3101-β 接種于 50 mL LB液體培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)24 h，4000 rpm離心后將菌液在 50 mL 懸浮液（10 mM MgCl2，10 mM 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸，200 μM乙酰丁香酮）中重懸浮。將重懸浮后的GV3101-A和 GV3101-β以1：1比例混和，用1 mL無菌注射器將該混合菌液注射本氏煙和雪茄煙幼苗葉片（各10株）。以接種含空載體pCAMBIA1300農(nóng)桿菌的本氏煙和雪茄煙作為對(duì)照，單獨(dú)接種GV3101-A本氏煙和雪茄煙幼苗各5株。接種煙苗在28℃、光周期14 h:10 h、相對(duì)濕度65%人工氣候箱生長2周后觀察植物發(fā)病情況。應(yīng)用PCR檢測(cè)農(nóng)桿菌接種植株DNA-A和DNA-β（表1）。

2 結(jié)果

2.1 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆構(gòu)建

重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-1.5A經(jīng)PstI酶和XbaI酶切后形成3個(gè)片段，大小分別與質(zhì)粒pCAMBIA1300、1 倍 DNA-A（2751 bp）和0.5倍DNA-A（1471 bp）一致（圖2）。測(cè)序結(jié)果與SiYMCNV DNA-A 一致。

圖2 Pst I和 Xba I酶切重組質(zhì)粒 pCAMBIA1300-1.5AFig.2 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and Xba I

2.2 SiYMCNV DNA-β侵染性克隆構(gòu)建

重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-2β 經(jīng)PstI酶和BamH I酶切后形成2個(gè)片段，大小分別與質(zhì)粒pCAMBIA1300和1倍DNA-β（1352 bp）一致（圖3）。測(cè)序結(jié)果與SiYMCNV DNA-β一致。

圖3 Pst I和 BamH I酶切重組質(zhì)粒 pCAMBIA1300-2βFig.3 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and BamH I

2.3 農(nóng)桿菌侵染煙草

圖4 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏煙（A）和雪茄煙（B）癥狀Fig.4 Symptoms induced by SiYMCNV DNA-A or by co-infection of DNA-A and DNA-β in Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）two weeks after agro-inoculation

注射GV3101-A和GV3101-β混合菌液的本氏煙心葉嚴(yán)重畸形，葉片向下卷曲（圖4），發(fā)病率為100%。注射GV3101-A 的植株與對(duì)照植株葉片形態(tài)正常，未顯示癥狀。與本氏煙試驗(yàn)結(jié)果類似，僅接種GV3101-A的雪茄煙植株葉片形態(tài)與對(duì)照差異不明顯，GV3101-A和GV3101-β混合接種雪茄煙植株心葉嚴(yán)重畸形、葉片向下卷曲，發(fā)病率為100%。結(jié)果表明SiYMCNV DNA-A侵染性克隆不能導(dǎo)致本氏煙和雪茄煙產(chǎn)生癥狀，而DNA-A和DNA-β混合侵染可導(dǎo)致本氏煙和雪茄煙產(chǎn)生與田間自然侵染植株類似的曲葉癥狀。GV3101-A接種煙草均可檢測(cè)到DNA-A特異性片段（728 bp），GV3101-A和GV3101-β混合接種煙草均可檢測(cè)到DNA-β特異性片段（808 bp）（圖5）。

圖5 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏煙（A）和雪茄煙（B）PCR檢測(cè)驗(yàn)證Fig.5 Confirmation of DNA-A infection or co-infection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）by PCR

3 討論

與煙草曲葉病毒病重要病原中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)）類似，SiYMCNV DNA-A 單獨(dú)侵染不能導(dǎo)致寄主植物表現(xiàn)癥狀，必須和DNA-β共同侵染才能導(dǎo)致煙草表現(xiàn)癥狀，DNA-β編碼的致病因子βC1蛋白與寄主植物相關(guān)基因的互作可能是發(fā)病植株葉片畸形的重要機(jī)制[4]。

煙粉虱傳播的曲葉病毒病是我國福建、云南、廣西等南方煙區(qū)重要的煙草病害[5-7]，海南由于以往煙草栽培面積較少，雙生病毒病主要報(bào)道在黃花稔[1]、勝紅薊[2]等雜草及甜瓜[8]上發(fā)生危害。海南是我國為數(shù)不多的適宜雪茄煙栽培的地區(qū)之一，其充沛的水熱條件為雙生病毒病及其媒介昆蟲煙粉虱的發(fā)生提供了適宜的生存及發(fā)生擴(kuò)散條件，隨著海南雪茄煙種植面積的增加，曲葉病毒病將成為威脅海南雪茄煙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害。本研究成功構(gòu)建了侵染海南雪茄煙的中國黃花稔曲葉病毒DNA-A及其伴隨的DNA-β侵染性克隆，DNA-A和DNA-β侵染性克隆可通過農(nóng)桿菌葉片注射高效侵染本氏煙和栽培雪茄煙H382。DNA-A和DNA-β復(fù)合侵染煙草表現(xiàn)典型的曲葉癥狀，這進(jìn)一步證實(shí)了中國黃花稔曲葉病毒是海南儋州雪茄煙曲葉病毒病的病原。SiYMCNV侵染性克隆的構(gòu)建為進(jìn)一步開展病毒致病機(jī)理和病原-媒介昆蟲-寄主互作等研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為快速篩選、鑒定抗SiYMCNV煙草種質(zhì)資源提供了簡(jiǎn)單、高效的技術(shù)手段。