祝文博，劉建榮，王永， 彭徐劍，劉雪峰*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江省塔河林業(yè)局林管理處森防站，黑龍江 塔河 165200； 3.南京森林警察學(xué)院，南京 210023)

0 引言

榆樹(shù)(UlmuspumilaL.)隸屬榆科 (Ulmaceae) 榆屬 (UlmusL.) 植物。又稱榆、白榆、榆樹(shù)。分布于東北、華北、西北及西南各省區(qū)。生于海拔1 000～2 500 m的山坡、山谷、川地、丘陵及沙崗等處。長(zhǎng)江下游各省有栽培, 也為華北及淮北平原農(nóng)村的習(xí)見(jiàn)樹(shù)木。朝鮮、蘇聯(lián)和蒙古也有分布[1]。榆樹(shù)木質(zhì)堅(jiān)硬，紋理清晰通直，花紋美麗，稍耐腐，是很好的建筑、家具和農(nóng)具材料。果、樹(shù)皮、葉和根可入藥，能安神、利尿，可治神經(jīng)衰弱、失眠及浮腫等癥。種子含油，可供食用和制肥皂[2]。同時(shí)榆樹(shù)因其生長(zhǎng)迅速、繁殖力強(qiáng)和適應(yīng)性廣，既耐寒冷、干旱、瘠薄，又耐鹽堿[3]，且榆樹(shù)樹(shù)干通直，樹(shù)形高大，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)快，是城市綠化、行道樹(shù)、庭蔭樹(shù)、廠綠化以及營(yíng)造防護(hù)林的重要樹(shù)種[4-5]。目前榆樹(shù)主要病害包括榆樹(shù)黑斑病、榆樹(shù)潰瘍病和榆樹(shù)紅疣枯枝病等[6-9]。這些病害常發(fā)生在苗圃、人工林、次生林、天然林和綠化園林樹(shù)木上。最終造成枯枝病狀,嚴(yán)重時(shí)可使病樹(shù)致死,此病是一種潛伏侵染性病害[10-12]。

本文研究的是在東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)發(fā)現(xiàn)的榆樹(shù)枯枝病，經(jīng)鑒定是由火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的，是危害榆樹(shù)的新病害。該病害主要危害一年到兩年生的下部枝條，且危害嚴(yán)重，導(dǎo)致大部分枝條枯死。經(jīng)調(diào)查下部枝條發(fā)病率約有20%，與此同時(shí)該種病害常與榆紫金花蟲(chóng)伴隨發(fā)生，一旦榆樹(shù)被榆柴金花蟲(chóng)蟲(chóng)害加重，導(dǎo)致榆樹(shù)抵抗力減弱，病原菌火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotronrhois)向上蔓延危害榆樹(shù)幼樹(shù)主干，致使榆樹(shù)全株枯死(圖1)?；诖?，本文對(duì)該病害的癥狀和病原菌形態(tài)學(xué)及分子鑒定，以期為生產(chǎn)單位防治該病提供參考。

Phaeobotryon由Theissen&Sydow(1915)建立，根據(jù)形態(tài)特征被認(rèn)為與Botryosphaeria是相近的。von Arx&Müller[13-14]認(rèn)為Phaeobotryon與Botryosphaeria為同屬異名。然而，最近的研究表明，Phaeobotryon在形態(tài)上和系統(tǒng)發(fā)育上與Botryosphaeria存在很大差異，所以這兩個(gè)屬是明確的獨(dú)立的屬[15-16]?；鹁鏄?shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)可以寄生在不同種木本植物上引起植物枯枝病。而在榆樹(shù)上發(fā)現(xiàn)的則是由火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的一種榆樹(shù)上的新病害。

圖1 野外榆樹(shù)枯枝病病枝Fig.1 The branch wilt pathogen of Ulmus pumila L.

注：A、B.野外發(fā)病榆樹(shù)枝；C、D.野外枯死的榆樹(shù)側(cè)枝。

Note: A、B. DiseasedUlmuspumilaL. branches in the wild; C，D. WitheredUlmuspumilaL. branches in the wild.

1 材料與方法

1.1 材料

2019年4月，從東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)觀察到榆樹(shù)枯枝病病害枝條，采集具有典型病癥的標(biāo)本用紙質(zhì)信封密封包好帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行病原菌觀察及病原菌分離。

1.2 方法

1.2.1 榆樹(shù)枯枝病病原菌分離培養(yǎng)

用75%的酒精棉擦拭發(fā)病榆樹(shù)枝條表面，用無(wú)菌刀切取榆樹(shù)發(fā)病枝條上帶有分生孢子器的發(fā)病組織為分離材料，在超凈工作臺(tái)下接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行病原菌分離。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2 d后，挑取菌落邊緣菌絲接種至PDA平板連續(xù)純化3次，并將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面試管中，放置4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 榆樹(shù)枯枝病的致病性測(cè)定

選取健康無(wú)病害粗細(xì)相等的榆樹(shù)枝條進(jìn)行離體水培培養(yǎng)。根據(jù)柯赫氏法則定，采取針刺接種、燒傷接種和無(wú)傷接種法進(jìn)行接種試驗(yàn)。在刺傷、燒傷和無(wú)傷處理的榆樹(shù)枝條上覆蓋直徑7 mm的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的該病害菌餅，用浸有無(wú)菌水的紗布和嫁接膜保濕培養(yǎng)48 h，重復(fù)10組。以針刺、燒傷和無(wú)傷接種無(wú)菌水做空白對(duì)照，各重復(fù)10組。將處理后的樹(shù)枝做好標(biāo)記室溫下培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.2.3 榆樹(shù)枝條枯病病原菌形態(tài)鑒定

取帶有榆樹(shù)枯枝病病原菌子實(shí)體的標(biāo)本進(jìn)行切片，制成臨時(shí)水載片，在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子器、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的形態(tài)特征及其大小。

1.2.4 榆樹(shù)枯枝病病原菌分子鑒定

將病原菌菌株接入PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，收集菌絲體，選取北京擎科生物有限公司生產(chǎn)的No.TSE0 11 200 rxns快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒(2×T5 Direct PCR Kit (Plant)) ，提取菌絲真菌基因組DNA。

rDNA-ITS區(qū)段分析采用通用序列引物ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4:(5′-TCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)樣品的 rDNA ITS1-ITS4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系，模板 DNA 1μL，引物各1μL，2×T5 Direct PCR Mix (Plant)25μL，滅菌 ddH2O定容至 50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：預(yù)熱 94 ℃、5 min，變性 94 ℃、30 s，退火 55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，補(bǔ)平 72 ℃、10 min;40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定

致病性測(cè)定結(jié)果表明，燒傷接種病原菌的榆樹(shù)枝條45 d后在接種的榆樹(shù)枝條上長(zhǎng)出了分生孢子器，其癥狀表現(xiàn)與野外采集的發(fā)病枝上癥狀相一致，將發(fā)病組織中分離的病原菌形態(tài)與野生型病原菌形態(tài)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與野生病原菌形態(tài)一致。刺傷、無(wú)傷接種病原菌和對(duì)照組均不發(fā)病(表1，圖2)。

表1 3種接種方法對(duì)榆樹(shù)離體枝條的接種情況

圖2 榆樹(shù)枯枝病實(shí)驗(yàn)室接種圖Fig.2 The branch wilt pathogen of Ulmus pumila L. in the laboratory

注：A.燒傷接種；B.刺傷接種；C.燒傷CK；D.刺傷CK；E.無(wú)傷CK。

Note: A. Burnt inoculatio; B. Scratch inoculation; C. Burnt CK; D. Scratch CK; E. No injury CK.

2.2 病原菌形態(tài)特征

對(duì)自然發(fā)病的榆樹(shù)枝條切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，分生孢子器初埋生，成熟后突破樹(shù)皮外露，黑色，表面扁球形，孢子成熟后從孔口噴出大量分生孢子并附著在樹(shù)皮表面成黑色。分生孢子器為單腔球形，分生孢子器外徑為350～ 450 μm，內(nèi)徑為188～275 μm。器壁黑色至無(wú)色，側(cè)面黑色器壁由12～20層細(xì)胞組成，無(wú)色器壁由6～11層細(xì)胞組成；產(chǎn)孢細(xì)胞由分生孢子器無(wú)色器壁細(xì)胞形成。產(chǎn)孢方式為全壁芽生單生式，產(chǎn)孢細(xì)胞之間有許多細(xì)長(zhǎng)的無(wú)色絲狀菌絲；分生孢子初期單胞、無(wú)色、短小、壁薄，成熟的孢子暗色、雙胞和分隔處縊縮、孢子近等大、孢子兩端鈍圓，偶有一端平截、大橢圓形。分生孢子大小為(22.5～27.5)μm ×(10.0～15.0)μm(n=50)(圖3)。該病原菌與Fan 等描述的Phaeobotryonrhois形態(tài)相似[17]。

圖3 榆樹(shù)枯枝病病原菌形態(tài)學(xué)特征Fig.3 The morphological characteristics of Phaeobotryon rhois

注： A.分生孢子器外觀；B.分生孢子附著在分生孢子器表面；C.分生孢子器縱切面；D.分生孢子器器壁；E.連有孢子的產(chǎn)孢細(xì)胞；F.分生孢子。

Note: A. The appearance of Pycnidium; B. Pycnidium with conidia; C. Pycnidium in section; D. Sporophores wall; E. Sporulation cell; F. Conidia.

榆樹(shù)枯枝病病原菌在PDA培養(yǎng)基上，菌落白色絨毛狀，7 d左右菌絲長(zhǎng)滿平板，菌落顏色開(kāi)始由白色變成黑色；在黑暗處培養(yǎng)10 d后，見(jiàn)光處理50 d后，培養(yǎng)基上出現(xiàn)分生孢子器，單生，球狀，埋生至半埋生，黑色。切片觀察其形態(tài)特征與野生型病原菌形態(tài)特征一致。

2.3 rDNA-ITS序列分析

將提取的病原菌(編號(hào)為Y1)rDNA-ITS基因片段測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)比結(jié)果顯示rDNA-ITS 段序列與菌種Phaeobotryonrhois(GenBank ID: MK072615.1)相似度為99.62%。并利用軟件MEGA 7 與 BLAST 結(jié)果中的近緣菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)中所提取的病原菌Y1與菌種Phaeobotryonrhois在一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，可信度為100 (圖4)。

圖4 菌株Y1與GenBank中相近菌株的 rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of rDNA-ITS sequence strain Y1 and similar strains in GenBank

3 結(jié)論與討論

根據(jù)柯赫氏法則、病原菌形態(tài)特征以及DNA分子比對(duì)，證明榆樹(shù)枯枝病是由火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的。根據(jù)資料記載該菌在自然寄主上產(chǎn)生的分生孢子器大小為180～380 μm (n= 20)，分生孢子大小為(19～25) × (10～12) μm (n= 50) 。比榆樹(shù)上發(fā)現(xiàn)的火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)的分生孢子器小2.5～3 μm，分生孢子幾乎相等。推測(cè)這些差異可能與其分布地區(qū)以及寄主的差異有關(guān)，但依據(jù)其主要形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)此菌為火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)，為國(guó)內(nèi)榆樹(shù)新病害。

在我國(guó)寧夏回族自治區(qū)地區(qū)發(fā)現(xiàn)了由火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)引起的火炬樹(shù)枯枝病[17]。而在哈爾濱地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)寄生在榆樹(shù)上的火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)。該種病害主要引起榆樹(shù)枯枝病，引起榆樹(shù)枝條的死亡枯萎。通過(guò)本文的研究發(fā)現(xiàn)，火炬樹(shù)暗葡腔菌(Phaeobotryonrhois)不是強(qiáng)侵染性病原菌，主要侵染衰弱的榆樹(shù)枝條。本文中對(duì)榆樹(shù)枯枝病病原菌的鑒定為該病防控提供了依據(jù)。