馮雅嵐 熊 瑛 張 均 原佳樂 蔡艾杉 馬 超

(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省旱地農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河南洛陽 471023)

真核生物體中,單個(gè)基因的前體mRNA(premRNA)可通過不同的剪切位點(diǎn)加工產(chǎn)生多個(gè)成熟mRNA亞型,這一過程稱為可變剪切(alternative splicing,AS)[1]。pre-mRNA的AS是真核生物中普遍存在的現(xiàn)象,這一復(fù)雜過程是由100～200個(gè)蛋白亞基組成的剪切體完成的,通過AS可以產(chǎn)生多種功能相似或完全不同的轉(zhuǎn)錄本亞型,不僅對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控十分重要,而且極大地增加了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性[2]。研究表明,AS在植物體生長(zhǎng)和發(fā)育過程均具有重要作用,如誘導(dǎo)開花[3]、響應(yīng)非生物脅迫等[2,4-5],表明增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的多樣性是植物應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)所必需的。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,在高等植物體內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的AS數(shù)量遠(yuǎn)超過預(yù)期,說明AS在植物體內(nèi)的作用和意義仍有待于進(jìn)一步探索。

1 AS的分子機(jī)理及作用模式

1.1 AS的分子機(jī)理

大多數(shù)真核生物基因是由外顯子和內(nèi)含子組成,其轉(zhuǎn)錄后的pre-mRNA需要經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄后修飾,才能形成成熟的mRNA,即內(nèi)含子被去除,外顯子連接在一起[6]。去除內(nèi)含子是真核基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟[7]。而AS則是通過識(shí)別pre-mRNA中不同的剪切位點(diǎn),以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能不同的mRNA以及蛋白質(zhì)變體的過程,是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要機(jī)制[8]。這種轉(zhuǎn)錄后修飾極大地增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性[2]。如人體中約95%的蛋白質(zhì)編碼基因的pre-mRNA均經(jīng)歷AS并產(chǎn)生成熟的mRNAs[9-10],擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11]和水稻(Oryza sativa)[12]中分別有超過60%和48%的pre-mRNA發(fā)生AS。

內(nèi)含子去除是由大分子復(fù)合物,即剪切體催化完成的,剪切體的核心部分由5個(gè)小核核糖蛋白顆粒(small nuclear ribonucleoprotein particles,snRNPs)(U1、U2、U4、U5和U6)和數(shù)百種對(duì)識(shí)別剪切位點(diǎn)至關(guān)重要的蛋白質(zhì)組成,這些蛋白質(zhì)以精確的順序聚集在內(nèi)含子上[13-14]。剪切位點(diǎn)的選擇不僅取決于核心剪切體組件,很大程度上還取決于一些RNA結(jié)合蛋白,如富含絲氨酸/精氨酸(serine/arginine-rich,SR)的蛋白質(zhì)和不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs),這2類蛋白分別結(jié)合于外顯子和內(nèi)含子的識(shí)別位點(diǎn),從而激活或抑制剪切[15]。SR蛋白家族成員具有1個(gè)模式結(jié)構(gòu),即N-末端結(jié)構(gòu)域,其包含 1～2個(gè) RNA識(shí)別序列(RNA recognition motif,RRM),C-末端包含1個(gè)絲氨酸/精氨酸(serine/arginine-rich,RS)結(jié)構(gòu)域[16]。這2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域具有不同的功能,RRM結(jié)構(gòu)域主要與RNA靶標(biāo)結(jié)合,而RS結(jié)構(gòu)域主要參與蛋白-蛋白互作,將核心剪切體組分招募到附近的剪切位點(diǎn)[15]。hnRNPs含有1個(gè)主要的RRM結(jié)構(gòu)域和一些輔助結(jié)構(gòu)域,如富含甘氨酸的序列和精氨酸-甘氨酸-甘氨酸盒。hnRNP通過識(shí)別內(nèi)含子的沉默序列從而抑制內(nèi)含子剪切,即內(nèi)含子保留的AS模式[17]。

1.2 AS的模式

AS在真核細(xì)胞中普遍存在,幾乎所有的多外顯子基因都可發(fā)生AS,當(dāng)剪切體識(shí)別到不同的剪切位點(diǎn)時(shí),就會(huì)出現(xiàn)AS,且有可能產(chǎn)生多種蛋白質(zhì),極大地提高了基因組的編碼能力[4]。目前已知4種主要的AS模式:外顯子跳躍、內(nèi)含子保留以及5′端 AS和3′端AS,不同的剪切模式產(chǎn)生不同的結(jié)果:盒式外顯子、保留的內(nèi)含子以及可變的5′端剪切和3′端剪切[4](圖1)。這些AS模式在不同的物種中發(fā)生的頻率并不相同,內(nèi)含子保留是植物中最常見的AS模式,而外顯子跳躍在動(dòng)物中占優(yōu)勢(shì)[18](表1)。

表1 AS不同模式在人和擬南芥中發(fā)生的頻率[2]Table 1 Frequency of different pattern of AS in humans and Arabidopsis[2] /%

這些不同頻率的AS模式對(duì)AS的具體功能有明確的影響。事實(shí)上,外顯子跳躍、5′端和3′端AS更容易產(chǎn)生功能變化的蛋白質(zhì),如改變氨基酸或C-末端,在框架內(nèi)添加或去除功能單位,都可能對(duì)蛋白產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位、結(jié)合性質(zhì)、活性或穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[19-21]。大多數(shù)內(nèi)含子保留模式則會(huì)在轉(zhuǎn)錄本內(nèi)插入提前終止密碼子(premature termination codon,PTC)[22],導(dǎo)致mRNA命運(yùn)存在差異。如果這個(gè)密碼子位于外顯子-外顯子連接區(qū)上游(超過50個(gè)核苷酸處),則該轉(zhuǎn)錄本將通過無義介導(dǎo)的衰變(nonsense-mediated decay,NMD)被降解,這是一種被認(rèn)為阻止截短和潛在有害蛋白質(zhì)積累的mRNA調(diào)控機(jī)制[23],AS和NMD均是真核生物中轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的調(diào)控機(jī)制。具有 PTC的mRNA可被翻譯成截短的蛋白質(zhì),其通常缺乏全長(zhǎng)蛋白質(zhì)所具有的一些活性結(jié)構(gòu)域。此外,截短的蛋白質(zhì)本身在某些生物進(jìn)程中可能同樣具有抵抗生物脅迫的功能[24-25]。

2 AS在植物發(fā)育中的作用

2.1 開花誘導(dǎo)

成花標(biāo)志著植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變,這一變化過程不僅受到內(nèi)部發(fā)育信號(hào)的調(diào)控,同時(shí)還受到外部環(huán)境信號(hào)的制約,如日照長(zhǎng)短、溫度、春化需求等[26]。春化是指冬季一年生植物在開花前必須經(jīng)歷一段時(shí)間的低溫方可開花[27],擬南芥中主要的開花調(diào)控基因位點(diǎn)FLOWERING LOCUS C(FLC)是開花的重要抑制因子,屬于MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族,其表達(dá)狀態(tài)直接影響著擬南芥的春化需求,而春化后植株中的FLC表達(dá)下調(diào)[28]。MADS ASSOCIATED FLOWERING1(MAF1)/FLOWERING LOCUS M(FLM)和MAF2是FLC的同源基因,其中MAF2參與識(shí)別短期的低溫,以避免植物在不適宜的溫度下提早開花[29]。短期低溫處理導(dǎo)致MAF2經(jīng)歷AS,且var1亞型轉(zhuǎn)錄本大量積累,推測(cè)其編碼1個(gè)抑制開花的全長(zhǎng)蛋白,而var2亞型的豐度則降低,推測(cè)其編碼1個(gè)截短的MAF2蛋白,但包含PTC的var2亞型功能尚不清楚[5]。另1個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子 SHORT VEGETATIVE PHASE(SVP),其AS亞型對(duì)植物開花具有不同影響,SVP亞型過量表達(dá)植株表現(xiàn)出不同的開花時(shí)間及發(fā)育進(jìn)程,這可能與其能和不同蛋白發(fā)生互作有關(guān)[21]；過量表達(dá)SVP1亞型的植株則表現(xiàn)出晚花性狀,表明其為開花抑制因子；而過量表達(dá)SVP3亞型的植株則開花正常,這可能是其缺少1個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作功能域所導(dǎo)致的[21]。Posé等[30]指出,拮抗型剪切變體在溫度依賴性開花時(shí)間控制中具有不同作用:較低溫度下SVP與MAF1/FLM-β型剪切變體互作進(jìn)而抑制開花,該變體含有MIKC蛋白互作結(jié)構(gòu)域；溫度升高后,另一剪切變體MAF1/FLM-δ與SVP互作,其包含可變的第3外顯子,由于DNA結(jié)合活性降低,SVP-MAF1/FLM-δ復(fù)合體作為失活的抑制子最終加速開花。成花整合因子SUPPRESSOROFCONSTANSOVEREXPRESSION1(SOC1)同樣經(jīng)歷了 AS,且其 AS亞型被 EARLY FLOWERING9(ELF9)蛋白靶向降解,ELF9蛋白具有2個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與釀酒酵母CUS2的RRM極為相似,而CUS2參與組裝U2 snRNP[31]。

2.2 晝夜節(jié)律(生物鐘)

植物利用生物鐘保證其生理過程在一天當(dāng)中能有序進(jìn)行[32]。晝夜節(jié)律網(wǎng)絡(luò)由中心振蕩器、信號(hào)輸入元件和信號(hào)輸出元件組成,而中心振蕩器的核心包括circadian clock associated1(CCA1)、late elongated hypocotyl(LHY)和timing of CAB expression1(TOC1)。CCA1和LHY是DNA結(jié)合蛋白,屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族,響應(yīng)光信號(hào)以參與植物的晝夜節(jié)律調(diào)控,通過結(jié)合TOC1啟動(dòng)子區(qū)域抑制其表達(dá)。這些組份通過反饋其自身基因的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生自持振蕩,而負(fù)向反饋回路由不同的機(jī)制控制,包括蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)翻轉(zhuǎn)、基因表達(dá)以及染色質(zhì)重塑,進(jìn)而維持24 h的周期[33]。在暴露于高光和低溫下的擬南芥中,分別檢測(cè)到了CCA1第4內(nèi)含子保留的AS亞型,其在高光下上調(diào),而在低溫下下調(diào)[34]。這一AS在單子葉植物二穗短柄草(Brachypodium distachyon)[35]和水稻[36],以及雙子葉植物楊樹(PopulusL.)[37]中均較保守,表明了其功能的重要性。擬南芥大多數(shù)的生物鐘基因均經(jīng)歷了AS,且在溫度變化過程中可觀察到明顯的AS動(dòng)態(tài)變化[38]。Seo等[39]預(yù)測(cè)擬南芥中CCA1的內(nèi)含子保留AS亞型可以產(chǎn)生1個(gè)C-末端具有二聚化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),其N-末端沒有DNA結(jié)合的MYB結(jié)構(gòu)域,該蛋白被命名為CCA1β；轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明,CCA1β會(huì)干擾CCA1和 LHY二聚體的形成,從而抑制其轉(zhuǎn)錄；而CCA1β的過量表達(dá)則導(dǎo)致短周期表型,這與cca1/lhy突變體中觀察到的結(jié)果一致,表明其為CCA1和LHY轉(zhuǎn)錄表達(dá)的抑制劑。低溫下約有10%～15%的轉(zhuǎn)錄本在經(jīng)歷AS后豐度增加,大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本不可編碼功能性蛋白,因而對(duì)蛋白水平有潛在影響,如LHY5′UTR第1內(nèi)含子保留的AS轉(zhuǎn)錄本,和/或可變的第5外顯子AS轉(zhuǎn)錄本在低溫處理下均通過NMD的方式發(fā)生翻轉(zhuǎn),最終導(dǎo)致功能性LHY蛋白水平的降低[38]。

AS是保證生物鐘正常運(yùn)轉(zhuǎn)所必需的,擬南芥中的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是決定晝夜節(jié)律的關(guān)鍵因子,prmt5突變體表現(xiàn)出長(zhǎng)期的子葉運(yùn)動(dòng)以及基因表達(dá)節(jié)律[40]。生物鐘基因PSEUDO-RESPONSE REGULATOR9(PRR9)的AS與PRMT5有密切關(guān)系,野生型的植株中可檢測(cè)到2個(gè)反向輕微振蕩的PRR9 AS亞型:1個(gè)是成熟的mRNA,另1個(gè)是第2外顯子末端具有8個(gè)額外核苷酸的亞型,這8個(gè)額外核苷酸是NMD的識(shí)別位點(diǎn),且第2種亞型編碼1個(gè)N-端截短的PRR9蛋白[40]。prmt5突變體中檢測(cè)到大量第3內(nèi)含子保留的AS亞型,而編碼全長(zhǎng)蛋白的mRNA則幾乎沒有,這表明prmt5突變體晝夜節(jié)律的紊亂是由PRR9剪切異常導(dǎo)致的[40]。苜蓿(Medicago truncatula)中的JMJC5(MtJMJC5)與擬南芥的生物鐘基因JMJ30/JMJD5高度同源,其響應(yīng)晝夜節(jié)律以及非生物脅迫。測(cè)序結(jié)果表明,MtJMJC5在低溫下特異經(jīng)歷AS,并產(chǎn)生4種AS亞型,包括1個(gè)全長(zhǎng)功能蛋白和3個(gè)具有PTC的變體,這些變體是由第1和第2內(nèi)含子經(jīng)歷3′端AS后產(chǎn)生的,而低溫下誘導(dǎo)的AS在溫度恢復(fù)正常后則消失。然而,目前尚未有關(guān)于擬南芥中的JMJ30/JMJD5經(jīng) AS的研究報(bào)道,據(jù)此推斷,MtJMJC5在RNA水平上的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能存在物種特異性,并可能對(duì)苜蓿的生物鐘和溫度波動(dòng)之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控[41]。

Hazen等[42]對(duì)擬南芥全基因組拼接陣列ATH1芯片綜合性分析表明,大部分轉(zhuǎn)錄組受到生物鐘的調(diào)控,并檢測(cè)到編碼和非編碼區(qū)內(nèi)含子的節(jié)律表達(dá)。大多數(shù)情況下,這些內(nèi)含子與相鄰的節(jié)律性外顯子同步表達(dá),產(chǎn)生了內(nèi)含子保留的AS亞型,極有可能產(chǎn)生截短的蛋白變體；另一方面,一些基因的內(nèi)含子表現(xiàn)出節(jié)律性,但外顯子表達(dá)卻不表現(xiàn)出節(jié)律性,說明AS對(duì)晝夜節(jié)律有調(diào)控作用。

3 AS在植物非生物脅迫響應(yīng)中的作用

研究表明AS廣泛存在于逆境脅迫下的植物中,對(duì)于增強(qiáng)植物的脅迫耐受性十分重要[4]。外顯子跳躍、內(nèi)含子保留,5′端AS和3′端AS這4種AS模式均能增加蛋白質(zhì)多樣性、誘導(dǎo)翻譯,并影響脅迫環(huán)境中植物mRNA的穩(wěn)定性[5](圖2)。已有報(bào)道指出,植物中的AS參與了非生物脅迫響應(yīng)的多個(gè)過程[5],如促分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在真核生物響應(yīng)環(huán)境變化中具有重要作用,水稻OsBWMK1是MAPK家族成員,在經(jīng)歷AS后可產(chǎn)生3種轉(zhuǎn)錄本亞型OsBWMK1L,OsBWMK1M和OsBWMK1S,其中OsBWMK1L轉(zhuǎn)錄本亞型在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期和逆境脅迫下表達(dá)穩(wěn)定,而OsBWMK1M和OsBWMK1S在正常情況下表達(dá)水平較低,但可被各種脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；對(duì)這3個(gè)亞型所編碼蛋白的亞細(xì)胞進(jìn)行定位分析,正常情況下,OsBWMK1L變體大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中,但經(jīng)脅迫處理后則轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,而OsBWMK1M和OsBWMK1S在胞質(zhì)和核中均可檢測(cè)到,表明OsBWMK1L變體可響應(yīng)外部脅迫信號(hào),并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,參與調(diào)節(jié)應(yīng)激響應(yīng)[43]。

3.1 溫度脅迫

AS通常會(huì)響應(yīng)植物的低溫脅迫[44],而大部分轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)都會(huì)在脅迫環(huán)境下經(jīng)歷AS。因此,AS被認(rèn)為是感知溫度變化和調(diào)節(jié)TFs活性的一種方式。

植物中低溫應(yīng)答基因的調(diào)控通常與AS相關(guān)[44]。低溫響應(yīng)期間,擬南芥中的AS出現(xiàn)在整個(gè)基因組范圍內(nèi),許多經(jīng)歷低溫誘導(dǎo)AS的基因在低溫響應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮作用。如擬南芥中的STA1和SRL1剪切因子,其突變體導(dǎo)致AS以及低溫敏感性/耐受性的變化,表明AS在調(diào)節(jié)低溫響應(yīng)中具有重要作用[45-46]。Egawa等[47]報(bào)道,小麥(Triticum aestivumL.)WDREB2基因與擬南芥DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN2(DREB2)基因同源,其可在低溫下通過外顯子跳躍的方式產(chǎn)生3種不同的轉(zhuǎn)錄本亞型,這3種亞型具有不同的表達(dá)模式,且轉(zhuǎn)錄本亞型的相對(duì)比率隨溫度變化而變化。此外,水稻的DREB2型基因OsDREB2B,也同樣通過 AS產(chǎn)生 2種亞型OsDREB2B1和OsDREB2B2,二者的積累受溫度的差異性調(diào)節(jié)[48]。苜蓿中的JMJC5基因(MtJMJC5)參與生物鐘及非生物脅迫,并在低溫誘導(dǎo)下發(fā)生AS,這種低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異AS,在溫度恢復(fù)正常后消失。測(cè)序結(jié)果表明,MtJMJC5在經(jīng)歷AS后會(huì)產(chǎn)生4種亞型,包括1個(gè)全長(zhǎng)功能蛋白和3個(gè)含有PTC的變體。推測(cè)MtJMJC5的低溫誘導(dǎo)性AS,很可能存在RNA水平上基因表達(dá)調(diào)控的物種特異性機(jī)制,并在苜蓿響應(yīng)環(huán)境溫度變化中發(fā)揮作用[41]。

熱激反應(yīng)是植物應(yīng)對(duì)高溫脅迫所進(jìn)化出的一種應(yīng)激反應(yīng),對(duì)增強(qiáng)植物體耐受性和保證其正常生長(zhǎng)具有重要作用[49]。作為熱激反應(yīng)的產(chǎn)物,熱激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factors,HSFs)主要參與蛋白合成、折疊、降解,以及與其他蛋白和信號(hào)分子發(fā)生互作等方式參與應(yīng)激反應(yīng)[50-51]。在番茄(Solanum lycopersicum)花粉中檢測(cè)到約7 500個(gè)基因發(fā)生內(nèi)含子保留和外顯子跳躍的AS,包括在植物熱激反應(yīng)中有關(guān)鍵作用的6個(gè)HSPs和29個(gè)HSFs[52]。為深入研究高溫脅迫下的AS及其作用,Kannan等[53]比較了模式植物擬南芥和高耐熱性加利福尼亞芥菜(Boechera depauperata)在高溫脅迫下的AS,結(jié)果顯示大量基因在高溫脅迫過程中經(jīng)歷AS并且差異表達(dá)。此外,對(duì)經(jīng)歷AS的基因功能類別的進(jìn)一步分析表明,2個(gè)物種中的功能基因富集模式不同。加利福尼亞芥菜中富集的基因主要包括光響應(yīng)基因和許多非生物脅迫應(yīng)答基因；而在擬南芥中富集的基因主要包括RNA加工和核苷酸結(jié)合,這些在加利福尼亞芥菜中并不包括。因此,這2種植物中AS對(duì)高溫脅迫響應(yīng)表現(xiàn)出顯著差異,且AS對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)存在物種特異性[53]。此外,對(duì)苔蘚(Physcomitrella patens)進(jìn)行的全基因組分析表明,高溫導(dǎo)致近50%的表達(dá)基因發(fā)生AS,其中內(nèi)含子保留的比例下降,外顯子跳躍則占據(jù)主導(dǎo),表明AS在響應(yīng)熱激時(shí)存在差異調(diào)節(jié)[54]。

3.2 滲透脅迫

滲透脅迫是植物生長(zhǎng)過程中易遭受的環(huán)境脅迫之一,干旱、鹽堿、低溫等都會(huì)造成滲透脅迫[55]。葡萄(Vitis vinifera)的葉和根中約有4%～7%的AS亞型在干旱和鹽脅迫下特異發(fā)生,并具有顯著的組織和品種特異性,其中內(nèi)含子保留發(fā)生的頻率最高[56]。Thatcher等[57]發(fā)現(xiàn),玉米(Zea maysL.)中干旱誘導(dǎo)的AS主要發(fā)生在葉和穗中,分別鑒定出1 060和932個(gè),分別占表達(dá)基因的6.2%和5.5%,均高于雄性花序中的AS,表明AS與組織類型以及脅迫條件密切相關(guān)。Ding等[58]對(duì)鹽脅迫擬南芥中AS的研究表明,不同濃度鹽處理后,約有49%的具有內(nèi)含子的基因均經(jīng)歷了AS,與未經(jīng)鹽脅迫處理相比,AS的數(shù)量顯著增加。此外,一部分AS并不受鹽脅迫的差異調(diào)節(jié),表明在脅迫響應(yīng)的基因調(diào)控中,AS可能是一個(gè)獨(dú)立的途徑。

擬南芥中的2個(gè)基因SRL1和RCY1,其編碼的蛋白屬于SR類剪切因子家族[59],并作為剪切體的組分參與組成型和/或AS的形成,以及pre-mRNA加工的其他階段,如耦合轉(zhuǎn)錄與 RNA轉(zhuǎn)錄后修飾[60-61]。Bourgon等[46]發(fā)現(xiàn)SRL1和RCY1可被鹽、干旱和其他脅迫激活,在擬南芥中過量表達(dá)后,可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽脅迫的耐受性。

DREB轉(zhuǎn)錄因子家族可誘導(dǎo)植物中多種抗逆基因的表達(dá),其中DREB2的表達(dá)主要由干旱激活[62]。Matsukura等[48]發(fā)現(xiàn)在干旱和高鹽脅迫的水稻中,OsDREB2受到 AS調(diào)控,產(chǎn)生 2種亞型的轉(zhuǎn)錄本OsDREB2B1和OsDREB2B2,其中OsDREB2B1是含有PTC的非功能性亞型,在正常條件下占主導(dǎo),而編碼具有轉(zhuǎn)錄激活活性蛋白功能的OsDREB2B2,在脅迫條件下被顯著誘導(dǎo),以促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)并增強(qiáng)植物在脅迫條件下的耐受性。此外,小麥WDREB2是OsDREB2B的直系同源基因,在低溫、干旱和鹽脅迫下均表現(xiàn)出類似的AS模式,這表明植物物種間AS調(diào)節(jié)具有保守性[63]。

4 TFs經(jīng)歷的AS在植物非生物脅迫響應(yīng)中的作用

TFs是植物生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分,并在生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[64]。通過在不同的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中調(diào)整信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,TFs可以保證植物在既定的條件下處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)[65-66]。

TF發(fā)生AS是一種重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,通過識(shí)別不同的剪切位點(diǎn)可產(chǎn)生多個(gè)亞型的轉(zhuǎn)錄本和功能蛋白質(zhì),此外,AS的作用也與其他基因調(diào)控機(jī)制有關(guān),如由小干擾肽(small interfering peptides,siPEPs)介導(dǎo)的肽干擾(peptide interference,PEPi)[67]。動(dòng)態(tài)二聚體的形成對(duì)TFs的調(diào)控特異性和功能可靠性十分重要,大多數(shù)TFs會(huì)形成同源二聚體或異源二聚體,從而增加了DNA特異結(jié)合的多樣性[68]。此外,二聚體的形成也是TFs負(fù)調(diào)控的基礎(chǔ),而TFs的負(fù)調(diào)控由一類siPEP介導(dǎo)[67]。siPEPs是一類特殊的蛋白質(zhì),具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),部分序列與一些TFs的序列相似；其具有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作所需的二聚化結(jié)構(gòu)域[67],該結(jié)構(gòu)域也是siPEPs與靶TF發(fā)生互作的前提,具有同源二聚化結(jié)構(gòu)域的TF為其靶標(biāo)；因此,由siPEPs競(jìng)爭(zhēng)干擾TF所產(chǎn)生的功能性二聚體的形成,這一調(diào)控機(jī)制被命名為PEPi[69]。AS與siPEP的產(chǎn)生密切相關(guān),部分TFs在經(jīng)歷AS后,產(chǎn)生無轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄本,但它們可以作為siPEP,通過與功能性TFs形成無功能的異源二聚體,建立獨(dú)特的自我調(diào)節(jié)回路[70]。大部分編碼TF的基因都會(huì)經(jīng)歷AS[4,21],AS被認(rèn)為是調(diào)節(jié)TF活性的一種方式,推測(cè)其通過將基因表達(dá)調(diào)控與PEPi和/或NMD機(jī)制耦連在植物的級(jí)聯(lián)信號(hào)中發(fā)揮作用[70]。

HSFs和HSPs是植物中重要的TFs,在熱脅迫的響應(yīng)過程中有關(guān)鍵作用,并對(duì)植物的耐熱性有顯著影響。HSFs在模式植物擬南芥和水稻中分別有21個(gè)和25個(gè)家族成員[71]。大多數(shù)HSFs具有共同的特征,即經(jīng)歷AS。這些蛋白具有保守的剪切位點(diǎn),在不同物種的HSF基因進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用[72]。相比其他物種,植物中包含更多的功能HSFs,原因之一是植物HSFs在經(jīng)歷AS后還會(huì)發(fā)生特化作用,最終形成不同的HSFs[54]。HSFs家族成員HSFA2的AS調(diào)控在苔蘚、紫花苜蓿、擬南芥和水稻中已得到廣泛研究[54,72-74]。這些結(jié)果表明HSFA2均經(jīng)歷了AS,說明這一轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制在植物中較保守。高溫誘導(dǎo)的HSFB2a參與了擬南芥雌性器官的發(fā)育,并能抑制HSFA2活性[75]。 Lee等[76]證實(shí),甘藍(lán) (Brassica oleraceaL.)的HSFB2a(BoHSFB2a)在高溫脅迫下會(huì)產(chǎn)生2種AS亞型,這不僅增加了對(duì)BoHSFB2a轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性,也可能是高溫耐受型甘藍(lán)自交系具有較高耐熱性的原因。

5 展望

圖2 不同模式AS在植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的主要作用[4]Fig.2 Scheme of the main effects of the different patterns of alternative splicing in the plant development and response to stress[4]

AS是植物調(diào)控基因互作網(wǎng)絡(luò)的重要分子機(jī)制,主要在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)植物發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)進(jìn)行調(diào)控[30,77]。一些重要的脅迫響應(yīng)基因在響應(yīng)逆境脅迫過程中經(jīng)歷的AS在不同植物物種中表現(xiàn)出保守性,如HSFA2和DREB2B是關(guān)鍵的非生物脅迫調(diào)控因子,在熱脅迫和干旱脅迫下的擬南芥和水稻中,二者均經(jīng)歷了AS,以增強(qiáng)植物的脅迫耐受性；此外,HSFA2和DREB2B在小麥中的同源基因同樣表現(xiàn)出保守的AS模式[48,74]。近年來,已有研究揭示了部分AS的功能和分子機(jī)制,取得了顯著進(jìn)展,但仍處于研究的初級(jí)階段。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,越來越多的植物基因組序列和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),為物種、組織、發(fā)育階段以及環(huán)境特異調(diào)控AS的鑒定提供了技術(shù)支撐,同時(shí)也有助于確定AS在不同發(fā)育階段、環(huán)境條件和脅迫下的動(dòng)態(tài)變化,以及在不同生態(tài)型和多倍體中,AS模式的差異如何影響植物物種的適應(yīng)性。因此,研究植物中不同發(fā)育階段、環(huán)境條件下AS的作用模式,明確其調(diào)控位點(diǎn),將有助于理解AS作用的分子機(jī)制,同時(shí)有利于更加全面地了解AS對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)以及增強(qiáng)植物脅迫耐受性的機(jī)理。

關(guān)于AS研究中另一個(gè)關(guān)鍵問題是,由AS產(chǎn)生的剪切變體可能增加了蛋白質(zhì)的數(shù)量,但目前尚不明確在植物和動(dòng)物中,剪切變體的哪些部分對(duì)功能性蛋白質(zhì)多樣性有影響。除了增加蛋白質(zhì)的多樣性,AS還是調(diào)控基因表達(dá)的重要因素,主要通過在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn),而由NMD、小非編碼RNA和其他機(jī)制介導(dǎo)的AS亞型對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的比例尚不清楚。盡管已有許多報(bào)道指出AS在植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)中有重要作用,但分析個(gè)體mRNA亞型的功能有助于理解AS在植物生長(zhǎng)發(fā)育,應(yīng)激反應(yīng)中的重要作用[78]。一些基因在經(jīng)歷AS后,其產(chǎn)物會(huì)影響其他基因的AS,而后者可能會(huì)反作用于前者以增強(qiáng)并放大響應(yīng)脅迫的信號(hào)流,因此,需要進(jìn)一步研究以闡明發(fā)育和環(huán)境信號(hào)如何轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活A(yù)S進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)[70]。AS在植物發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程中有重要調(diào)控作用,研究其模式及作用機(jī)理對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程調(diào)節(jié)和優(yōu)良抗逆性品種的選育具有重要指導(dǎo)意義。