馮文奇 孫福艾 丁 磊 郭 新 李晚忱 付鳳玲 于好強

(四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所,四川溫江 611130)

油菜素內(nèi)脂(brassinosteroid,BR)是植物特有的甾體激素,在植物生長發(fā)育及逆境應答中發(fā)揮重要作用。BR生物合成或信號轉(zhuǎn)導相關基因突變會導致植株出現(xiàn)矮化、開花延遲、衰老等一系列缺陷表型[1-2]。研究表明,外源施用BR能提高作物的抗逆能力[3-4],增加作物產(chǎn)量[5-6]。高溫條件下,BR處理可保護小麥(Triticum aestivum)葉片中蛋白正常合成[7]；鹽脅迫下,BR處理可降低植物葉片細胞核和葉綠體的損害,削弱鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用[8]。此外,BR處理可增強水稻(Oryza sativa)和煙草(Nicotiana tabacum)對稻瘟病和白葉枯病的抗性[5],且BR能夠促進光合作用,增加植株葉面積和可溶性蛋白的含量,增加產(chǎn)量[9]；弱光條件下,外源BR可顯著提高光化學效率、抗氧化酶活性,緩解弱光對幼苗的傷害[10]。

BR被其受體BRASSINOSTEROID INSEN-SITIVE 1(BRI1)、BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE1(BAK1)等激酶接受后,經(jīng)過信號級聯(lián)傳遞,可調(diào)節(jié)BRI1 EMS SUPPRESSOR 1(BES1)及其同源蛋白BRASSINAZOLE RESISTANT 1(BZR1)的活性[11]。研究證實,BES1/BZR1是BR信號轉(zhuǎn)導途徑的唯一轉(zhuǎn)錄因子[12],二者相似性達88%,N端結構域相似性高達97%,均含有bHLH結構[13]。BES1/BZR1接受BR信號后,特異性結合到其靶基因啟動子區(qū)的 E-box(CANNTG)或BRRE元件(CGTGT/CG),調(diào)控靶基因的表達,進而調(diào)控生長發(fā)育[14-15]。

模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻中,BES1/BZR1作用機制及其在BR信號通路較為明確。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn),BES1/BZR1活性受可逆磷酸化調(diào)控,去磷酸化的BES1/BZR1進入細胞核調(diào)控靶基因表達,而磷酸化的BES1/BZR1進入細胞質(zhì)發(fā)生降解。除介導BR信號,BES1/BZR1還參與脫落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素(gibberellin,GA)、光信號等信號轉(zhuǎn)導途徑。BES1抑制ABA響應因子ABI3編碼基因表達,ABI3直接作用于ABI5轉(zhuǎn)錄因子,抑制ABA信號轉(zhuǎn)導[17-18]。BES1/BZR1直接結合到GA合成關鍵基因GA20ox-2、GA3ox-2、GA2ox-3啟動子區(qū)的 E-box或BRRE元件,調(diào)控其表達,進而調(diào)節(jié) GA合成[19]。BES1/BZR1直接與GATA2互作并抑制其轉(zhuǎn)錄,促進下胚軸伸長,影響光形態(tài)建成[20-21]。此外,BES1/BZR1抑制RD26基因表達,而RD26蛋白又與BES1/BZR1蛋白結合,抑制其在干旱脅迫下的調(diào)節(jié)功能[22]。然而,在玉米(Zea mays)中,除個別BR合成基因及受體編碼基因功能被鑒定外[23-25],鮮有ZmBES1/BZR1基因的研究報道。

在前期研究中,Yu等[26]鑒定到玉米基因組中有11個ZmBES1/BZR1轉(zhuǎn)錄因子,依次命名為ZmBES1/BZR1-1～ZmBES1/BZR1-11,其中ZmBES1/BZR1-7定位于葉綠體。本研究從B73克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,并對其序列、表達模式、轉(zhuǎn)錄激活活性及靶基因進行分析,初步探究其功能,以期為后續(xù)深入研究ZmBES1/BZR1-7的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及前處理

試驗材料為玉米自交系B73,由四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所提供。B73種子通過Hoogland營養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉一心期后,分為3組:試驗組1,選取10株幼苗用于DNA提?。辉囼灲M2和試驗組3選擇長勢一致的幼苗各60株,分別用16%PEG-6000和100 mmol·L-1NaCl處理,在處理 0、3、6、9、12、24 h 時,分別取葉片和根系,研磨后液氮速凍并于-70℃保存,備用。

1.2 DNA、RNA提取及ZmBES1/BZR1-7基因擴增

采用CTAB法提取總DNA,用RNA提取試劑盒(Takara公司,大連)提取各樣品總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Primer5設計擴增ZmBES1/BZR1-7全長引物 B7-F1:5′-ATGACGTCGGGAGCGGCGGCG-3′；B7-R1:5′-TCACTTGGCGCCGACGCCGAG-3′和擴增開放閱讀框(open reading frame,ORF)引物 B7-F2:5′-CCACCCACC ACCCCTCCATCAA-3′；B7-R2:5′-GGTCTCACAGCAAT CGTCTCCTACTCCC-3′。用總 DNA作模板,擴增ZmBES1/BZR1-7全長,以 cDNA為模板擴增 ORF。PCR 擴增體系:2×PrimeSTAR Buffer(Mg2+)12.5 μL,dNTPmix 2.0 μL,上游引物 0.5 μL,下游引物 0.5 μL,DNA 0.5 μL,PrimeSTAR 0.25 μL,ddH2O 8.72 μL。擴增程序:94℃預變性3 min；98℃變性10 s；66℃退火10 s；72℃ 延伸 50 s；35 個循環(huán)；72℃ 再延伸 5 min；12℃保存。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離,150Ⅴ·cm-1電泳30 min。將目的條帶切割并用膠回收純化試劑盒進行回收,并連接至亞克隆載體pMD19-T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,PCR鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。

1.3 ZmBES1/BZR1-7結構域及同源性分析

用DNAMAN比對克隆到的CDS和gDNA序列分析內(nèi)含子和外顯子結構。利用軟件MEGA6比對ZmBES1/BZR1-7與擬南芥和水稻中BES1/BZR1氨基酸序列,并構建進化樹分析同源性。

1.4 脅迫處理下ZmBES1/BZR1-7的表達模式分析

采用Primer5設計ZmBES1/BZR1-7表達檢測引物,序列為 qB7-F:5′-GAAGAGCACCCGGACACCAT-3′；qB7-R:5′-GCCCCGATCTGGAAGCTGAT-3′,擴增片段長98 bp。以玉米ZmGAPDH作為內(nèi)參,其擴增引物序列為 qG-F:5′-CCATCACTGCCACACAGAAAAC-3′；qG-R:5′-AGGAACACGGAAGGACATACCAG-3′,擴增片段長170 bp。采用 SYBR green法在 CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad公司,美國)進行RT-qPCR。擴增體系為 10 μL:SYBR Premix Ex TaqⅡ(TakaRa 公司,大連)5 μL,上、下游引物各 0.4 μL,模板 1 μL,ddH2O 3.2 μL。 反應程序:95℃預變性 15 min；95℃變性 5 s；61.1℃退火 30 s,39個循環(huán)。采用 2-△△CT法分析ZmBES1/BZR1-7相對表達量。

1.5 ZmBES1/BZR1-7激活活性鑒定

采用Primer5設計ZmBES1/BZR1-7的ORF擴增引物,在上下游引物分別引入pGBKT7多克隆位點側(cè)翼序列為B7-F:5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATG ACGTCGGGAGCGGCG-3′；B7-R:5′-TCGACGGATCCC CGGGAATTCTCACTTGGCGCCGACGCC-3′,參照1.2 方法及體系進行擴增并純化回收。用EcoRI和NdeⅠ限制性內(nèi)切酶切割pGBKT7載體,使其線性化并純化回收。采用同源重組酶Soso Mix Kit構建ZmBES1/BZR1-7的酵母表達載體pGBKT7-ZmBES1/BZR1-7。將pGBKT7-ZmBES1/BZR1-7和pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株作為試驗組,pGBKT7-53和pGADT7-T同時轉(zhuǎn)化酵母作為陽性對照,pGBKT7-lam和pGADT7-T同時轉(zhuǎn)化酵母作為陰性對照,空載體 pGBKT7和pGADT7共同轉(zhuǎn)化酵母作為陰性對照。轉(zhuǎn)化后的酵母涂布在二缺SD/-Leu/-Trp和三缺SD/-Trp/-Leu/-His培養(yǎng)基上,28℃倒置培養(yǎng)3 d,觀察菌落生長狀況,分析ZmBES1/BZR1-7激活活性。

1.6 共相關分析

轉(zhuǎn)錄激活因子結合其靶基因的啟動子后,調(diào)控靶基因表達,共相關分析可初步篩選轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。從MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org)下載B73的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用R語言編寫程序,將ZmBES1/BZR1-7與玉米其他基因的FPKM值進行Spearman和Pearson相關性分析,選擇相關系數(shù)大于0.6或者小于-0.6的基因作為ZmBES1/BZR7的候選靶基因。隨后在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫下載候選基因起始密碼子(ATG)上游2 000 bp序列,分析這些啟動子區(qū)域是否包含ZmBES1/BZR1結合基序(E-box或BRRE元件)。利用在線軟件AGRiGO(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php)查找候選基因GO號,利用在線基因GO功能富集數(shù)據(jù)庫WEGO(http://wego.ges.orgnomic.cn/)進行基因功能注釋分類。

2 結果與分析

2.1 玉米ZmBES1/BZR1-7基因的克隆和序列分析

以cDNA和總DNA為模板對ZmBES1/BZR7進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物大小一致,介于750～1 000 bp之間,測序證實其gDNA序列無內(nèi)含子,ORF長度為975 bp(圖1),GenBank登錄號:ASX95006[23]。

2.2 玉米ZmBES1/BZR1-7蛋白的同源性及進化分析

圖1 ZmBES1/BZR1-7基因的擴增Fig.1 The amplification of ZmBES1/BZR7 gene

比對擬南芥、水稻BES1/BZR1與ZmBES1/BZR1-7氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)玉米ZmBES1/BZR1-7蛋白的N端高度保守且具有BES/BZR1典型的bHLH結構(圖2),此結構是 BES1/BZR1結合靶基因的關鍵部分[27-28]。進化樹分析表明,ZmBES1/BZR1-7與水稻BES1/BZR1家族具有較高的同源性,與擬南芥BES1/BZR1同源性較低,其中與水稻OsBZR1-1的同源性高達 75.95%(圖 3)。

圖2 ZmBES1/BZR1-7蛋白多序列比對Fig.2 Multiple alignment of ZmBES1/BZR1-7 protein

2.3 滲透、鹽脅迫條件下ZmBES1/BZR1-7的表達分析

16%PEG-6000脅迫處理12 h時,玉米葉片中ZmBES1/BZR1-7表達極顯著上調(diào),是對照(CK)的17.8倍；而玉米根中ZmBES1/BZR1-7表達在16%PEG-6000脅迫處理3 h時極顯著下調(diào),在脅迫處理24 h 時極顯著上調(diào)(圖 4-A、B)。 100 mmol·L-1NaCl脅迫處理12 h時,玉米葉片中ZmBES1/BZR1-7表達極顯著上調(diào),是CK的19.8倍；根中ZmBES1/BZR1-7表達在100 mmol·L-1NaCl脅迫處理1 h時極顯著上調(diào),隨后降低,但在脅迫處理 9、12 h時,ZmBES1/BZR1-7表達又顯著上調(diào)(圖4-C、D)。上述結果表明,玉米ZmBZR1/BES1-7基因的表達受滲透和鹽脅迫誘導,其可能參與干旱與鹽脅迫應答過程。

圖3 ZmBES1/BZR1-7的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of ZmBES1/BZR1-7

2.4 轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將pGBKT7-ZmBES1/BZR1-7和pGADT7轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109后,涂布于SD/-Leu/-Trp和SD/-Trp/-Leu/-His培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)。結果顯示,在二缺培養(yǎng)基上,陽性組(pGBKT7-53+pGADT7-T)、陰性組(pGBKT7-lam+pGADT7-T、pGBKT7+pGADT7)及試驗組菌落均可以正常生長,說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。在三缺培養(yǎng)基上,陽性組和試驗組菌落生長且變?yōu)樗{色,說明ZmBES1/BZR1-7具有轉(zhuǎn)錄激活活性(圖5)。

2.5 共相關分析ZmBES1/BZR1-7的候選靶基因

共相關分析表明,玉米中有72個基因的表達與ZmBES1/BZR1-7表達相關性較高,相關系數(shù)大于0.6。其中,有35個候選基因被注釋,主要涉及細胞、細胞組成成分、細胞過程及細胞生理代謝等過程(圖6)。啟動子序列分析發(fā)現(xiàn),這35個基因的啟動子區(qū)域均大量ZmBES1/BZR1-7結合基序E-box或BRRE元件,最少有2個,最多達17個。推測這些基因可能是ZmBES1/BZR1-7調(diào)控的靶基因。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),ZmBES1/BZR1-7基因在玉米葉中受滲透和鹽脅迫誘導表達,其可能調(diào)控的靶基因中包括很多與葉綠體發(fā)育、光合作用等參與光信號途徑的基因,如葉綠素合成酶基因(GRMZM2G177432)、PPR(pentatricopeptiderepeat)家族蛋白編碼基因(GRMZM2G336888)、光信號響應因子基因GATA15(GRMZM2G701448)等,推測 ZmBES1/BZR1-7蛋白可能主要在玉米葉中發(fā)揮作用,且參與應答滲透和鹽脅迫過程。已有研究發(fā)現(xiàn),油菜(Brassica campestris)中,大多數(shù)BcBES1/BZR1基因被干旱和鹽脅迫誘導顯著上調(diào)表達,個別成員受干旱和鹽脅迫抑制[29]。桉樹(Eucalyptus robusta Smith)中,ErBES1/BZR1基因的表達被鹽脅迫顯著抑制[30]。Fisk等[31]研究發(fā)現(xiàn),PPR家族成員CRP1蛋白調(diào)控葉綠體相關基因pctA和pctD的表達,進而影響葉片發(fā)育。Yu等[26]研究表明,ZmBES1/BZR1-7蛋白定位于葉綠體。以上結果進一步表明,ZmBES1/BZR1-7基因可能參與滲透和鹽脅迫下葉綠體發(fā)育和光信號途徑,進而調(diào)控玉米應答滲透和鹽脅迫。在擬南芥中,BES1/BZR1可促進轉(zhuǎn)錄因子CBF(C-repeat binding factor)和 WRKY6,以及 ABA受體PYL6等的編碼基因表達,并與WRKY54轉(zhuǎn)錄因子直接互作,正調(diào)控擬南芥的耐寒性,負調(diào)控其耐旱性[32-33]。且BES1/BZR1通過拮抗NAC家族的RD26轉(zhuǎn)錄因子,抑制其在干旱應答方面的調(diào)節(jié)功能[22]。在小麥中,BES1/BZR1可促進谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)硫酶編碼基因GST1表達,介導超氧陰離子清除和增強抗氧化酶活性,進而增強小麥的耐旱性[34]。此外,BES1/BZR1調(diào)節(jié)下游靶基因的表達,調(diào)控植物對高溫、低氮、低磷等脅迫的耐受性[35-37]。綜上表明,BES1/BZR1轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物應答逆境過程中發(fā)揮重要作用,推測玉米ZmBES1/BZR1-7可能通過調(diào)控葉綠體發(fā)育相關基因表達或介導光信號途徑,進而調(diào)控干旱及鹽脅迫應答過程。因此,后續(xù)研究需進一步證實此假設,并明確ZmBES1/BZR1-7調(diào)控滲透和鹽脅迫應答機制。

圖4 ZmBES1/BZR1-7的表達模式Fig.4 The expression pattern of ZmBES1/BZR1-7

圖5 ZmBES1/BZR1-7的轉(zhuǎn)錄激活分析Fig.5 Transcription activation ability assay of ZmBES1/BZR1-7

表1 與ZmBES1/BZR1-7表達共相關的候選靶基因Table 1 The candidate target genes of co-correlated with ZmBES1/BZR1-7 expression

表1(續(xù))

圖6 候選靶基因的功能注釋分類Fig.6 Functional annotation classification of candidate target genes

4 結論

本研究從玉米自交系B73中克隆到ZmBES1/BZR1-7基因,其表達受滲透(16%PEG-6000)和鹽脅迫(100 mmol·L-1NaCl)顯著誘導。 ZmBES1/BZR1-7氨基酸序列含有一個BES1/BZR1高度保守的bHLH結構域,與水稻OsBZR1-1具有較高的親緣關系。進一步分析發(fā)現(xiàn),ZmBES1/BZR1-7是轉(zhuǎn)錄激活因子,且分析篩選到72個ZmBES1/BZR1-7可能調(diào)控的候選靶基因。綜上所述,ZmBES1/BZR1-7參與滲透和鹽脅迫應答,與葉綠體發(fā)育及光信號途徑相關。本研究結果為深入解析ZmBES1/BZR1-7的功能奠定了基礎。