楊 洪，田 浪，張升波，張喜懿，溫貴蘭*，程振濤，王開功，周碧君

(1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550016)

DEAD-box家族蛋白是一類ATP依賴的RNA解旋酶，在RNA代謝的過程中發(fā)揮重要作用[1]，可通過調(diào)節(jié)和抑制癌基因的表達(dá)及腫瘤相關(guān)信號通路等影響細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，進(jìn)而發(fā)揮促癌或抑癌的作用[2]。有研究顯示，DDX3X基因特異突變可導(dǎo)致發(fā)育障礙和智力殘疾或發(fā)育遲緩等現(xiàn)象[3]，并且可能影響女性和男性之間疾病傳播和表型變異，DDX3X對正常發(fā)育和疾病具有劑量依賴性和性別特異性影響。有研究報道，在胚胎發(fā)育過程中，靶向敲除小鼠DDX3X基因后，導(dǎo)致外胚層廣泛凋亡和異常生長，最終胚胎發(fā)生消融并且死亡[4]。DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的亞家族，其具有9個保守結(jié)構(gòu)域，因motifyⅡ的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD)而命名[4]。DEAD-box解螺旋酶蛋白家族在各種生物體內(nèi)普遍存在并且結(jié)構(gòu)上高度保守，主要包括DEAD-box RNA解螺旋酶和DEAD-box DNA解螺旋酶2大類[5]，而DDX3X是通過利用ATP產(chǎn)生的能量結(jié)合或者重塑RNA以及核糖核蛋白復(fù)合體的RNA解螺旋酶，其作為DEAD-box RNA解螺旋酶蛋白家族中重要成員而被廣泛研究[6]。DDX3X參與許多病毒的復(fù)制過程，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)等[7-8]。

猴源腎細(xì)胞源于恒河猴腎上皮樣細(xì)胞，其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)易感[9]?；贒DX3X基因的關(guān)鍵生物學(xué)功能，研究擬克隆猴源DDX3X基因，并分析其序列特征及蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)域，旨在為后續(xù)深入研究猴源DDX3X基因與病毒間的相互作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×Es Tag Master Mix 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，2 000 bp DNA marker、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、 Xho I和pMD19-T載體購自寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2 儀器 供試儀器為PCR儀(ABI公司)、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)和凝膠成像系統(tǒng)(Gene公司)。

1.1.3 實驗細(xì)胞 猴源腎細(xì)胞和DH5α感受態(tài)細(xì)胞由貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI公布的豬源DDX3X基因序列(登錄號HQ266638)設(shè)計特異性引物，上游引入EcoR I、下游引入Xho I作為酶切位點。上游引物(DDX3X-EcoR I-F)為GAATTCATGAGTCATGTGGCGGTGG，下游引物(DDX3X-Xho I-R )為CCCTCGAGAGTTGCCCCACCAGTCAAC，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 猴源腎細(xì)胞培養(yǎng)、總RNA提取及cDNA合成 將復(fù)蘇的猴源腎細(xì)胞于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待其匯合度為90%～100%時，用預(yù)冷無菌PBS清洗3次，加入1 mL Trizol于冰上裂解10 min，參照RNA提取步驟獲得總RNA，并取1 μL用DNA2000檢測純度。根據(jù)試劑盒說明書，取2 000 ng總RNA配置20 μL反轉(zhuǎn)錄體系。將反應(yīng)體系先在42℃孵育40 min,然后轉(zhuǎn)入80℃水浴鍋繼續(xù)孵育5 min后置于-20℃冰箱終止反應(yīng)并保存。

1.2.3 猴源DDX3X基因擴(kuò)增 以猴源腎細(xì)胞cDNA為模板，構(gòu)建20μL PCR反應(yīng)體系(2×Es Taq Master Mix10μL,DDX3X-EcoR I-F 0.5μL,DDX3X-Xho I-R 0.5μL,模板2μL，滅菌水7μL)，并在PCR儀中94℃ 預(yù)變性4 min；94℃ 變性40 s，54℃ 退火30 s，72℃ 終止1 min，35個循環(huán)；在72℃孵育10 min終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用1.2%瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.4 猴源DDX3X基因克隆及鑒定 根據(jù)目的基因序列大小，切割特異性條帶，運用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物于pMD-19T載體16℃水浴鍋連接過夜(膠回收產(chǎn)物4.5μL，pMD-19T 0.5 mL,Solution I 5μL)。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中(冰浴30 min，42℃熱激90 s,冰浴3 min,加入900μL LB培養(yǎng)液，于37℃ 160 r/min搖床搖1.5 h,5 000 r/min,離心5 min，取200 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16～24 h),挑取4個單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定。反應(yīng)體系為：重組質(zhì)粒8 μL，10×Buffer 2 μL,EcoR I 1 μL,EcoR I,Xho I 1 μL,滅菌水8 μL。

1.2.5 猴源DDX3X基因序列及蛋白質(zhì)特性分析 使用Megalign及MEGA6軟件進(jìn)行基因同源性比對及遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建，參照在線軟件Protpara(https: //web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析猴源DDX3X蛋白理化性質(zhì)，SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.PL)分析猴源DDX3X蛋白的功能結(jié)構(gòu)域；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.PLpage= npsa_sopma.html)分析猴源DDX3X蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISS MODEL(http://swiss model.expasy.org/interactive)分析猴源DDX3X蛋白的三級結(jié)構(gòu)；STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預(yù)測分析DDX3X蛋白的相互作用蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴源DDX3X基因PCR擴(kuò)增

以猴源腎細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，在2 000 bp左右出現(xiàn)單一目的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符合。

注：M:DL2000 Marker；1:猴源DDX3X基因。

Note: M,DL 2000 Marker; 1,monkeyDDX3Xgene.

圖1 猴DDX3X基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification of monkeyDDX3Xgene

2.2 猴源DDX3X基因克隆及鑒定

在培養(yǎng)的4個菌落中，3個菌液出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性目的條帶。選擇1號菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切結(jié)果出現(xiàn)2 000 bp左右目的條帶與載體條帶(圖2)。將已鑒定的陽性質(zhì)粒送華大基因有限公司測序，測序結(jié)果顯示，猴源DDX3X基因核苷酸序列大小為1 989 bp(圖3)。

注：M:DL2000 Marker； 1、2、3、4均為猴源DDX3X基因。

Note: M,DL 2000 Marker; 1～4,monkeyDDX3Xgene

圖2 猴源DDX3X基因克隆菌液PCR鑒定

Fig.2 PCR identification of monkeyDDX3Xgene

2.3 猴源DDX3X基因氨基酸序列分析

將測序所得猴源DDX3X氨基酸序列與GenBank中不同物種的DDX3X氨基酸進(jìn)行同源性比，結(jié)果(圖4)顯示，猴源DDX3X氨基酸序列與獼猴同源性最高，為99.6%；與人、亞馬遜松鼠猴、貓頭鷹猴的同源性次之，分別為98.9%、98.2%和97.8%；與馬、虎、犬、家貓、綿羊、野豬、牛、家兔、大熊貓等的同源性為91.2%～95.9%；與雞、蛇、魚、鴨、雁等的同源性為57.5%～77.3%。猴源DDX3X與哺乳動物的同源性較高，較為保守；而與非哺乳動物同源性相對較低。通過遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建(圖5)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，猴源DDX3X氨基酸序列與獼猴處于同一分支，親緣關(guān)系最近。

注：M:DL5000 Marker；1：重組質(zhì)粒雙酶切；2：空載體酶切鑒定。

Note: M,DL 5000 Marker; 1,double enzyme digestion of recombinant plasmid; 2,enzyme digestion identification of empty carrier

圖3 猴源DDX3X基因重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of monkeyDDX3Xrecombinant plasmid by double enzyme digestion

圖4 猴源DDX3X氨基酸同源性比對

圖5 猴源DDX3X氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 猴源DDX3X蛋白理化性質(zhì)

蛋白理化性質(zhì)分析顯示，猴源DDX3X基因共編碼662個氨基酸，理論蛋白分子質(zhì)量為73 243.42 kDa，蛋白分子式為C3189H4962N938O1008S21，總原子數(shù)10 118個，理論等電點為6.73。猴源DDX3X蛋白是由20種氨基酸(甘氨酸含量最高，為11.5%)組成的脂溶性不穩(wěn)定蛋白。

2.5 猴源DDX3X蛋白高級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，猴源DDX3X蛋白二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占50.45%和28.4%；而β-折疊及β-轉(zhuǎn)角的占比較少，分別為14.2%和6.95%。通過三級結(jié)構(gòu)模型進(jìn)一步表明該蛋白以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主(圖6)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測相符。

圖6 DDX3X蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型

Fig.6 Protein tertiary structure model of monkeyDDX3Xgene

2.6 猴源DDX3X蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測

蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果(圖7)表明，猴源DDX3X蛋白主要存在2個核心功能結(jié)構(gòu)域，分別是分布在199～418位的是DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結(jié)構(gòu)域及455～536位的解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結(jié)構(gòu)域。

圖7 猴源DDX3X蛋白的保守功能結(jié)構(gòu)域

Fig.7 Conservative functional domain of monkey DDX3X protein

2.7 DDX3X蛋白相互作用蛋白預(yù)測

蛋白相互作用蛋白預(yù)測結(jié)果(圖8)顯示，猴源DDX3X蛋白與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(TBK1)、細(xì)胞分裂周期蛋白5(CDC5L)、核因子kappa B激酶(IKBKE)、真核起始因子4E家族(EIF4E)、U5小核核糖核蛋白組分亞型a(EFTUD2)、泛素特異性肽酶9(USP9X)、前mRNA處理因子6(PRPF6)、核翻譯起始因子1A(EIF1AX)及Aly/REF輸出因子(THOC4)等調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程、RNA加工等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的蛋白均存在相互作用。

圖8 猴源DDX3X蛋白的相互作用蛋白

Fig.8 Inter-acting protein of monkey DDX3X protein

3 結(jié)論與討論

研究成功從猴源腎細(xì)胞中擴(kuò)增獲得猴源DDX3X基因，基因全長1 989 bp，編碼662個氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，猴源DDX3X基因氨基酸序列與獼猴同源性最高，為99.6%；與人及其他猴類次之，與其他非哺乳動物同源性較低，表明其保守性較強(qiáng)。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測顯示，DDX3X蛋白理論分子質(zhì)量為73 243.42 kDa，是由20種氨基酸組成的脂溶性不穩(wěn)定蛋白。DDX3X蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主(50.45%和28.4%)，而β-折疊及β-轉(zhuǎn)角較少(14.2%和6.95%)，分別存在DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結(jié)構(gòu)域及解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結(jié)構(gòu)域，并且與調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)RNA加工等多種關(guān)鍵蛋白存在相互作用。

DDX3X是DEAD-box RNA解旋酶家族的成員，位于人類X染色體p11.3～p11.23上[10-11]。有研究報道，DDX3X參與多種基因調(diào)控事件，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA解旋、剪接、RNA核輸出、核糖體生物發(fā)生和mRNA翻譯[12]。因此，DDX3X被認(rèn)為參與基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控，研究顯示，DDX3X雖然在物種之間高度保守，但發(fā)揮的功能千差萬別，如小鼠和人的DDX3X同源型高達(dá)99%，而行使的功能卻不一致[13]。已有研究者將DDX3X基因作為癌癥治療的靶基因來治療肺癌患者體內(nèi)EGFR激活的異質(zhì)性[14]。

將克隆的序列進(jìn)行同源性比對及遺傳進(jìn)化樹的分析發(fā)現(xiàn)，DDX3X基因氨基酸序列在哺乳動物均有較高相似性，證明該基因在物種進(jìn)化過程中高度保守。蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，猴源DDX3X蛋白存在DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結(jié)構(gòu)域及解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結(jié)構(gòu)域。在此之前，有研究者已報道過其他物種的DDX3X均含有類似的2個功能結(jié)構(gòu)域，并且參與機(jī)體多種生物學(xué)調(diào)節(jié)過程[15-16]。相關(guān)研究表明，DDX3X參與了HIV、VSV、VACV、HCV和HBV等5個病毒的復(fù)制過程，作為主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)的蛋白，通過將豬藍(lán)耳病病毒PRRSV感染PAM細(xì)胞后可上調(diào)DDX3X基因的表達(dá)并抑制病毒的復(fù)制,并且DDX3X可通過調(diào)節(jié)干擾素β啟動刺激因子及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的表達(dá)來介導(dǎo)β干擾素的產(chǎn)生，從而誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答以對抗病毒的感染及復(fù)制[17]。

通過同源性比對及遺傳進(jìn)化樹證明DDX3X基因序列在不同物種進(jìn)化過程中高度保守，而其保守結(jié)構(gòu)域主要是DEXDc氨基酸結(jié)構(gòu)域及HELICc氨基酸結(jié)構(gòu)域，而該結(jié)構(gòu)域正是該蛋白行使主要生物學(xué)進(jìn)程的功能區(qū)。成功克隆獲得的猴源DDX3X基因與劉琴等克隆獲得的豬DDX3X基因編碼氨基酸數(shù)量一致，進(jìn)一步證明其在不同物種中保守性較高[17]。 在禽類動物的研究中，研究者將鴨坦布蘇病毒(DTMUV)感染BHK-21細(xì)胞之后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學(xué)分析，DDX3X基因作為差異基因被發(fā)現(xiàn)，通過熒光定量PCR及WB驗證發(fā)現(xiàn)，DDX3X及DDX5基因mRNA水平及蛋白水平均受到抑制。此外為驗證DDX3X基因參與病毒復(fù)制過程，研究者向BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)染DDX3X基因特異性干擾siRNA,并于轉(zhuǎn)染后用DTMUV感染BHK-21細(xì)胞，通過血凝和血凝抑制試驗發(fā)現(xiàn)，干擾DDX3X基因后，病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)[18]。

目前雖然發(fā)現(xiàn)豬DDX3X基因的表達(dá)對PRRSV易感及相關(guān)病毒復(fù)制存在關(guān)聯(lián)性，但具體相互作用機(jī)制還不夠清晰[19-20]。由于病毒研究存在較高不可控性，利用活體研究病毒的相關(guān)生物學(xué)過程代價較高，本次成功從猴源腎細(xì)胞中擴(kuò)增到DDX3X基因，并對其進(jìn)行基因同源性及相關(guān)蛋白質(zhì)性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)及保守功能結(jié)構(gòu)域及相互作用蛋白的分析，將為后期厘清DDX3X基因介導(dǎo)的病毒易感及復(fù)制的相關(guān)機(jī)制提供理論數(shù)據(jù)。