李 侃，趙群英，趙平歌

(西安工業(yè)大學建工學院，陜西西安 710021)

隨著納米技術的發(fā)展，納米銀由于其高效、廣譜、作用持久等優(yōu)良抗菌效果，且不會產生耐藥性問題受到廣泛關注[1]。然而，對于納米銀的釋放并沒有定量研究，陳莎等[2]假設納米銀的釋放主要隨著污水進入到污水處理廠。Kaegi等[3]在研究納米銀在污水處理廠的行為時發(fā)現，污水處理廠中5%納米銀隨著出水排放。在已知污水廠進水中關于納米銀濃度的報道中，盡管Li等[4]研究表明，納米銀濃度在污水廠進水中濃度小于1.5 μg/L，但Shafer等[5]發(fā)現，工業(yè)排污使得污水廠進水一定周期內的含銀量高達0.1 mg/L。因此，Liang等[6]研究納米銀對活性污泥處理系統(tǒng)中微生物生長及種群結構的影響效應及機制時認為，要考慮瞬間負荷提高的影響。目前，我國有關污水廠進水中納米銀濃度的研究還比較少，但我國《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(GB 18918—2002)[7]規(guī)定，出水中納米銀質量濃度≤0.10 mg/L。在已知報道納米銀顆粒對污泥系統(tǒng)影響的研究中，陳錚等[8]指出納米銀顆粒主要通過殺菌能力影響氨氧化菌的多樣性和豐度，從而對環(huán)境中氨氧化作用產生抑制效應。然而，關于長期投放低濃度銀納米顆粒對活性污泥硝化菌種群的影響尚不明確。

膜生物反應器(MBR)能高效去除納米顆粒，且作為膜分離技術與活性污泥法相結合的水處理技術已廣泛應用在污水處理中[9]。因此，本研究通過MBR觀察0.1 mg/L納米銀與活性污泥和污水長期接觸后，對硝化菌群的豐度和污水處理效果的影響。

1 材料與方法

1.1 納米銀的制備

本研究通過改進后的化學還原法來制備納米銀懸浮液(7.8 μmol/L或8.60 mg/L)[10]。將8.5 mL濃度為28 mmol/L的硼氫化鈉(NaBH4)溶液加入到490 mL濃度為0.6 g/L的聚乙烯醇溶液(PVA)中，并放在轉速為700 r/min的磁力攪拌器上進行攪拌，再向該混合液滴入2.8 mL濃度為14 mmol/L的硝酸銀(AgNO3)溶液，滴入速度為2滴/s，制備好的納米銀懸浮液呈亮黃色。

1.2 試驗裝置

試驗裝置為由有機玻璃制成的MBR反應器(圖1)，總有效體積為7.2 L，主要包括通過塑料擋板分隔成的缺氧區(qū)(1.8 L)和好氧區(qū)(5.4 L)，擋板底部的孔洞使缺氧區(qū)的混合液流向好氧區(qū)。好氧區(qū)的活性污泥通過污泥泵回流至缺氧區(qū)中。聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜組件淹沒在好氧區(qū)內，并通過組件底部的孔隙向好氧室曝氣，出水通過水泵以2倍的進水流速排出反應器外。

圖1 MBR系統(tǒng)示意圖Fig.1 Diagram of MBR System

1.3 試驗用水

試驗用水采用人工模擬廢水[11]，含500 mg/L化學需氧量(CODCr)，51.7 mg/L總氮(TN)，30 mg/L 氨氮，6 mg/L總磷(TP)。進水中其他營養(yǎng)素如下：31.40 mg/L MgSO4，27.70 mg/L Na2HPO4，10.60 mg/L CaCl2，0.80 mg/L CuSO4，0.96 mg/L ZnSO4以及0.15 mg/L NiSO4，pH值維持在8左右。

1.4 MBR的運行和監(jiān)測

MBR反應器水力停留時間為12 h，污泥齡為140 d，在投加銀納米顆粒前，MBR系統(tǒng)污泥(MLSS)的平均濃度為5 682 mg/L。在出水COD去除率穩(wěn)定在95%左右后，向缺氧區(qū)加入納米銀溶液，流速為0.12 mL/min，使得進水中納米銀的濃度為0.10 mg/L。向MBR反應器加入納米銀持續(xù)時間為61 d，在整個運行周期，檢測COD、氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮和TN[12]，以及硝化細菌的豐度。

1.5 DNA的提取

為檢測硝化菌群落結構，以及投加納米銀前后的抗銀基因拷貝數量，從好氧室取出少量泥樣，按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書的操作方法對上述泥樣進行DNA的提取。隨后用1%的瓊脂對5 μL提取好的DNA溶液進行凝膠電泳檢測，其余樣品保存在-20 ℃冰箱中。

1.6 實時定量PCR

為了考察投加納米銀前后氨氧化菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)細菌豐度的變化，對投加前后的污泥進行定量PCR試驗。采用25 μL反應體系，其中SYBR?Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, NJ, U.S.)為12.5 μL，10 μmol/L的引物各1 μL，2 μL DNA樣品和一定量的滅菌超純水。引物序列如表1所示。

采用反應程序：預變性溫度為95 ℃，2 min；變性溫度為95 ℃，15 s；退火溫度為58 ℃，30 s，延伸溫度為72 ℃，30 s，40個循環(huán)。PCR反應完后，用2%瓊脂糖凝膠電泳試驗來檢測目標基因，Marker 為50 bp DNA step ladder(promega, USA)。

表1 目標菌種PCR引物及反應程序Tab.1 Primers and Reaction Process for PCR Target Bacteria

1.7 銀的分析

從MBR反應器的好氧區(qū)取出5 mL活性污泥，并在200 ℃下利用HNO3測定混合液中固相的總銀濃度[16]。

2 結果與討論

2.1 對污染物去除效果的影響

在MBR系統(tǒng)運行60 d后，向反應器持續(xù)投加61 d的納米銀溶液并觀察各水質指標的變化。投加納米銀前后系統(tǒng)對COD去除效果如圖2所示。由圖2可知，系統(tǒng)出水CODCr在投加納米銀前平均濃度為23.9 mg/L，投加納米銀后出水CODCr濃度增至29.6 mg/L，平均去除率由95.4%降至94.1%。在投放納米銀的60 d后，MBR系統(tǒng)出水中COD的去除有微弱的降低。

圖2 投放納米銀前后COD的去除效果Fig.2 Effect of COD Removal before and after Continuous Dosing of Silver Nanoparticles

氨氮在水中以水合離子的形式存在，膜對氨氮的去除主要靠膜攔截累積的大量硝化細菌和亞硝化細菌對氨氮的硝化作用[17]。為保證對氨氮的去除效果，維持MBR系統(tǒng)中較高的MLSS濃度(5 682 mg/L)和較長時間SRT(140 d)，因此，出水中沒有檢測到氨氮的濃度。

圖3為MBR系統(tǒng)中亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮在投加納米銀前后的變化。由圖3可知，在投放納米銀前后硝態(tài)氮的平均濃度分別為12.5 mg/L 和13.2 mg/L，亞硝態(tài)氮的平均濃度分別為0.020 mg/L和0.016 mg/L。在長期投放納米銀后，出水中各類氮的濃度并未發(fā)現明顯變化。

圖3 MBR中投放納米銀前后亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的去除效果Fig.3 Effect of and Removal before and after Continuous Dosing of Silver Nanoparticles

MBR中投放納米銀前后TN的去除效果如圖4所示。在該試驗中，在投加納米銀前后，系統(tǒng)出水TN的平均濃度分別為13.0 mg/L和13.5 mg/L，TN的去除率為71.8%～78.6%。鄭祥等[18]研究發(fā)現，MBR系統(tǒng)的硝化作用下，出水中硝態(tài)氮成為TN的主要成分，試驗結果與研究報道相符。

圖4 MBR中投放納米銀前后TN的去除效果Fig.4 Effect of TN Removal before and after Continuous Dosing of Silver Nanoparticles

2.2 菌群的豐度

由于幾乎所有的銀都會吸附到MBR的污泥中[19]，本試驗通過定量PCR研究投加納米銀前后AOB和NOB豐度的變化(圖5)。

圖5 功能微生物定量結果Fig.5 Quantitative Results of Functional Microbes

由圖5可知，本研究AOB基因定量分析的數量級在107左右，與其他污水處理系統(tǒng)中AOB的研究結果基本一致[20]，但略低于個別研究[21]。對NOB定量結果顯示，本研究的MBR處理系統(tǒng)中硝化螺旋菌(Nitrospira)是NOB菌群中的優(yōu)勢菌群，豐度要比硝化桿菌(Nitrobacter)幾乎高出一個數量級，這與其他城市污水處理系統(tǒng)的研究報道[22]相符。因此，對于AOB和NOB豐度而言，投加納米銀前后，反應器內AOB和NOB的基因數量沒有明顯的變化，且處于同一數量級，主要脫氮菌AOB和NOB基本保持不變，系統(tǒng)在投加納米銀前后能夠維持脫氮能力不變，這與本文2.1節(jié)所述相符。

2.3 銀離子的變化規(guī)律

研究報道表明[23]，納米銀釋放出的銀離子被認為是納米銀的抗菌機制。圖6為MBR反應器的好氧區(qū)的活性污泥中銀離子的變化。在納米銀投加過程中，活性污泥中的銀離子濃度的增長與納米銀負荷的連續(xù)變化呈線性上升。然而，在好氧區(qū)的上清液中并沒有檢測到銀(銀的檢測限為0.2 μg/L)，這說明MBR中膜截留的活性污泥可以吸收大部分的銀負荷，結合2.2節(jié)菌群的豐度，可進一步說明投加微量納米銀對微生物種群沒有明顯的影響。

圖6 MBR反應器的好氧區(qū)的活性污泥中銀離子的變化Fig.6 Variation of Ag+ Concentration in Activated Sludge of Aerobic Zone in MBR

3 結論

(1)在投放低濃度納米銀(0.10 mg/L)前后出水COD和各類氮的濃度未發(fā)現明顯變化，且COD與TN得到了良好的去除。

(2)本研究MBR活性污泥樣品中AOB和NOB的豐度均處于同一數量級且沒有明顯變化，說明投加納米銀顆粒前后系統(tǒng)的硝化效果保持一致。NOB菌群中的Nitrospira豐度比Nitrobacter豐度高一個數量級，是明顯的優(yōu)勢NOB。

(3)MBR反應器中納米銀的檢測試驗發(fā)現，在好氧區(qū)活性污泥中檢測的銀與運行時間正相關，這說明銀含量被生物量累積吸收，且長期投放低濃度納米銀對微生物種群沒有影響。