趙琳琳 陳 瑋

(浙江大學醫(yī)學院免疫研究所，杭州 310058)

三結構域蛋白 21(tripartite motif 21，TRIM21)又名Ro52/SS-A，早期作為自身抗原在自身免疫疾病中被廣泛探究[1]。研究發(fā)現(xiàn)其是一種E3泛素連接酶，并在機體組織中廣泛表達。TRIM21屬于TRIM(tripartite motif)蛋白家族，其家族成員約有100個[2]。已有報道表明許多TRIM蛋白參與機體發(fā)生免疫調(diào)節(jié)和抗微生物感染的過程，調(diào)控與抗病毒細胞因子相關的信號轉導通路。令人感興趣的是TRIM21 也在先天抗病毒免疫方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與此同時，其作為E3泛素連接酶的結構和功能也逐漸被揭開神秘的面紗。

1 TRIM21的蛋白結構

TRIM21的分子量是52 kD，與大多數(shù)TRIM蛋白一樣，較多分布于胞質(zhì)內(nèi)，少部分存在于細胞核。TRIM21是多結構域蛋白，由RING-finger結構域、B-box結構域、卷曲結構域和PRYSPRY 結構域組成。RING-finger結構域是TRIM21蛋白N端的第一個結構域，在該結構域中，由半胱氨酸和組氨酸殘基形成鋅離子結合位，是TRIM21作為E3泛素連接酶發(fā)揮功能的基礎[3]。B-box 結構域是和鋅離子配位的又一功能結構域，約由40個氨基酸殘基組成，該結構域由3條β折疊股和1個α螺旋片段組成，其空間構象與RING-finger結構域相仿[4]。在TRIM21發(fā)揮信號轉導功能時，B-box結構域通過自身抑制的方式與 E2 泛素結合酶競爭RING-finger中的結合位點，模擬E2泛素結合酶和E3泛素連接酶的相互作用過程，從而抑制TRIM21蛋白的泛素酶活性[3]。卷曲結構域可由多個α螺旋相互纏繞形成二聚體或高級結構，可促進 TRIM21 分子的同源二聚化，幫助其定位其他結構域，從而形成穩(wěn)定的大分子聚合體[5]。此外，卷曲結構域還參與TRIM21對底物的識別和泛素化的過程。位于C端的 PRYSPRY 結構域是一個類球形的三維立體折疊結構，其中包含1個由2個反向平行的 β 折疊組成的扭曲 β-三明治結構[6]。該結構包含抗體結合位點，并且決定了配體的特異性和功能。另外，最新發(fā)現(xiàn)PRYSPRY結構域可以與具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)結合，是TRIM21 在抗病毒免疫方面的關鍵結構域。

2 TRIM21在抗病毒免疫信號通路中的功能

作為抵抗外源微生物入侵的第一道防線，先天免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern recognization recptors，PRRs)識別外源微生物的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，激活先天免疫應答信號通路，誘導干擾素和炎癥因子表達，進而抵抗外源微生物的入侵。TRIM21 作為E3泛素連接酶,廣泛參與先天免疫信號通路中細胞因子的調(diào)控過程，其獨特的泛素化形式和功能一直被人們廣泛探究。

2.1TRIM21的自身泛素化 泛素化修飾是機體非常重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾的形式之一，與機體的各項生理活動息息相關。泛素化循環(huán)涉及4種酶：E1泛素激活酶，E2泛素結合酶，E3泛素連接酶和DUB(泛素去泛素化酶)。泛素化有單泛素化和多泛素化兩種形式。多泛素化主要通過泛素分子上7個不同的賴氨酸殘基來實現(xiàn)，其中 K48 泛素化和K63 泛素化的相關研究最受矚目。眾所周知，K48連接的泛素鏈可以被蛋白酶體識別，從而引發(fā)被修飾底物的降解；而K63連接的泛素鏈更多的是在激活信號轉導通路這一過程發(fā)揮功能[7]。因此，具有E3泛素連接酶功能的TRIM蛋白能通過催化不同類型的泛素化而在抗病毒免疫信號通路中發(fā)揮不同的功能。

Wada等早期研究TRIM21是否具有同TRIM家族其他蛋白相同的E3泛素連接酶特性時，曾將TRIM21作為泛素化的E3連接酶與純化后的E1激活酶和不同的E2結合酶(UbcH2,UbcH5,UbcH7,UbcH10和hCDC34)共孵育,在泛素和ATP存在的條件下，發(fā)現(xiàn)TRIM21 與E2酶UbcH5作用后，可與K48泛素鏈發(fā)生自體泛素化，證明了TRIM21是E3泛素連接酶，并且此種泛素化主要以單體形式存在，并不通過蛋白酶體相關通路降解。

對TRIM家族其他蛋白的相關研究顯示，許多TRIM蛋白可泛素化其底物從而調(diào)節(jié)或維持底物的穩(wěn)定性，而通過K63多泛素連接的信號蛋白，往往在免疫防御調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，TRIM21要想發(fā)揮抗病毒功能，其與K63泛素化的相互作用過程是不可或缺的，而這種結合是由泛素結合酶E2的順序活性決定的。TRIM21首先被E2酶Ube2W標記為單泛素分子(monoubiquitin，monub)，單泛素化的TRIM21又是E2酶Ube2N/Ube2V2的底物，故Ube2N/Ube2V2進一步促進了TRIM21的K63連接的泛素化過程[8-10]，以上研究表明，TRIM21的逐步激活需要兩種不同的E2酶Ube2W和Ube2N/Ube2V2；并且，當E2酶缺失時，TRIM21與K48、K63的泛素化結合過程將發(fā)生中斷，TRIM21自身參與的信號轉導和病毒內(nèi)化等過程均不能進行。在TRIM21的泛素化循環(huán)過程中，POH1作為一種與TRIM21發(fā)揮中和病毒、信號傳導和細胞因子誘導功能相關的去泛素化酶，對泛素鏈的降解起著重要作用，它抑制TRIM21在抗病毒先天免疫信號中的泛素化作用。有研究報道，在正常機體組織中，TRIM21參與NF-κB的信號轉導過程，而POH1缺失的細胞不能發(fā)生這一過程，這恰恰證明POH1可阻斷TRIM21 與K63連接的泛素鏈，從而激活抗病毒先天免疫信號通路[9]。對去泛素化酶POH1的研究進一步揭示了TRIM21激活的復雜調(diào)節(jié)機制，尤其對于在沒有感染的情況下控制異常信號，防止機體發(fā)生不必要的炎癥反應是至關重要的。

2.2TRIM21與抗病毒相關傳感器作用 人體細胞具有強大的免疫傳感器，可以檢測胞質(zhì)中病毒核酸的存在。然而，幾乎所有的病毒都有蛋白質(zhì)外殼來保護它們的基因組，因此在病毒基因組必須暴露在胞質(zhì)中的情況下，非結構病毒蛋白就可以在蛋白衣殼分解過程中隱藏基因組使其不被檢測到。Kutluay等人先前的研究表明，TRIM5α可通過蛋白酶體降解途徑，降解進入胞內(nèi)的逆轉錄病毒顆粒從而導致病毒核酸的暴露[8]；無獨有偶，TRIM21在抗體介導的中和反應下，通過ATPase p97/valosin-containing protein (VCP)和蛋白酶體使外來病毒的蛋白衣殼分解，同時將其基因組暴露給核酸傳感器，從而在病毒基因組復制開始之前搶先激活免疫轉錄功能[11]。此時，TRIM21通過胞質(zhì)中的核酸感受器cGAS和RIG-Ⅰ，進一步增強了對抗體結合的DNA或RNA病毒的感知和檢測[12]。上述研究表明TRIM21通過對進入胞漿的病毒顆粒的感知而不是對子代基因組的感知，進而協(xié)調(diào)機體完成感染時的快速免疫應答過程。與上述TRIM21促進機體抗病毒的研究相反的是，最近研究發(fā)現(xiàn)TRIM21可與機體新型DNA感受器DDX41結合，以K48連接的泛素化形式作用于DDX41的賴氨酸9位和115位，促使DDX41通過泛素化-蛋白酶體途徑降解，從而負向調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，協(xié)調(diào)機體發(fā)揮抗病毒功能[13，14]。

2.3TRIM21與MAVS的相互作用 一直以來，線粒體適配器分子MAVS在機體對病毒感染的天然免疫應答中占有重要地位。已經(jīng)報道的一些E3連接酶，如AIP4 (atrophin-1 interacting protein 4)，RNF5(ring finger protein 5)，Smurf1(smad ubiquitin regulator factor 1)，TRIM25 和March5(membrane-associated RING-CH protein 5)等都能催化MAVS發(fā)生K48連接的泛素化，并促進MAVS進一步降解，從而負性調(diào)節(jié)MAVS的活性。而最新的研究發(fā)現(xiàn)E3泛素化連接酶TRIM21與MAVS發(fā)生相互作用，可正向調(diào)節(jié)MAVS的活性，增強先天固有免疫反應。此項研究表明TRIM21通過催化MAVS發(fā)生K27位的泛素化，進一步促進TBK1被招募到MAVS，從而激活下游抗病毒信號通路。其中，TRIM21的PRYSPRY結構域是其與MAVS相互作用的關鍵結構域，而TRIM21的RING-finger結構域則促進了MAVS的泛素鏈的形成。并且對MAVS所有賴氨酸殘基的突變分析進一步表明MAVS的賴氨酸325位是TRIM21催化的K27連接的泛素化位點[15]。綜上所述，盡管研究報道的大多E3泛素連接酶負向調(diào)節(jié)MAVS的抗病毒活性，但TRIM21促進MAVS的K27連接的泛素化可正向調(diào)節(jié)天然免疫應答，從而抑制病毒感染[16]。

2.4TRIM21與IRF的相互作用 病毒感染后天然免疫反應的核心是機體產(chǎn)生Ⅰ型干擾素并建立抗病毒狀態(tài)。當病毒入侵機體時PRRs對病毒感染作出反應，誘導大量的Ⅰ型IFN發(fā)揮強大的抗病毒效應。這一過程離不開一個轉錄因子家族，即干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors,IRFs)。IRFs由Ⅰ型IFN或PAMPs誘導，并在機體中受其調(diào)控，可引起下游信號的激活。由于TRIM21本身在轉錄水平上受IRFs調(diào)節(jié)，故在機體發(fā)生抗病毒防御反應和自身免疫疾病期間，IRF1和IRF2可誘導TRIM21表達[17]。隨后，被誘導表達的TRIM21在TLRs的刺激下與IRF3、IRF5、IRF7和IRF8相互作用，介導其發(fā)生泛素化，隨后降解，從而終止信號傳導[18,19]。雖然已有許多文獻報道稱TRIM21是IRFs的負性調(diào)節(jié)因子，但從最近的研究成果綜合來看，這一說法并不準確。目前更可能的猜想認為：在靜息細胞和免疫反應的早期，TRIM21可能起到增強IRF3和IRF8轉錄活性的作用，然而隨后又與其他因素協(xié)同作用，在信號晚期降解IRFs。

2.4.1TRIM21對IRF3的復雜調(diào)控 IRF3是促進Ⅰ型干擾素合成的關鍵轉錄因子，在抗病毒免疫中發(fā)揮關鍵作用。IRF3與TRIM21的作用和聯(lián)系一直備受關注，有許多報道對此進行過深入研究。在這些研究中Higgs等[20]提出的TRIM21是IRF3依賴的Ⅰ型干擾素的負調(diào)節(jié)因子這一觀點被大家廣泛接受。他們發(fā)現(xiàn)機體被RNA病毒感染后，TRIM21被顯著誘導，其C-末端PRYSPRY結構域與IRF3結合產(chǎn)生相互作用，促進了IRF3的K48位的泛素化和降解。并且，TRIM21對IRF3誘導的干擾素-β也起抑制作用，而這種作用又可被蛋白酶體抑制劑MG132顯著逆轉，表明TRIM21介導的IRF3泛素化和降解的直接結果是抑制干擾素-β的產(chǎn)生。此外，Gunjan等[21]發(fā)現(xiàn)，在乙型腦炎病毒感染人小膠質(zhì)細胞的過程中，TRIM21表達增多，并通過IRF-3下調(diào)IFN-β，從而在感染早期抑制Ⅰ型干擾素表達。Espinosa[22]和Yoshimi等[23]研究也證實了IRF3、IRF5、IRF8作為TRIM21 的底物被多泛素化降解從而抑制IFNs活性的觀點。然而Yang等發(fā)現(xiàn)，TRIM21是維持IRF3穩(wěn)定表達并發(fā)揮功能的正向調(diào)節(jié)劑。他們證實機體在感染RNA病毒時，TRIM21被顯著誘導并與IRF3相互作用，異位表達或敲除TRIM21可分別增強或削弱IRF3介導的基因的表達。以上兩種觀點截然相反，Yang對此的解釋是，IRF3有可能與一種未知的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應，該蛋白質(zhì)正是TRIM21的泛素化目標。先前有報道稱肽酰-脯氨酰異構酶Pin1(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，NIMA-Interaction 1)與磷酸化的IRF3相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑促進其降解，Pin1本身并不直接催化IRF3發(fā)生泛素化[24]。而對TRIM21的研究發(fā)現(xiàn)，其可干擾Pin1與IRF3相互作用，從而阻止IRF3的泛素化和降解。這一發(fā)現(xiàn)或許可以從側面證實Yang等人的觀點。還有部分研究表明TRIM21的磷酸化修飾在其與IRF3發(fā)生相互作用的過程中也產(chǎn)生舉足輕重的影響。TRIM21的PRYSPRY結構域中的酪氨酸393磷酸化可正向調(diào)節(jié)其自身活性，若將酪氨酸393突變?yōu)楸奖彼釙е耇RIM21的活性喪失，并降低其與底物IRF3相互作用的能力[25]。

2.4.2TRIM21對IRF5的負調(diào)控作用 已知在TRIM21-/-小鼠中其SLE癥狀加重，其特征是促炎細胞因子如I型干擾素，IL-12和IL-23等的產(chǎn)生增強，而這些細胞因子受IRF家族的調(diào)控，有學者認為SLE 的疾病發(fā)生是由于SLE患者中IRF5-TRIM21調(diào)節(jié)環(huán)失調(diào)[26]。Elisa等[27]研究結果認為識別RNA和DNA的核酸感受器TLR7和TLR9可參與SLE中自身抗體和I型干擾素的產(chǎn)生過程。在TLR7受到刺激后，TRIM21中的C-末端PRYSPRY結構域可與IRF5結合，發(fā)生泛素化并促進IRF5的降解，從而負向調(diào)控I 型干擾素的產(chǎn)生。在此過程中，IRF5的C-末端IAD結構域中保守的絲氨酸殘基磷酸化后發(fā)生結構變化，進一步促進IRF5和TRIM21之間的結合[18]。與之相近的是，在輪狀病毒非結構蛋白NSP1刺激下，IRF3和IRF7的IAD結構域必須是完整的才能發(fā)生泛素化和降解。這表明這個保守的公共區(qū)域可能會在機體被外來病毒刺激的條件下，充當E3泛素連接酶的作用位點，從而泛素化IRF并終止IRF介導的信號傳導[28]。因此可以大膽推測：IRF蛋白的IAD結構域可能是TRIM21介導的該家族轉錄因子降解的共同靶點。

2.4.3TRIM21對 IRF7 的負調(diào)控作用 同為IRF家族的一員，IRF7與IRF3具有許多相似的功能。Higgs等人揭示了TRIM21對IRF3介導的Ⅰ型干擾素信號通路的負調(diào)控功能后，又證實TRIM21在調(diào)節(jié)IRF7的穩(wěn)定性和活性方面，與其對IRF3的調(diào)節(jié)相類似，即當TLR7和TLR9受到刺激后，TRIM21介導的K48泛素化促進了IRF7的降解，從而負向調(diào)節(jié)IFN的產(chǎn)生。

Fas相關死亡結構域(Fas-associated death domain,FADD)最初被描述為一種凋亡蛋白，通過與TRIM21相互作用，可增強TRIM21的泛素化活性，但TRIM21沒有使FADD本身發(fā)生泛素化，而是協(xié)同作用于IRF7使其泛素化，從而抑制IFN-α的產(chǎn)生[29]。即FADD和TRIM21可一同負調(diào)節(jié)晚期IFN-α以響應病毒感染。

2.4.4TRIM21對IRF8早期的正調(diào)控作用 IRF8是一種調(diào)節(jié)巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞發(fā)育和功能的轉錄因子，調(diào)節(jié)包括IL-12p40和Ⅰ型IFN在內(nèi)的促炎細胞因子的表達。與其他IRFs不同，IRF8與TRIM21相互作用發(fā)生泛素化，其自身并沒有降解，而是表現(xiàn)為轉錄功能的增強，促進了IL-12、IL-12p40的表達[30]。這一過程有助于激發(fā)巨噬細胞的先天免疫防御作用。此外，p62與TRIM21可協(xié)同調(diào)節(jié)IRF8的降解；然而p62又可促進自噬形成和降解含多泛素化的蛋白復合物[18,31]。因此，可猜想雖然TRIM21介導的IRF8泛素化最初可以增強其活性，但在反應后期與泛素化IRF8結合的p62又可能會促進其降解。

以上多項研究結果顯示TRIM21通過與IRFs的泛素化作用對IFNs進行精細調(diào)節(jié)，從而在天然免疫、適應性免疫中發(fā)揮重要的免疫防御功能。

3 TRIM21在機體中的其他抗病毒免疫功能

TRIM21作為中和病毒感染的“有效因子”，是目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一一個細胞漿內(nèi) IgG 受體[32-34]。與其他Fc受體相比，其具有廣泛的同型特異性，不僅與IgG結合，還與IgM和IgA結合[34]?？贵w是機體抗感染的關鍵分子，最近的研究發(fā)現(xiàn)：抗體介導的抗感染保護作用已延伸到細胞內(nèi)的胞質(zhì)隔室。此種抗體進入細胞后的病毒防御機制需要抗體與胞質(zhì)Fc受體結合，而TRIM21 正是在其中發(fā)揮作用的特異性胞質(zhì)Fc受體。當被這些抗體亞型包被的病毒病原體進入胞質(zhì)時，機體迅速招募TRIM21，從而使進入機體中的病毒在大量復制之前就得到了有效的中和。此外，TRIM21可與補體系統(tǒng)協(xié)同作用，在補體因子C1/C4的參與下進一步阻斷病毒復制[35,36]。

4 結語

TRIM21作為連接固有免疫和適應性免疫的橋梁，為機體建立起一道抵抗病原體入侵的新防線。TRIM21充分發(fā)揮自身的E3泛素連接酶活性，在抗病毒天然免疫信號中參與體內(nèi)細胞因子的復雜而精密的調(diào)控過程，維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。 對 TRIM21 抗病毒機制的研究不僅有助于更好地認識自身免疫系統(tǒng)，同時也為一些腫瘤、病毒感染相關的疾病提供了臨床預防和診療的新思路。