白團(tuán)輝，李莉，鄭先波，王苗苗，宋尚偉，焦健，宋春暉

柱狀蘋果基因的篩選與候選基因分析

白團(tuán)輝，李莉，鄭先波，王苗苗，宋尚偉，焦健，宋春暉

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/河南省果樹瓜類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

【】柱狀蘋果是一種特殊的矮生突變類型，其節(jié)間短、短枝多、側(cè)生分枝少、主干粗壯直立，是蘋果實(shí)行矮化密植栽培的重要資源。本研究在前期精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，對定位區(qū)間的基因進(jìn)行篩選，為闡明柱狀蘋果形成的分子機(jī)制和選育柱狀蘋果新品種奠定基礎(chǔ)。以柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太一號’，普通型蘋果‘富士’和‘華碩’的芽、莖尖和葉片為試材，根據(jù)最新的蘋果基因組以及與柱狀相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組信息，對精細(xì)定位區(qū)間27.66—29.05 Mb的基因進(jìn)行注釋分類，選擇目標(biāo)基因，查找其CDS序列，使用RT-PCR技術(shù)檢測引物特異性，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析預(yù)測基因在不同組織器官中的表達(dá)特征，篩選出差異基因并將其作為候選基因。在蘋果第10號染色體27.66—29.05 Mb區(qū)域內(nèi)包含67個(gè)基因，其中12個(gè)為非編碼RNA（ncRNA），其余為編碼蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)RNA-seq分析，柱狀和普通型蘋果基因相對表達(dá)差異倍數(shù)在1倍以上的有25個(gè)基因，其中13個(gè)基因在柱狀蘋果中上調(diào)表達(dá)，12個(gè)基因在柱狀蘋果中下調(diào)表達(dá)。在預(yù)測的14個(gè)基因中，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500在柱狀和普通型蘋果的主枝莖尖或側(cè)枝莖尖中相對表達(dá)存在顯著差異。其中，MD10G1184100和MD10G1185600在兩個(gè)柱狀蘋果主枝莖尖中的相對表達(dá)量均顯著高于兩個(gè)普通型蘋果。MD10G1185400和MD10G1190500在兩個(gè)柱狀蘋果側(cè)枝莖尖的表達(dá)量顯著高于兩個(gè)普通型蘋果，而MD10G1184100在兩個(gè)柱狀蘋果中的表達(dá)量顯著低于普通型蘋果。進(jìn)一步對這4個(gè)候選基因進(jìn)行不同組織或器官的基因表達(dá)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因MD10G1184100在柱狀蘋果根部的表達(dá)顯著高于其他部位，MD10G1185400和MD10G1185600在柱狀蘋果的側(cè)枝莖尖中顯著高表達(dá)，而MD10G1190500在柱狀蘋果的頂芽中顯著高表達(dá)。在柱狀和普通型蘋果莖尖中篩選到4個(gè)表達(dá)顯著差異的基因，可作為候選基因，為該基因的克隆和功能驗(yàn)證及蘋果樹樹型定向遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

蘋果；柱狀樹型；基因定位；基因表達(dá)；候選基因

0 引言

【研究意義】蘋果（×Borkh.）是我國主要栽培的果樹樹種之一，其面積和產(chǎn)量均居世界首位，發(fā)展蘋果產(chǎn)業(yè)，對增加農(nóng)民收入、調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)具有重要的意義。樹型是蘋果重要的農(nóng)藝性狀之一，對定植密度、機(jī)械采收、整形修剪以及栽培模式都有至關(guān)重要的作用[1]。柱狀蘋果是一種特殊的矮生突變類型，其節(jié)間非常短、側(cè)生分枝少，且?guī)缀醪恍栊藜?，被認(rèn)為是蘋果矮化密植栽培、集約化生產(chǎn)的理想樹型[2-4]。開展柱狀蘋果的鑒定與分離，對實(shí)現(xiàn)定向遺傳改良蘋果樹型和分子標(biāo)記輔助選育柱狀蘋果具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柱狀蘋果是1969年發(fā)現(xiàn)于McIntosh上的一個(gè)芽變，后來命名為McIntosh Wijcik[5]。最早研究報(bào)告顯示柱狀蘋果是受顯性單基因控制的質(zhì)量性狀[2]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，國內(nèi)外研究者相繼開展了柱狀蘋果的分子標(biāo)記和基因定位研究。CONNER等[6]用集群分類法（bulked segregant analysis，BSA）首次找到一個(gè)與連鎖RAPD 標(biāo)記 OA111000。CONNER等[7]用兩個(gè)柱狀雜交群體后代分離數(shù)據(jù)構(gòu)建了3個(gè)親本的遺傳連鎖圖，包含283個(gè)標(biāo)記，分布在17個(gè)連鎖群上，被定位在第10個(gè)連鎖群上。王彩虹等[8]利用AFLP結(jié)合BSA法在Spur Fuji×Telamon雜交組合中，篩選到了2個(gè)AFLP標(biāo)記，分別與位點(diǎn)遺傳距離為3.3和27.5 cM。TIAN等[9]報(bào)道了所在區(qū)域分子圖譜，將界定在兩個(gè)穩(wěn)定的SSR標(biāo)記（COL和CH02a10）之間，覆蓋基因組長度為54.6 cM，標(biāo)記間平均距離為4.55 cM。MORIYA等[10]將定位在兩個(gè)SSR（CH03d11和Hi01a03）之間，進(jìn)一步縮短了目的基因和標(biāo)記的距離。隨后，自2010年‘金冠’蘋果基因組測序公布[11]，研究者開始對基因開展了精細(xì)定位研究。筆者課題組前期研究將定位到第10條染色上物理距離75 kb以內(nèi)[12]。BALDI等[13]分析了區(qū)域內(nèi)的ORFs，發(fā)現(xiàn)區(qū)域內(nèi)存在若干個(gè)潛在的候選基因，并對該區(qū)域內(nèi)的36個(gè)基因進(jìn)行了預(yù)測和注釋。OTTO等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在18.73—18.92 Mb區(qū)域內(nèi)有一個(gè)柱型特異的8.2 kb的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入，預(yù)測其可能與柱狀樹形有關(guān)。【本研究切入點(diǎn)】目前，柱狀蘋果基因的精細(xì)定位仍存在一些差異[15-19]，還未能從分子水平上闡明柱狀蘋果形成機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用已發(fā)布的蘋果參考基因組GDDH13（Golden Delicious doubled-haploid tree 13），通過NCBI中的序列閱讀存檔/表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫檢索，對精細(xì)定位區(qū)間的基因進(jìn)行注釋分類、預(yù)測，選擇目標(biāo)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析目標(biāo)基因在不同組織器官中的表達(dá)特征并篩選出差異基因。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 植物材料

本試驗(yàn)以3年生柱狀蘋果‘舞佳’（WJ）和‘潤太一號’（RT），普通型蘋果‘富士’（FJ）和‘華碩’（HS）植株為試材，于2018年3月萌芽后開始，分別采集萌芽期的頂芽和側(cè)芽、生長期的主枝莖尖和側(cè)枝莖尖、葉片、花、根和果實(shí)，其中植株的根部樣品為組培苗的根，用錫箔紙包好放入液氮中速凍，迅速帶回試驗(yàn)室于-80℃中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取、檢測及反轉(zhuǎn)錄 使用改良CTAB法[20]提取樣品總RNA。使用分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo Scientific）檢測RNA溶液的濃度及純度，并使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量和完整性。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（大連寶生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 預(yù)測基因的遴選和生物信息學(xué)分析 根據(jù)分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離和物理距離[12-14]，在蘋果基因組注釋數(shù)據(jù)庫（https://iris.angers.inra.fr/gddh13）中對定位的染色體區(qū)段內(nèi)的注釋基因進(jìn)行候選基因的遴選。根據(jù)NCBI中有關(guān)柱狀蘋果的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及普通型蘋果不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對區(qū)段內(nèi)的基因進(jìn)行表達(dá)量的初步篩選。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 根據(jù)蘋果參考基因組中mRNA序列，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。以柱狀和普通型蘋果的cDNA為模板，對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR特異性檢測。PCR體系為Mix 10 μL，正、反向引物（10 mmol?L-1）各1 μL，100 ng·μL-1cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL，總體系20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，50—60℃退火20 s，72℃延伸30 s，28—32個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。退火溫度依據(jù)引物自身的Tm值進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)置。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 熒光定量PCR檢測在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行。使用SYBR? Green PCR Master Mix（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）熒光定量試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL：10.0 μL SYBR? Green PCR Master Mix，2.0 μL 模板cDNA，上、下游引物各1.0 μL（引物濃度 10 μmol·L-1），6.0 μL ddH2O。熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性過程，50℃ 20 s，95℃ 10 min，1次循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，并進(jìn)行熒光信號采集；40次循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，所得數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)量[21-22]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 17.0軟件（IBM）對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（＜0.05）。用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 Co定位區(qū)間基因的注釋和篩選

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的柱狀基因定位區(qū)間，提取‘金冠’參考基因組GDDH13 10號染色體27.66—29.05 Mb區(qū)域內(nèi)基因組信息，結(jié)果表明，這一段序列包含67個(gè)基因（表2），其中12個(gè)為非編碼RNA（ncRNA），其余為編碼蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)柱狀和普通型蘋果SRA RNA-seq數(shù)據(jù)，差異倍數(shù)1倍以上的有25個(gè)基因，其中13個(gè)基因在柱狀蘋果中上調(diào)表達(dá)，12個(gè)基因在柱狀蘋果中下調(diào)表達(dá)。通過比較67個(gè)基因在柱狀和普通型蘋果中的表達(dá)并結(jié)合基因功能預(yù)測，篩選到14個(gè)預(yù)測基因（表1）。其中，MD10G1192100、MD10G1192900、MD10G1188000、MD10G1194100、MD10G1193400、MD10G1189000和MD10G1192200在葉片、頂梢、莖、腋芽、根、果實(shí)和花中均表達(dá)（圖1）。而MD10G1192900和MD10G1192100的表達(dá)量在各個(gè)器官中均較高，MD10G1194100和MD10G1187000在根中表達(dá)量高，MD10G1192200和MD10G1188000在果實(shí)中表達(dá)量較高。

2.2 預(yù)測基因在蘋果主枝莖尖中的表達(dá)特征

對擴(kuò)增到cDNA序列的14個(gè)預(yù)測基因，利用克隆到的基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR特異引物（表1），在柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太’，普通型蘋果‘富士’和‘華碩’的主枝莖尖進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明，MD10G1184100和MD10G1185600在兩個(gè)柱狀蘋果主枝莖尖中的相對表達(dá)量均顯著高于兩個(gè)普通型蘋果（圖2-A和C）。MD10G1186300在‘華碩’中的表達(dá)量顯著高于‘舞佳’和‘潤太’，而在‘潤太’與‘富士’中的表達(dá)量則無顯著差異（圖2-D）。MD10G1187000在‘潤太’中的表達(dá)量顯著高于‘富士’和‘華碩’，但是在‘舞佳’中的表達(dá)量又顯著低于‘富士’和‘華碩’（圖2-F）。MD10G1190500在‘潤太’中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)品種，但在這3個(gè)品種之間則無顯著差異（圖2-G）。MD10G1190700在‘潤太’中的表達(dá)量最低，在‘舞佳’中的表達(dá)量顯著高于‘華碩’，但其與‘富士’之間無顯著差異（圖2-H）；MD10G1191100在兩個(gè)柱狀蘋果以及‘富士’中的表達(dá)量顯著低于‘華碩’，但在‘舞佳’與‘富士’之間，其表達(dá)量無顯著差異（圖2-I）；MD10G1192900在‘潤太’中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)品種，但在‘舞佳’中的表達(dá)量顯著低于普通型（圖2-L）。則是在‘華碩’中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)品種，但其表達(dá)量在這3個(gè)品種間無顯著差異（圖2-M）。MD10G1192300和MD10G1192400在柱狀與普通型中的表達(dá)量無顯著差異。MD10G1194200在兩個(gè)柱狀蘋果中的表達(dá)量顯著低于兩個(gè)普通型蘋果（圖2-N）。

表1 14個(gè)預(yù)測基因相對表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

：肌動(dòng)蛋白基因（內(nèi)參基因）: Actin gene (reference gene)

表2 蘋果Co定位區(qū)間的基因初步篩選

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

圖1 初步篩選基因組織表達(dá)

2.3 預(yù)測基因在蘋果側(cè)枝莖尖中表達(dá)特征

對14個(gè)預(yù)測基因在柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太’，普通型蘋果‘富士’和‘華碩’的側(cè)枝莖尖進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果表明，MD10G1185400和MD10G1190500在2個(gè)柱狀蘋果側(cè)枝莖尖的表達(dá)量顯著高于兩個(gè)普通型蘋果（圖3-B和G），而MD10G1184100和MD10G1186400在2個(gè)柱狀蘋果中的表達(dá)量分別顯著低于2個(gè)普通型蘋果（圖3-A和E）。MD10G1185600在‘舞佳’與‘富士’中的表達(dá)量顯著高于另外2個(gè)蘋果品種，但是這兩者之間無顯著差異，并且在‘潤太’中的表達(dá)量顯著高于‘華碩’（圖3-C），MD10G1186300在‘華碩’中的表達(dá)量顯著高于其他3個(gè)蘋果，但除‘華碩’外的3個(gè)品種間無顯著差異（圖3-D）。其他基因則是在品種間的表達(dá)無差異或在柱狀與普通型蘋果中的表達(dá)量存在不一致的現(xiàn)象，綜合考慮，選擇在柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太’，普通型蘋果‘富士’和‘華碩’的主枝莖尖以及側(cè)枝莖尖中差異表達(dá)的4個(gè)基因MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500作為候選基因。

2.4 候選基因在不同組織部位中的表達(dá)分析

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測4個(gè)候選基因（MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500）在柱狀和普通型蘋果頂芽、側(cè)芽、主枝莖尖、側(cè)枝莖尖、根、葉、花、果實(shí)中的相對表達(dá)水平。結(jié)果表明，4個(gè)候選基因在頂芽、側(cè)芽、主枝莖尖、側(cè)枝莖尖、根、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，但表達(dá)特征有差異（圖4）。MD10G1184100在柱狀蘋果根部的表達(dá)量最高，顯著高于其他部位，為普通型蘋果根部表達(dá)量的65倍。MD10G1184100在頂芽、主枝莖尖、根和果實(shí)中的表達(dá)量顯著大于普通型蘋果。MD10G1185400在柱狀蘋果側(cè)枝莖尖中高表達(dá)，在柱狀蘋果的側(cè)枝莖尖、根、果實(shí)和葉片中的表達(dá)量顯著高于普通型；而在花、側(cè)芽和側(cè)枝莖尖的表達(dá)量顯著小于普通型。MD10G1185600在柱狀蘋果的側(cè)枝莖尖中高表達(dá)，在主枝莖尖、側(cè)枝莖尖、果實(shí)和葉片中的表達(dá)量顯著大于普通型，而在頂芽、側(cè)芽、根和花等組織中的表達(dá)量顯著小于普通型。MD10G1190500在柱狀蘋果頂芽中的表達(dá)量最高，在頂芽、側(cè)芽、側(cè)枝莖尖、花、果實(shí)和葉片中表達(dá)量顯著高于普通型。

3 討論

蘋果是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。近30多年來，世界蘋果栽培制度發(fā)生了深刻的變化，歐美等發(fā)達(dá)國家蘋果園的矮砧栽培比例高達(dá)90%以上，而中國蘋果矮化栽培的比例不足10%[23]。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和城市化進(jìn)程的日益加快，農(nóng)村勞動(dòng)力向城市大量轉(zhuǎn)移，蘋果種植從業(yè)人員不足的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，矮砧密植栽培是我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢[22-24]。柱狀蘋果因其節(jié)間短、側(cè)生分枝少，且?guī)缀醪恍栊藜簦徽J(rèn)為是現(xiàn)代蘋果矮砧密植栽培的理想樹型[25-27]。但到目前為止，柱狀蘋果形成的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。從分子水平上揭示柱狀蘋果獨(dú)特的生長特性是實(shí)現(xiàn)蘋果定向遺傳改良樹型的基礎(chǔ)。前期研究表明，蘋果柱狀樹型是受位于10號染色體上的單顯性基因控制，并且在區(qū)域內(nèi)有多個(gè)預(yù)測基因[6,28-30]。筆者課題組前期研究開發(fā)了7個(gè)與緊密連鎖的SSRs標(biāo)記，并構(gòu)建了遺傳連鎖和物理圖譜，將定位到第10條染色體分子標(biāo)記16470_23262和C5629_32009之間物理距離75 kb以內(nèi)[12]。本研究以柱狀蘋果與普通型蘋果為試材，對定位區(qū)間的基因進(jìn)行注釋分類，發(fā)現(xiàn)在10號染色體27.66—29.05 Mb區(qū)域內(nèi)包含67個(gè)基因，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因（MD10G1185400、MD10G1184100、MD10G1185600和MD10G1190500）在柱狀和普通型蘋果的主枝莖尖或側(cè)枝莖尖基因表達(dá)存在顯著差異，推測這4個(gè)基因可能是候選基因。

WJ：舞佳 Wujia；RT：潤太 Runtai；FJ：富士 Fuji；HS：華碩 Huashuo。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

圖3 預(yù)測基因在柱狀和普通型蘋果側(cè)枝莖尖中的相對表達(dá)水平

圖4 候選基因在柱狀和普通型蘋果不同組織中的相對表達(dá)水平

在所預(yù)測的4個(gè)候選基因中，已有研究表明MD10G1185400可能參與調(diào)控蘋果柱狀樹型[19,31]。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，MD10G1185400與WOLTERS等[31]報(bào)道的（downy mildew resistance 6-like）和OKADA等[19]報(bào)道的是同一個(gè)基因。WOLTERS等[31]發(fā)現(xiàn)，與普通型蘋果相比，在柱狀蘋果腋芽部位顯著上調(diào)表達(dá)。OKADA等[19]發(fā)現(xiàn)基因也是僅在柱狀蘋果中表達(dá)，而在普通型蘋果中不表達(dá)。本研究與其相似，該基因在柱狀蘋果‘舞佳’和‘潤太’的側(cè)枝莖尖中高表達(dá)，并且在柱狀蘋果和普通型蘋果不同部位以及不同時(shí)期中的表達(dá)量均有顯著差異。OKADA等[19]將轉(zhuǎn)入煙草中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的株高降低和節(jié)間長度變短，在蘋果中過表達(dá)該基因也引起節(jié)間變短，依此推斷，可能是候選基因，但柱狀蘋果的生長表型不僅僅是節(jié)間短。進(jìn)一步通過對MD10G1185400進(jìn)行分析，表明MD10G1185400屬于2OGDs的DOXC41亞家族，DOXC41亞家族成員基因功能多樣，參與各種特殊代謝，如莨菪堿6-羥化酶（H6H）和大麥鐵缺乏，但蘋果柱狀性狀與這幾種物質(zhì)代謝好像又關(guān)系不大，MD10G1185400的具體功能依然未知，其是否在激素通路或者其他通路中發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步研究。另外一個(gè)候選基因MD10G1184100是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，為MYB domain protein 15，在柱狀蘋果中顯著上調(diào)表達(dá)。擬南芥的同源基因在防御誘導(dǎo)的木質(zhì)化和基礎(chǔ)免疫中發(fā)揮著作用，沉默降低了防御誘導(dǎo)的木質(zhì)素的含量，而過表達(dá)增加了木質(zhì)素含量[32]。推測柱狀蘋果樹主干上萌發(fā)出的直立側(cè)枝，可能與木質(zhì)素合成異常有關(guān)，因此，這個(gè)基因也有待驗(yàn)證。PETERSEN等[18]研究發(fā)現(xiàn)，MDP0000163720在狀狀蘋果‘P28’的頂端分生組織中上調(diào)表達(dá)。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，MDP0000163720與本研究中的MD10G1185600是同一個(gè)基因，且表達(dá)特征與其研究結(jié)果一致。MD10G1190500編碼一個(gè)肌球結(jié)合蛋白基因（myosin-binding protein 1-like，Myob），可直接與肌球蛋白結(jié)合，并將其募集到囊泡樣內(nèi)膜膜室中，從而快速沿著F-肌動(dòng)蛋白軌跡移動(dòng)[33]。MD10G1190500在柱狀蘋果側(cè)枝莖尖、花、果實(shí)和葉片中的表達(dá)量顯著大于普通型蘋果。肌球結(jié)合蛋白基因在植物中研究較少，MD10G1190500是否與蘋果柱狀樹形有關(guān)，有待深入研究。具體哪一個(gè)基因調(diào)控柱狀蘋果樹形，還需進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因的生物學(xué)功能，可能還與植物激素IAA、CK和GA的代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；同時(shí)，筆者在柱狀的雜交群體中發(fā)現(xiàn)，雜交后代中柱狀的植株比例通常小于50%的理論值。另外，柱狀蘋果的雜交后代中，有些植株攜帶著反轉(zhuǎn)座子插入標(biāo)記，但卻表現(xiàn)出普通型的表型，表明其他基因可能對起修飾作用。

4 結(jié)論

通過對蘋果定位區(qū)域進(jìn)行注釋分類和篩選，檢測到67個(gè)基因，其中12個(gè)為非編碼RNA，其余為編碼蛋白質(zhì)的基因。根據(jù)RNA-seq分析67個(gè)基因在柱狀和普通型蘋果表達(dá)特征并結(jié)合基因功能預(yù)測，篩選到14個(gè)預(yù)測基因，通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因（MD10G1184100、MD10G1185400、MD10G1185600和MD10G1190500）在柱狀和普通型蘋果的主枝莖尖或側(cè)枝莖尖存在顯著表達(dá)差異，可作為候選基因。

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Screening and Expression Analysis ofCandidate Genes in Columnar Apple

BAI TuanHui, LI Li, ZHENG XianBo, WANG MiaoMiao, SONG ShangWei, JIAO Jian, SONG ChunHui

(College of Horticulture, Henan Agricultural University/Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology, Zhengzhou 450002)

【】Columnar growth in apple (×Borkh.) is a special type of dwarf mutation. Due to short internodes and lateral branches, a limited canopy and minimal pruning, columnar apple trees are well adapted to high density plantings. Based on the fine mapping of, the genes in the localization interval were screened, which laid a foundation for elucidating the molecular mechanism of columnar apple formation and breeding new varieties of columnar apples.【】Based on the latest apple genome data and transcriptome information, the buds, stem tips and leaves of columnar apple Wujia, Runtai No.1 and standard apple Fuji and Huashuo were used as test materials, and the genes between the fine mappinggene in interval from 27.66 Mb to 29.05 Mb were annotated and predicted. The coding sequence of the target gene was selected to detect primer specificity by RT-PCR, the real-time quantitative PCR was used to analyze the expression characteristics of target genes in different tissues and organs, and differential genes were screened out as candidate genes.【】The results showed that there were 67 genes between 27.66 Mb and 29.05 Mb in chromosome 10, 12 of which were non-coding RNAs (ncRNA), and the rest were genes with encoding proteins. According to the columnar and standard apple RNA-seq, there were 25 genes with more than 1 fold difference, 13 of which were up-regulated, and 12 genes were down-regulated in columnar apples. Among the 14 predicted genes, there were significant differences in the relative expression of the four genes MD10G1184100, MD10G1185400, MD10G1185600 and MD10G1190500 between shoot tips and lateral shoot tips in columnar and standard apples. The relative expression levels of MD10G1184100 and MD10G1185600 in the tip ofterminal bud of two columnar apples were significantly higher than those of both standard apples. The relative expression of MD10G1185400 and MD10G1190500 genes in the tip of lateral bud of two columnar apples was significantly higher than that of two standard apples, while the expression of MD10G1184100 gene in two columnar apples was significantly lower than that of standard apples. The gene expression patterns of different tissues or organs of four candidate genes were analyzed. The result showed that the expression of MD10G1184100 gene in the roots of columnar apples was significantly higher than that in other tissues. The MD10G1185400 and D10G1185600 genes were significantly expressed in lateral tips in columnar apples, while MD10G1190500 gene was prominently expressed in the terminal bud of columnar apples.【】4 genes with significant differences in columnar and standard apple could be regarded ascandidate genes, which laid a foundation for gene cloning and functional verification and apple tree-oriented genetic improvement.

apple; columnar trait; gene mapping; gene expression; candidate gene analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.015

2019-07-17；

2019-09-06

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000300）、河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃（2018GGJS029）、河南省自然科學(xué)基金（162300410132）、河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A210475）

通信作者白團(tuán)輝，E-mail：tuanhuibai88@163.com。通信作者宋春暉，E-mail：songchunhui060305@126.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）