王尋，陳西霞，李宏亮，張富軍，趙先炎，韓月彭，王小非，郝玉金

蘋果NLP（Nin-Like Protein）轉錄因子基因家族全基因組鑒定及表達模式分析

王尋，陳西霞，李宏亮，張富軍，趙先炎，韓月彭，王小非，郝玉金

（山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

【】探究蘋果NLP轉錄因子全基因組特征與表達模式，以便更深入地了解其結構特點與作用機制。基于本地BLAST數(shù)據(jù)庫和Pfam數(shù)據(jù)庫兩大數(shù)據(jù)庫，運用blastp和hmmsearch兩種查詢策略，對蘋果全基因組范圍內的NLP轉錄因子家族成員進行鑒定。經(jīng)過嚴格篩選與確認后，對搜索結果進一步展開分析，主要分為3部分，包括NLP蛋白分析、分析與蘋果表達分析，其中ProtParam、Clustal Omega、MEGA7、MEME 5.0.2、SOPMA、Phyre2、WoLF PSORT、STRING等程序或軟件用于蛋白質分析，基因分析使用MG2C、GSDS 2.0、PlantCARE、psRNATarget等在線工具，對于蘋果表達情況利用qRT-PCR進行定量檢測。從蘋果全部蛋白數(shù)據(jù)庫中共篩選出6個NLP成員，系統(tǒng)進化分析可將它們分為I、II、III三類；蛋白二級結構以無規(guī)則卷曲為主，其次是-螺旋，占比最小的是-轉角；亞細胞定位預測均定位于細胞核中，符合轉錄因子的特征；染色體定位顯示5個基因（MDP0000584547除外）定位于4條染色體上；啟動子分析發(fā)現(xiàn)大量與激素和逆境響應相關的順式作用元件，暗示它們可能參與到激素和逆境信號的調控過程中，此外還識別到一個響應氮的GCN4作用元件，進一步說明該類轉錄因子與氮素有密不可分的關系；通過定量檢測揭示蘋果NLP家族在莖、葉等組織高表達的特征模式，并且表達分析結果也證實蘋果響應氮饑餓、干旱脅迫等。通過對蘋果全基因組的分析，共識別6個NLP轉錄因子，對6個基因的結構與蛋白保守域分析，發(fā)現(xiàn)它們之間具有極高的相似性、保守性，同時又存在差異。類比擬南芥NLP蛋白的關聯(lián)網(wǎng)絡，推測與擬南芥NLP7同源性最高的MDP0000132856可能也具有復雜的功能。

蘋果；NLP轉錄因子；氮信號；生物信息學

0 引言

【研究意義】植物氮素作為一種養(yǎng)分，對于植物生長發(fā)育具有十分重要的意義，近些年，氮素吸收轉運相關基因的功能調控研究比較廣泛，其中RWP-PK家族中的NLP轉錄因子亞家族響應氮饑餓并且在植物氮信號調節(jié)過程中處于中心地位[1]。因此，通過的研究可以對氮素調節(jié)網(wǎng)絡相關基因進一步認識，從而對植物氮素利用提供指導。尤其是在蘋果等果樹上，通過研究該基因，為提高果樹氮肥利用效率與提質增效帶來新的思考。【前人研究進展】關于NLP（Nin-like protein）最早的研究可以追溯到豆科模式植物百脈根（nodule inception），起初作為根瘤感受基因，被鑒定影響到根瘤的早期發(fā)育[2]。隨后，在非豆科植物中對同源基因進行了大量鑒定，其中包括擬南芥[3]、水稻[3]、小麥[4]、玉米[5]、毛果楊[6]、枳[7]、甘藍型油菜[8]等。隨著對研究的深入，包括該家族蛋白結構域、調控網(wǎng)絡、表達模式等在一定程度上被揭示。前人通過比較不同物種NLP基因家族，發(fā)現(xiàn)NLP轉錄因子具有兩個典型的特征結構域，高度保守的RWP-RK結構域以及一個位于羧基端的PB1結構域，除此之外，在氨基酸序列的氨基端還有一個類似于GAF的結構域；已知RWP-RK結構域可以與DNA結合發(fā)揮作用，PB1結構域被認為具有蛋白質與蛋白質相互作用的功能[3]。關于的功能，模式植物擬南芥已有大量相關研究，MARCHIVE等[9]探究發(fā)現(xiàn)擬南芥中NLP7在早期響應硝酸鹽中扮演了重要角色，YAN等[10]證明NLP8對于硝酸鹽促進種子萌發(fā)至關重要，LIU等[11]發(fā)現(xiàn)在植株營養(yǎng)生長中重要的NO3--CPK-NLP信號通路，YU等[12]報道過表達擬南芥通過增強氮和碳的同化，在限制氮和充足氮的條件下均可以促進植物生長。上述研究證實，NLP轉錄因子在硝態(tài)氮響應與植株生長發(fā)育中發(fā)揮重要節(jié)點作用。【本研究切入點】許多豆科植物和非豆科植物中NLP轉錄因子家族基因已經(jīng)進行了鑒定，蘋果中相關信息尚未見報道，本研究利用已發(fā)布的蘋果參考基因組[13]（×-genome.v1.0）對全基因組范圍內的NLP轉錄因子成員進行搜索?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用生物信息學手段，首次對蘋果NLP轉錄因子全基因組成員進行鑒定，并從基因和蛋白水平上系統(tǒng)地對其預測分析，此外運用熒光定量PCR技術檢測的組織表達、氮響應過程及非生物脅迫變化情況，從而有助于蘋果NLP轉錄因子特點與功能的進一步探究。

1 材料與方法

試驗于2018年9月至2019年4月在山東農業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 植物材料與處理

試驗材料為種植于山東農業(yè)大學園藝試驗站（山東泰安）的十年生‘皇家嘎拉’蘋果樹和培養(yǎng)于實驗室中的生長4個月左右的蘋果砧木‘平邑甜茶’實生苗。在‘皇家嘎拉’蘋果樹上分別取根、幼嫩莖、葉、花（初花期）、果實（花后70 d）后，將各組織迅速于液氮中冷凍，然后放置到-80℃超低溫冰箱貯藏，后續(xù)用于基因組織表達分析。從‘平邑甜茶’實生苗中選取生長狀況等較為一致的幼苗分別用于3個試驗處理：氮饑餓處理、干旱脅迫處理、ABA處理，其中對各個處理的每個取樣時間節(jié)點設置3個生物學重復。氮饑餓處理：取培養(yǎng)于基質中的實生苗18株，轉移至氮饑餓環(huán)境（蛭石+澆施缺氮營養(yǎng)液（成分：1.2 mol?L-1KH2PO4、0.1 mol?L-1CaCl2、1 mol?L-1MgSO4、0.1 mmol?L-1Fe鹽、微量、1 mol?L-1KCl））繼續(xù)培養(yǎng)，0、3、6、12、24和36 h分別全株取樣。干旱脅迫處理：取培養(yǎng)于基質中的實生苗24株，轉移至干旱環(huán)境（干燥基質）繼續(xù)培養(yǎng)，0、0.5、1、3、6、12、24和48 h分別全株取樣。ABA處理：取培養(yǎng)于基質中的實生苗18株，轉移至ABA處理環(huán)境（澆施0.1 mmol?L-1ABA溶液）繼續(xù)培養(yǎng)，0、1、3、6、12和24 h分別全株取樣。3個試驗處理所取樣品迅速置于液氮中冷凍，而后儲存于超低溫冰箱，后續(xù)用于氮饑餓響應分析和非生物脅迫表達分析。

1.2 蘋果NLP轉錄因子家族成員的識別

從NCBI下載擬南芥9個NLPs成員蛋白序列，蘋果蛋白數(shù)據(jù)庫來自GDR[14]（https://www.rosaceae.org），采用-genome.v1.0版本，以9個擬南芥序列為查詢序列，以蘋果全部蛋白序列為庫，進行本地blastp搜索，其中E值設定為小于1e-5；此外，基于隱馬爾科夫模型的查詢策略，從Pfam數(shù)據(jù)庫[15]（http://pfam.xfam.org/）下載蛋白保守結構域RWP-RK(PF02042)文件，執(zhí)行hmmsearch命令，其中E值設定為小于1e-5。采用兩種方法得到的蘋果NLP蛋白去重與整合后，通過NCBI的Batch CD-search與EMBL的SMART進行結構域（RWP-RK、PB1）確認，最終獲得蘋果NLP轉錄因子家族成員。

1.3 蘋果NLP蛋白分析

1.3.1 蘋果NLP蛋白理化特征 分子量大小、等電點等信息利用EXPASY中的在線工具ProtParam（http:// web.expasy.org/protparam/）進行計算。

1.3.2 蘋果NLP多序列比對與結構域分析 蛋白質多序列比對采用在線軟件Clustal Omega（https:// www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），比對結果在桌面版Jalview（Jalview 2.10.5）程序中進行編輯與可視化。

1.3.3 蘋果NLP的系統(tǒng)進化分析 水稻6個NLP成員下載于Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe. gov/pz/portal.html），來自擬南芥、水稻、蘋果NLP全部蛋白質序列用于構建系統(tǒng)發(fā)生樹，構樹軟件使用MEGA7[16]，多序列比對采用內置Muscle程序，參數(shù)保持默認，構樹方法選擇Neighbor-joining，檢驗方法選擇bootstrap method，重復1 000次，置換模型選擇poisson model。

1.3.4 蘋果NLP保守基序分析 Linux系統(tǒng)中使用MEME[17]（版本：MEME 5.0.2）工具進行保守模體分析，參數(shù)設置為“meme MdNLPs.fa-protein-oc motif.out- nostatus-mod zoops-nmotifs 15-minw 6-maxw 60”。

1.3.5 蘋果NLP蛋白質結構分析 蛋白質二級結構預測利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html），對其中保守結構域的三級結構進行預測，使用Phyre2在線網(wǎng)站[18]（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi? id=index）。

1.3.6 蘋果NLP亞細胞定位預測 亞細胞定位預測使用在線程序WoLF PSORT：Protein Subcellular Localization Prediction[19]（https://www.genscript.com/ wolf-psort.html），生物類型選擇植物。

1.3.7 蘋果NLP家族蛋白相互作用網(wǎng)絡預測 通過功能蛋白關聯(lián)網(wǎng)絡在線網(wǎng)站STRING[20]（https://string- db.org）預測NLP家族成員相關蛋白的互作關系，物種來源選擇模式物種擬南芥。

1.4 蘋果NLP分析

1.4.1 蘋果染色體定位 在蘋果基因組注釋文件（×.v1.0.consensus.gff）中根據(jù)基因ID提取蘋果NLP家族成員位置信息，提交至在線軟件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）用于基因染色體定位。

1.4.2 蘋果結構分析 利用基因注釋信息，在北京大學基因結構可視化服務器GSDS2.0[21]（http://gsds. cbi.pku.edu.cn/）中進行蘋果NLP轉錄因子基因特征分析。

1.4.3 蘋果基因GO功能注釋 從注釋文件中獲取蘋果的GO條目信息，對功能注釋進行分類統(tǒng)計。

1.4.4 蘋果的啟動子分析 從蘋果基因組中提取翻譯起始位點ATG上游約2 000 bp的片段作為啟動子區(qū)域，將所有的啟動子序列提交至PlantCARE[22]（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/），進行啟動子順式作用元件的預測分析。

1.4.5 與蘋果相關miRNA的預測 利用植物小分子RNA靶標分析在線網(wǎng)站psRNATarget[23]（http:// plantgrn.noble.org/psRNATarget/）對與蘋果相關的miRNA進行預測。

1.5 蘋果NLP表達模式分析

‘皇家嘎拉’蘋果樹的根、莖、葉、花、果不同組織，‘平邑甜茶’蘋果苗的氮饑餓處理、干旱脅迫處理、ABA處理各時間點樣品，對它們的總RNA分別使用TRIzol Reagent試劑盒提取，RNA完整性和濃度分別利用瓊脂糖凝膠電泳、Thermo Nano Drop 2000儀器檢測。反轉錄合成cDNA過程采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，實時熒光定量PCR按照UltraSYBR Mixture（High ROX）試劑提供的方法進行，反應體系如下：2×UltraSYBR Mixture（High ROX）10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物（10 mmol?L-1）各1 μL，cDNA模板為1 μL，總體系為20 μL。qRT-PCR反應過程為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，58℃退火15 s，65℃延伸10 s，進行40次循環(huán)，其中每次循環(huán)第3步采集熒光信號，每個反應進行3次重復。定量引物的設計利用在線網(wǎng)站Primer3Plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/ dev/primer3plus.cgi），所有引物特異性均經(jīng)過NCBI的Nucleotide BLAST和Primer-BLAST（https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）驗證。本次試驗所使用的引物列于表1，其中（CN938023）作為蘋果內參基因?；蛳鄬Ρ磉_量的數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT的方法[24]，用Excel作圖。

2 結果

2.1 蘋果NLP轉錄因子家族成員鑒定及基本信息

通過兩種方法并進行嚴格篩選、確認，最終共獲得6個，且基因組注釋文件（×. v1.0.consensus.gff）均注釋到存在RWP-RK結構域、PB1結構域（MDP0000788505的蛋白氨基酸C末端缺失，只注釋到RWP-RK結構域）。根據(jù)其在染色體上的位置信息，依次命名為（MDP0000788505）、（MDP0000265619）、（MDP0000246881）、（MDP0000239938）、（MDP0000132856）、（MDP0000584547）。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，6個長度最小的為（3 856 bp），最長的為（10 212 bp），編碼序列長度在2 460—5 121 bp，編碼氨基酸數(shù)目在819—1 706，蛋白質的分子量在90 889.49—189 398.44 D，等電點5.45—7.9，具體信息見表2。

2.2 MdNLP蛋白結構域分析與多序列比對

在鑒定MdNLP的過程中，通過NCBI的SMART蛋白結構域查詢，可以發(fā)現(xiàn)蘋果NLP蛋白與擬南芥NLP蛋白均含有兩個典型的結構域（RWP-RK和PB1），使用Clustal Omega在線工具對9條擬南芥與6條蘋果NLP蛋白序列進行多序列比對，并用Jalview對兩個結構域進行編輯截取。由圖1可知，RWP-PK結構域保守性非常高，由大約50多個氨基酸組成，其中包含“RWPXRK”特征核苷酸組成，該結構域中只有極少的氨基酸位點一致性較差。在NLP蛋白C端的PB1結構域保守性較高，由大約80個氨基酸組成，比較特殊的是MdNLP1的PB1結構域C端部分缺失，只有大約30個氨基酸。

表2 蘋果NLP家族基因、蛋白特征及亞細胞定位預測

圖1 擬南芥與蘋果NLP蛋白的多序列比對與典型保守結構域

2.3 蘋果NLP蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹及Motif分析

來自蘋果、擬南芥、水稻的全部NLP蛋白序列（MdNLP1—6、AtNLP1—9、OsNLP1—6）用于構建系統(tǒng)發(fā)生樹，以RWP-RK結構域部分缺失的OsNLP6作為外類群。由圖2-a進化樹分支結構可以看出NLP家族蛋白明顯被分為3類，與SCHAUSER等[3]的研究結果一致，在蘋果NLP家族中，MdNLP6為一類（I），MdNLP2、MdNLP3、MdNLP4為一類（II），MdNLP1、MdNLP5聚為一類（III），擬南芥中研究最多的NLP7位于分支的第III類。蘋果與擬南芥NLP蛋白經(jīng)MEME軟件分析（圖2-b），識別的15種保守基序在這些序列中基本均有分布。其中RWP-RK保守結構域由Motif1和Motif12組成，PB1結構域由Motif5、Motif9、Motif15構成。對于MdNLP1而言，由于其C端PB1結構域不完整，只檢測到Motif9，而Motif15和Motif5兩個基序缺失。除此之外，參照CHARDIN等[25]的研究，對NLP蛋白另外的一個N端GAF結構域進行標注，蘋果NLP蛋白中GAF結構域包括Motif3、Motif4、Motif6、Motif8、Motif11、Motif13，與擬南芥的保守基序組成一致。

a圖中紅色實心圓點代表蘋果NLP蛋白，綠色實心三角代表擬南芥NLP蛋白，藍色實心方形代表水稻NLP蛋白

2.4 蘋果NLP蛋白結構預測

對MdNLP蛋白進行二級結構預測，從表3看出，6個蛋白質二級結構都以無規(guī)卷曲和螺旋為主，其中無規(guī)卷曲占到最大比例，此外二級結構中還包含轉角，所占比例都是最小的，而且在這些蛋白質中各二級結構所占比例大致相似。為了比較蘋果NLP蛋白中3種結構域（GAF-like、RWP-RK、PB1）的結構特征，本次研究采用同源建模的方法繪制出保守區(qū)段的三維蛋白模型（圖3）。通過比較這些模型，很直觀地觀察到蘋果NLP蛋白保守域結構的高度相似性，而往往特定結構與特殊功能相關聯(lián)，對此猜測蘋果中NLP家族的功能離不開這些區(qū)域。此外，注意到MdNLP1蛋白的PB1區(qū)段發(fā)生缺失，由于缺失序列較長，無法模擬出三級結構，這導致了其功能相較于其他家族成員可能會出現(xiàn)差異。

表3 蘋果NLP蛋白質二級結構

2.5 蘋果NLP蛋白的亞細胞定位預測

擬南芥中NLP7被證明，在沒有硝酸鹽信號時其存在于細胞質中，外部施加硝酸鹽后，NLP7聚集到細胞核中[9]，這是很明顯的轉錄因子的特點。為了驗證蘋果中此類蛋白的定位情況，利用亞細胞定位預測在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT對其進行鑒定，結果（表2）證實蘋果NLP有極大可能性定位于細胞核，很低的比例預測到非細胞核區(qū)域，符合轉錄因子的特征。

2.6 蘋果NLP蛋白相互作用蛋白網(wǎng)絡構建

為了預測蘋果中NLP轉錄因子潛在的功能，利用STRING網(wǎng)站根據(jù)模式物種擬南芥中的同源序列，構建了蘋果NLP蛋白相互作用關系網(wǎng)絡（圖4），由圖可知，MdNLP1對應AT1G64530（AtNLP6），MdNLP2對應AT3G59580（AtNLP9），MdNLP3與MdNLP4均對應AT2G43500（AtNLP8），MdNLP5對應NLP7（AT4G24020），MdNLP6對應AT1G76350（AtNLP5）；網(wǎng)絡圖顯示，與擬南芥NLP蛋白相互作用的有硝酸鹽轉運蛋白NRT1.1（AT1G12110）、NRT2.1（AT1G08090），胞質硝酸還原酶NIA1（AT1G77760）等，可以看出，NLP蛋白大多和氮素轉運、同化等蛋白相關。此外，由擬南芥的相互作用蛋白，注意到AtNLP7和AtNLP6關系比較復雜，相關聯(lián)蛋白較多，預測蘋果中MDP0000132856和MDP0000788505相較于其他的蘋果NLP家族成員可能具有更關鍵的作用。

2.7 蘋果NLP染色體定位、基因結構分析與GO功能注釋

利用蘋果基因組注釋（×.v1.0. consensus.gff）對蘋果進行染色體定位及基因結構分析，通過比較發(fā)現(xiàn)蘋果分別定位于2號染色體（）、4號染色體（）、12號染色體（和）、15號染色體（），由于非染色體定位，沒有在圖中展示（圖5-a）。由蘋果外顯子-內含子分析可以得知外顯子數(shù)目在5—14，另外，有意思的是和，和分別具有非常相似的基因組成（圖5-b），加上前文對蘋果NLP蛋白結構和系統(tǒng)進化關系的分析，推測這兩組組內可能具有極其類似的功能。利用蘋果基因組注釋文件中GO（Gene Ontology）條目，對蘋果的GO分類功能注釋進行了統(tǒng)計（表4），GFF文件共提取到3個的9個GO編號，分別是（GO:0005524，GO:0017111，GO:0016887，GO:0016020，GO:0016021，GO:0006810，GO:0000166），（GO:0008270，GO:0000166，GO:0003676），（GO:0000166，GO:0003676，GO:0008270），GO分類共分為分子功能、生物途徑、細胞組分3大部分，MdNLP家族富集到的GO條目主要集中于分子功能中的核苷酸結合、鋅離子結合、核酸結合等。此外，生物途徑一類中注釋到1個有關轉運的功能，以上都間接證明蘋果NLP家族是作為轉錄因子發(fā)揮作用的。

圖3 蘋果NLP蛋白保守域三級結構的同源建模預測

蘋果同源蛋白編號以紅色字體突出顯示 The name of apple homologous proteins are highlighted in red

圖5 蘋果NLP基因的染色體定位（a）與基因結構分析（b）

表4 蘋果NLP GO分類統(tǒng)計列表

2.8 蘋果NLP的啟動子分析及其相關miRNA預測

通過對啟動子的分析（表5），鑒定到了大量和激素相關的順式作用元件，其中包括響應生長素的TGA-element，響應赤霉素的GARE-motif，響應乙烯的ERE，響應脫落酸的ABRE，響應茉莉酸甲酯的CGTCA-motif，響應水楊酸的TCA-element等元件。另外，還在啟動子中預測到了一個與氮素響應相關的GCN4元件[26]，這與KUMAR等[4]在小麥中的研究結果相似。MicroRNA作為一種小分子調節(jié)物質，廣泛參與到基因的表達調控過程中，本研究對蘋果NLP基因家族成員相關聯(lián)的miRNA進行預測。依據(jù)前人關于氮素響應相關miRNA的研究[27-28]，在預測中發(fā)現(xiàn)了一些可能參與NLP介導的氮響應的miRNA，主要是mdm-miRNA169、mdm-miRNA171、mdm-miRNA395三個家族，結果列于表6，推測這些miRNA可能通過與MdNLP轉錄因子相互作用進而調控氮響應過程。

表5 蘋果NLP啟動子的順式作用元件預測

表格第一行表示順式調控元件與響應類型，表中數(shù)字代表正鏈與負鏈上的順式元件個數(shù)

The first row of the table shows the cis-regulating elements and response types, and the numbers in the table represent the number of cis-regulating elements on the positive and negative chains

2.9 蘋果NLP轉錄因子家族基因表達模式

為了研究蘋果NLP家族基因的時空表達規(guī)律，對蘋果的組織表達模式進行了定量分析。根據(jù)圖6結果可知，蘋果NLP基因家族成員不同發(fā)育時期的表達特征稍有差別，但大致相似。所驗證的4個（由于結構域缺失、非染色體定位，此處沒有檢測，后文定量研究均采用上述考慮）在根、莖、葉、花、果中均有不同程度的表達，明顯可見蘋果中NLP家族基因更偏向在葉片、莖等營養(yǎng)器官中表達，、、、基因表達量最高的部位分別是莖、葉片、葉片、葉片。

為了研究氮素匱乏條件下的響應過程，對‘平邑甜茶’實生苗進行氮饑餓處理，結果發(fā)現(xiàn)（圖7），在所取的氮饑餓處理的幾個時間節(jié)點，所檢測的4個基因，相較于最初的0 h，基因表達量均有不同程度的提高，表達變化趨勢大致相似，先升高后降低。

表6 推測與蘋果NLP相關的響應氮素的miRNA

圖6 蘋果NLP組織表達分析

圖7 蘋果NLP氮饑餓響應表達分析

由于NLP轉錄因子可能與植物的抗旱性有關[7]，對此，本研究進行了蘋果干旱脅迫表達分析。由圖8可以發(fā)現(xiàn)，除了，其余3個基因（、、）在研究的時間范圍內，隨著干旱脅迫時間的增加，基因的表達量均呈現(xiàn)出先升高，到6 h表達量達最高，之后降低的一種表達情況。

除此之外，在對蘋果啟動子進行分析時，找到大量與激素相關的調控元件，本研究還分析了ABA處理下蘋果的表達模式，結果如圖8所示。、在ABA誘導下表達量總體上調，而、表達量則呈現(xiàn)總體下調的趨勢。

3 討論

一直以來，轉錄因子家族的研究都是一個熱點話題，這是因為功能基因調控機制的闡釋離不開轉錄因子。例如對成員數(shù)目較多的一些轉錄因子家族的分析：MYB[29]、NAC[30]、bHLH[31]、bZIP[32]、WRKY[33]、LBD[34]。本研究對一個響應氮饑餓的Nin-like轉錄因子家族在蘋果全基因組中進行了鑒定，并且利用生物信息學的手段，系統(tǒng)分析了此類轉錄因子的基因與蛋白特征以及不同處理下的表達水平。

NLP轉錄因子的功能已經(jīng)進行了大量研究，除了已知的響應硝酸鹽信號，還具有調節(jié)干旱脅迫抗性[35]的特點，另外有研究發(fā)現(xiàn)Nin通過與NLP相互作用介導硝酸鹽對結瘤的抑制作用[36]，GUAN等[37]證明NLP6/7與TCP20的相互作用可以促進N饑餓條件下根分生組織的生長。

本研究基于已公開發(fā)表的蘋果基因組測序數(shù)據(jù)[13]，一共識別到了6個蘋果基因家族成員，已知擬南芥中有9個[3]，水稻中有6個[3]，GE等[5]鑒定了9個玉米，曹雄軍等[7]在甜橙蛋白質組數(shù)據(jù)中篩選到4個甜橙，由此可見在不同物種中數(shù)量存在差異。通過將擬南芥和蘋果NLP蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)在保守結構域RWP-RK附近除個別氨基酸位點外，其余位置保守程度很高，這一結構域對DNA結合很重要，另外位于C末端的PB1結構域相對較為保守，比較特殊的是，MdNLP1（MDP0000788505）C端缺失，關于N端附近的GAF-like結構域，朱新宇等[38]通過比較NLP與Nin的GAF區(qū)段二、三級結構，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在變異，導致它們可能執(zhí)行不同功能。

圖8 蘋果NLP非生物脅迫（干旱處理和ABA處理）表達分析

擬南芥中已知，NLP6和NLP7通過感知硝酸鹽信號后活性被誘導，進而結合到具有硝酸鹽響應元件（nitrate-responsive elements，NREs）的一系列和硝酸鹽轉運、同化相關的基因上，包括高親和力硝酸鹽轉運基因、亞硝酸還原酶等基因的啟動子上，硝酸還原酶的3′側翼區(qū)等[39]。KONISHI等[40]報道兩類轉錄因子基因和也可能是NLPs的靶基因，它們可能在響應硝酸鹽過程中觸發(fā)二級轉錄事件。本次將蘋果NLP蛋白映射到模式植物擬南芥中，同樣地發(fā)現(xiàn)了這些與NLP相互聯(lián)系的基因，其中涉及硝酸鹽轉運、同化以及受氮誘導調控、影響氮素代謝的部分基因。類比擬南芥NLP6和NLP7，蘋果中MDP0000788505、MDP0000132856在關聯(lián)網(wǎng)絡中處于關鍵節(jié)點位置，推測也具有非常重要的功能。以作靶基因，對其潛在microRNA進行預測，找到了大量的可能與其相互作用的miRNA，參考其他物種中的miRNA的作用規(guī)律，有意思的是在本研究發(fā)現(xiàn)了3個可能靶向于并且響應硝酸鹽的miRNA家族，分別是mdm-miR169、mdm-miR171和mdm-miR395，其中2個miR171成員和9個miR395靶向作用于，2個miRNA169、5個miRNA171和9個miRNA395成員靶向作用于，蘋果中這些可能的調控作用有待進一步驗證。

關于的組織表達模式，CHARDIN等[25]通過分析GENEVESTIGATOR數(shù)據(jù)庫中有關擬南芥和水稻不同組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)分布廣泛，幾乎分布于所有的已檢測組織中（包括擬南芥的幼苗、根、莖、花，水稻的葉、節(jié)、花序等），其中在擬南芥中，和在衰老的葉片和種子中偏向表達，在水稻中，和偏向在源組織中表達；吳翔宇等[6]對毛果楊表達芯片數(shù)據(jù)進行提取，結果顯示毛果楊偏向在嫩葉、根中表達，除此之外，部分家族成員還在木質部這一輸導組織中有表達。與以上研究結果類似，本研究檢測的4個幾乎分布于蘋果的根、莖、葉、花、果各組織中，不同部位表達存在較明顯的差異，但更偏向于在莖、葉等器官中表達，這一特征可能與其參與轉運硝酸鹽的功能緊密聯(lián)系。同時，蘋果相較于表達量較高的莖組織而言，在根中的表達要低得多，說明蘋果NLP發(fā)揮作用涉及到硝酸鹽的轉運階段，而不是硝酸鹽的吸收過程，與KUMAR等[4]在小麥NLP中的研究觀點相吻合。

在氮饑餓處理條件下，蘋果表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（0—36 h），而LIU等[8]對甘藍型油菜中進行氮饑餓響應分析，發(fā)現(xiàn)在0—72 h階段內隨著時間延長，甘藍型油菜幼苗葉片和根的表達主要存在兩種趨勢：逐漸上升和逐漸下降。由此可見，蘋果與甘藍型油菜的氮饑餓響應過程存在差異，可能是由于采樣部位不同造成（本研究整株取樣，甘藍型油菜一文中為葉片和根分別取樣），亦或是不同物種相同基因的表達存在差異。

對蘋果苗干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)3個蘋果（、、）隨著干旱脅迫時間的延長，基因相對表達量逐漸增加，增大到最大值（6 h）后逐漸減少，這與曹雄軍等[7]研究干旱條件下，在枳葉片中的表達變化模式相似。氮饑餓處理和非生物脅迫處理結果表明，蘋果NLP轉錄因子響應氮饑餓過程、參與干旱脅迫進程等，由此可見，在氮代謝與逆境響應環(huán)節(jié)均發(fā)揮了重要的作用?？紤]到MDP0000132856與擬南芥NLP7的高同源性，互作網(wǎng)絡暗示其可能具有類似的調控關系，下一步可以圍繞該基因重點展開研究。

4 結論

從蘋果全部蛋白質序列鑒定MdNLP轉錄因子家族成員6個，啟動子和miRNA預測分析表明它們響應氮素，并可能被其他基因或小分子RNA所調控。組織表達模式分析觀察到蘋果偏向表達于莖、葉等地上部的營養(yǎng)器官，這也說明NLP蛋白在硝酸鹽轉運過程中的重要功能；氮饑餓響應表達分析，也再次證實蘋果NLP轉錄因子參與到氮素的調節(jié)過程。綜合比較發(fā)現(xiàn)蘋果NLP不同的成員蛋白結構和表達模式大致相似，但存在部分差異，推測在響應硝酸鹽的過程中扮演著不同但又有關聯(lián)的角色。

[1] KONISHI M, YANAGISAWA S.NIN-like transcription factors have a central role in nitrate signalling., 2013, 4: 1617.

[2] SCHAUSER L, ROUSSIS A, STILLER J, STOUGAARD J. A plant regulator controlling development of symbiotic root nodules., 1999, 402(6758): 191-195.

[3] SCHAUSER L, WIELOCH W, STOUGAARD J. Evolution of NIN-like proteins in, rice, and., 2005, 60(2): 229-237.

[4] KUMAR A, BATRA R, GAHLAUT V, GAUTAM T, KUMAR S, SHARMA M, TYAGI S, SINGH K P, BALYAN H S, PANDEY R, GUPTA P K. Genome-wide identification and characterization of gene family for RWP-RK transcription factors in wheat (L.)., 2018, 13(12): e0208409.

[5] GE M , LIU Y H, JIANG L, WANG Y C, LV Y D, ZHOU L, LIANG S Q, BAO H B, ZHAO H. Genome-wide analysis of maize NLP transcription factor family revealed the roles in nitrogen response., 2018, 84(1): 95-105.

[6] 吳翔宇, 許志茹, 曲春浦, 李蔚, 孫琦, 劉關君. 毛果楊NLP基因家族生物信息學分析與鑒定. 植物研究, 2014, 34(1): 37-43.

WU X Y, XU Z R, QU C P, LI W, SUN Q, LIU G J. Genome-wide identification and characterization of NLP gene family in., 2014, 34(1): 37-43. (in Chinese)

[7] 曹雄軍, 盧曉鵬, 熊江, 李靜, 吳倩, 周芳芳, 謝深喜. 枳NLP轉錄因子克隆及其在不同水分條件下的表達. 中國農業(yè)科學, 2016, 49(2): 381-390.

CAO X J, LU X P, XIONG J, LI J, WU Q, ZHOU F F, XIE X S. Cloning and expression of(L.) Raf. NIN-Like transcription factors under different water conditions., 2016, 49(2): 381-390. (in Chinese)

[8] LIU M, CHANG W, FAN Y H, SUN W, QU C M, ZHANG K, LIU L Z, XU X F, TANG Z L, LI J N, LU K. Genome-wide identification and characterization offamily genes in., 2018, 19(8): 2270.

[9] MARCHIVE C, ROUDIER F, CASTAINGS L, BRéHAUT V, BLONDET E, COLOT V, MEYER C, KRAPP A. Nuclear retention of the transcription factor NLP7 orchestrates the early response to nitrate in plants., 2013, 4: 1713.

[10] YAN D W, EASWARAN V, CHAU V, OKAMOTO M, IERULLO M, KIMURA M, ENDO A, YANO R, PASHA A, GONG Y C, BI Y M, PROVART N, GUTTMAN D, KRAPP A, ROTHSTEIN S J, NAMBARA E. NIN-like protein 8 is a master regulator of nitrate- promoted seed germination in., 2016, 7: 13179.

[11] LIU K H, NIU Y J, KONISHI M, WU Y, DU H, CHUNG H S, LI L, BOUDSOCQ M, MCCORMACK M, MAEKAWA S, ISHIDA T, ZHANG C, SHOKAT K, YANAGISAWA S, SHEEN J. Discovery of nitrate-CPK-NLP signalling in central nutrient-growth networks., 2017, 545(7654): 311.

[12] YU L H, WU J, TANG H, YUAN Y, WANG S M, WANG Y P, ZHU Q S, LI S G, XIANG C B. Overexpression ofimproves plant growth under both nitrogen-limiting and -sufficient conditions by enhancing nitrogen and carbon assimilation., 2016, 6: 27795.

[13] VELASCO R, ZHARKIKH A, AFFOURTIT J, DHINGRA A, CESTARO A, KALYANARAMAN A, FONTANA P, BHATNAGAR S K, TROGGIO M, PRUSS D, SALVI S, PINDO M, BALDI P, CASTELLETTI S, CAVAIUOLO M, COPPOLA G, COSTA F, COVA V, RI A D, GOREMYKIN V,. The genome of the domesticated apple (×Borkh.)., 2010, 42(10): 833-839.

[14] JUNG S, LEE T, CHENG C H, BUBLE K, ZHENG P, YU J, HUMANN J, FICKLIN S P, GASIC K, SCOTT K, FRANK M, RU S, HOUGH H, EVANS K, PEACE C, OLMSTEAD M, DEVETTER L W, MCFERSON J, COE M, WEGRZYN J L, STATON M E, ABBOTT A G, MAIN D. 15 years of GDR: New data and functionality in the Genome Database for Rosaceae., 2018, 47(D1): D1137-D1145.

[15] FINN R D, BATEMAN A, CLEMENTS J, COGGILL P, EBERHARDT R Y, EDDY S R, HEGER A, HETHERINGTON K, HOLM L, MISTRY J, SONNHAMMER E L L, TATE J, PUNTA M. Pfam: The protein families database., 2013, 42(D1): D222-D230.

[16] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets., 2016, 33(7): 1870-1874.

[17] BAILEY T L, WILLIAMS N, MISLEH C, LI W W. MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs., 2006, 34(suppl_2): W369-W373.

[18] KELLEY L A, MEZULIS S, YATES C M, WASS M N, STERNBERG M J E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis., 2015, 10(6): 845-858.

[19] HORTON P, PARK K J, OBAYASHI T, FUJITA N, HARADA H, ADAMS-COLLIER C J, NAKAI K. WoLF PSORT: Protein localization predictor., 2007, 35(suppl_2): W585-W587.

[20] SZKLARCZYK D, GABLE A L, LYON D, JUNGE A, WYDER S, HUERTA-CEPAS J, SIMONOVIC M, DONCHEVA N T, MORRIS J H, BORK P, JENSEN L J, VON MERING C. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets., 2018, 47(D1): D607-D613.

[21] Hu B, Jin J P, Guo A Y, ZHANG H, LUO J C, GAO G. GSDS 2.0: An upgraded gene feature visualization server., 2014, 31(8): 1296-1297.

[22] LESCOT M, DéHAIS P, THIJS G, MARCHAL K, MOREAU Y, VAN DE PEER Y, ROUZé P, ROMBAUTS S. PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences., 2002, 30(1): 325-327.

[23] Dai X B, Zhuang Z H, Zhao P X C. psRNATarget: A plant small RNA target analysis server (2017 release)., 2018, 46(W1): W49-W54.

[24] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod., 2001, 25(4): 402-408.

[25] CHARDIN C, GIRIN T, ROUDIER F, MEYER C, KRAPP A. The plant RWP-RK transcription factors: Key regulators of nitrogen responses and of gametophyte development., 2014, 65(19): 5577-5587.

[26] MüLLER M, KNUDSEN S. The nitrogen response of a barley C-hordein promoter is controlled by positive and negative regulation of the GCN4 and endosperm box., 1993, 4(2): 343-355.

[27] 趙勐. 玉米氮素營養(yǎng)相關小分子非編碼RNA的克隆及miRNA169的功能鑒定[D]. 北京: 中國農業(yè)大學, 2014.

ZHAO M. Cloning of small RNAs related to nitrogen nutrition in maize and functional analysis of miRNA169 [D]. Beijing: China Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[28] 許振華. 玉米低硝酸鹽響應microRNA及靶基因鑒定與驗證[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2011.

XU Z H. Identification and verification of microRNAs and their targets on response low nitrate in maize [D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2011. (in Chinese)

[29] 嚴莉, 王翠平, 陳建偉, 喬改霞, 李健. 基于轉錄組信息的黑果枸杞MYB轉錄因子家族分析. 中國農業(yè)科學, 2017, 50(20): 3991-4002.

YAN L, WANG C P, CHEN J W, QIAO G X, LI J. Analysis of MYB transcription factor family based on transcriptome sequencing inMurr.., 2017, 50(20): 3991-4002. (in Chinese)

[30] 姜秀明, 牛義嶺, 許向陽. 番茄NAC基因家族的系統(tǒng)進化及表達分析. 分子植物育種, 2016, 14(8): 1948-1964.

JIANG X M, NIU Y L, XU X Y. Phylogenetic evolution and expression analysis of NAC gene family in tomato ()., 2016, 14(8): 1948-1964. (in Chinese)

[31] MAO K, DONG Q L, LI C, LIU C H, MA F W. Genome wide identification and characterization of apple bHLH transcription factors and expression analysis in response to drought and salt stress., 2017, 8: 480.

[32] 孫明岳, 周君, 譚秋平, 付喜玲, 陳修德, 李玲, 高東升. 蘋果bZIP轉錄因子家族生物信息學分析及其在休眠芽中的表達. 中國農業(yè)科學, 2016, 49(7): 1325-1345.

SUN M Y, ZHOU J, TAN Q P, FU X L, CHEN X D, LI L, GAO D S. Analysis of basic leucine zipper genes and their expression during bud dormancy in apple (×)., 2016, 49(7): 1325-1345. (in Chinese)

[33] 董蔚, 鄔培祥, 楊寧, 劉錫江, 宋玉光. 紫花苜蓿鹽脅迫響應WRKY轉錄因子的克隆及表達特征分析. 植物生理學報, 2018, 54(9): 1481-1489.

DONG W, WU P X, YANG N, LIU X J, SONG Y G. Cloning and expression analysis of WRKY transcription factor involved in salinity stress in alfalfa., 2018, 54(9): 1481-1489. (in Chinese)

[34] 王小非, 劉鑫, 蘇玲, 孫永江, 張世忠, 郝玉金, 由春香. 番茄LBD基因家族的全基因組序列鑒定及其進化和表達分析. 中國農業(yè)科學, 2013, 46(12): 2501-2513.

WANG X F, LIU X, SU L, SUN Y J, ZHANG S Z, HAO Y J, YOU C X. Identification, evolution and expression analysis of the LBD gene family in tomato., 2013, 46(12): 2501-2513. (in Chinese)

[35] CASTAINGS L, CAMARGO A, POCHOLLE D, GAUDON V, TEXIER Y, BOUTET-MERCEY S, TACONNAT L, RENOU J P, DANIEL-VEDELE F, FERNANDEZ E, MEYER C, KRAPP A. The nodule inception-like protein 7 modulates nitrate sensing and metabolism in., 2009, 57(3): 426-435.

[36] LIN J S, LI X L, LUO Z P, MYSORE K S, WEN J Q, XIE F. NIN interacts with NLPs to mediate nitrate inhibition of nodulation in., 2018, 4(11): 942-952.

[37] GUAN P Z, RIPOLL J J, WANG R H, VUONG L, BAILEY- STEINITZ L J, YE D N, CRAWFORD N M. Interacting TCP and NLP transcription factors control plant responses to nitrate availability., 2017, 114(9): 2419-2424.

[38] 朱新宇, 呂萬勝, 余春梅, 汪保華. 根瘤感受樣基因的進化: 結構歧異與功能分化. 植物學報, 2013, 48(5): 519-530.

ZHU X Y, Lü W S, YU C M, WANG B H. Evolution of nodular inception-like genes: Structural divergence and functional differentiation., 2013, 48(5): 519-530. (in Chinese)

[39] YANAGISAWA S. Transcription factors involved in controlling the expression of nitrate reductase genes in higher plants., 2014, 229: 167-171.

[40] KONISHI M, YANAGISAWA S. Emergence of a new step towards understanding the molecular mechanisms underlying nitrate-regulated gene expression., 2014, 65(19): 5589-5600.

Genome-wide Identification and Expression Pattern Analysis of NLP (Nin-like Protein) Transcription Factor Gene Family in Apple

WANG Xun, CHEN XiXia, LI HongLiang, ZHANG FuJun, ZHAO XianYan, HAN YuePeng, WANG XiaoFei, HAO YuJin

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong)

【】The study was carried out to explore the whole genome characteristics and expression patterns of NLP transcription factors in apple, and further understand its structural characteristics and mechanism.【】Based on the local BLAST database and Pfam database, the members of NLP transcription factor family in the whole genome of apple were identified by using two query strategies with blastp and hmmsearch. Through strict filtration and confirmation, the results were used for further analysis, and analysis mainly divides into three parts, including NLP proteins analysis, analysis ofgenes andexpression analysis in apple. Programs or softwares, such as ProtParam, Clustal Omega, MEGA7, MEME 5.0.2, SOPMA, Phyre2, WoLF PSORT and STRING, were used for protein analysis, online tools included MG2C, GSDS2.0, PlantCARE, psRNATarget, were used for gene analysis, and the expression ofgene was quantitatively detected by qRT-PCR.【】6 NLP members were identified from apple protein databases, which were classified into three categories by phylogenetic analysis: I, II and III. The protein secondary structure was dominated by random coil, followed by alpha-helix, and the smallest proportion was beta-turn. The prediction of subcellular localization was located in the nucleus, which was consistent with the characteristics of transcription factors. Chromosome localization showed that five genes (except MDP0000584547) were located on four chromosomes. Promoter analysis revealed a large number of cis-acting elements related to hormone and stress response, suggesting thatgenes might be involved in the regulation of hormone and stress signals. In addition, a nitrogen-responsive GCN4 element was also identified, further indicating that such transcription factors were closely related to nitrogen. By quantitative detection, the pattern which NLP family had high expression in stem and leaf of apple was revealed. And the expression analysis results also confirmed thatgenes responded to nitrogen starvation and drought stress, and so on.【】Through the apple genome analysis, 6 NLP transcription factors were found; the analysis of structure and conserved domain of protein for 6 gene suggested that there had a very high similarity and conservation between them, at the same time, they were different in a way; the associated protein network of NLP family inwere used for MdNLPs, MDP0000132856, which had the highest homology with AtNLP7, might also have complicated features and functions.

apple; NLP transcription factor; nitrogen signal; bioinformatics

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.014

2019-04-28；

2019-06-26

國家自然科學基金（31601742）、山東省現(xiàn)代農業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（SDAIT-06-03）、國家現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-27）

王尋，E-mail：wx20145015@126.com。

郝玉金，Tel：0538-8246692；E-mail：haoyujin@sdau.edu.cn。通信作者王小非，E-mail：xfwang2004@163.com

（責任編輯 趙伶俐）