黃麗娜（云南師范大學(xué)，云南 昆明 650500）

過氧亞硝酸鹽（ONOO-）是生命系統(tǒng)中內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧（ROS）之一，它是通過超氧自由基（O2·-）和一氧化氮（NO）在體內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)生成的[1]。由于ONOO-是強(qiáng)的生物氧化劑，因此反應(yīng)活性很高，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，但是它在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，并且還表現(xiàn)出抗菌和抗菌活性[2]。ONOO-在生物體內(nèi)的含量過高或過低都會(huì)導(dǎo)致許多疾病，比如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等[3]。另外，ONOO-會(huì)引起許多細(xì)胞受損，包括DNA 和蛋白質(zhì)[4]。因此，開發(fā)具有高選擇性、高靈敏度，生物相容性好以及能夠特異性識別的方法來檢測ONOO-至關(guān)重要。然而，由于ONOO-也存在一些缺陷，如半衰期短（＜10ms），活性高，濃度低、在體內(nèi)難于被捕捉等[5]。所以，檢測生物體內(nèi)ONOO-也成為了巨大的挑戰(zhàn)。盡管已經(jīng)使用了許多方法來檢測ONOO-，但是具有熒光探針的熒光成像技術(shù)由于易于操作，高靈敏度和選擇性以及原位檢測而受到越來越多的關(guān)注[6，7]。

目前，盡管已經(jīng)有許多方法ONOO-進(jìn)行檢測，但是卻存在著許多缺陷，而熒光成像技術(shù)具高靈敏度、高選擇性、操作簡單及原位實(shí)時(shí)檢測等優(yōu)點(diǎn)。近紅外熒光探針分子由于具有高度共軛多烯的結(jié)構(gòu)，具有近紅外吸收和發(fā)射光譜、低背景熒光，組織穿透力強(qiáng)、抗干擾能力強(qiáng)，對細(xì)胞損傷小。另外，近紅外熒光探針主要是基于優(yōu)異的熒光團(tuán)（如菁染料、半菁染料、苯并吡喃腈、香豆素、羅丹明、氟硼吡咯等）來檢測ONOO-。

1 近紅外熒光分子探針用于檢測ONOO-

2013年，Han課題組基于氟硼吡咯熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一個(gè)基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）的比率熒光探針[8]。當(dāng)加入ONOO-后，探針在680nm 處逐漸增強(qiáng)，而在572nm 處的逐漸減弱，表現(xiàn)出了比色變化。該探針具有優(yōu)異的選擇性、高的靈敏度和抗干擾性，檢測限低至5μM。因此，該探針被應(yīng)用于RAW264.7細(xì)胞中的ONOO-的檢測。

2014 年，James 課題組報(bào)道了一種檢測內(nèi)源性O(shè)NOO-的熒光探針[9]。該探針是基于萘酰亞胺熒光團(tuán)和硼酸鹽設(shè)計(jì)的。在單糖（例如D-果糖）存在下，熒光信號增強(qiáng)，而在過氧亞硝酸鹽的存在下，與D-果糖結(jié)合時(shí)探針的熒光被關(guān)閉，并且ONOO-顯示了較高的選擇性。更重要的是，該探針已經(jīng)成功用于在RAW264.7和HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性及外源性O(shè)NOO-的檢測。

2016 年，Qian 課題組設(shè)計(jì)合成了一個(gè)基于FRET 的小分子比率熒光探針[10]。該探針由Cy3 和Cy5 兩種菁染料組成，用于檢測ONOO-。以530nm 為激發(fā)波長，探針滿足Cy3 的FRET 機(jī)理，在660nm處顯示Cy5的熒光。當(dāng)加入ONOO-后，在560nm處顯示熒光增加，在660nm 處的熒光減弱，這是由于ONOO-選擇性氧化了Cy5熒光團(tuán)。該探針具有很好的選擇性和高靈敏度，可定量檢測活細(xì)胞中的ONOO-。

2017 年，Ma 課題組設(shè)計(jì)合成了一種以羅丹明為熒光團(tuán)的熒光探針用于檢測ONOO-[11]。該探針是通過對羅丹明結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，通過連接三苯基膦和苯肼來構(gòu)建，探針本身幾乎沒有熒光，當(dāng)加入ONOO-后，在波長550nm 顯示強(qiáng)烈的吸收，同時(shí)，溶液的顏色由無色變?yōu)榉奂t色。以550nm為激發(fā)波長，探針在578nm顯示最大的發(fā)射峰，并且熒光增強(qiáng)近80倍。這是由于苯肼被ONOO-氧化，將羅丹明熒光團(tuán)釋放出來。探針的檢測限為55nM，且選擇性高于其他ROS。更重要的是，該探針不僅可以廣泛應(yīng)用于檢測線粒體的中ONOO-還可以用于與ONOO-相關(guān)疾病的診斷。

2018 年，Tang 課題組設(shè)計(jì)合成了一個(gè)用于檢測線粒體中ONOO-的雙光子近紅外熒光探針[12]。該探針以香豆素衍生物作為熒光團(tuán)與對硝基苯基碳酸酯作為供體連接。在探針溶液中加入ONOO-后，氨基被還原，此時(shí)發(fā)生PET過程，熒光恢復(fù)。從光譜可以看出，探針在570nm處有最大吸收，630nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射，并且具有較高的熒光量子產(chǎn)率。該探針能夠特異性識別、具備高靈敏度和能夠快速響應(yīng)ONOO-的性質(zhì)，并且這些特性表面了探針能夠在心肌細(xì)胞和心臟組織中監(jiān)測線粒體ONOO-的濃度變化并對其進(jìn)行成像。

2018年，Yoon課題組設(shè)計(jì)合成了一個(gè)雙光子熒光探針用于監(jiān)測細(xì)胞和組織中的ONOO-[13]。該探針是以NMDA 受體抑制劑和拮抗劑作為靶向NMDA受體的一部分，硼酸作為反應(yīng)位點(diǎn)監(jiān)測來ONOO-。該探針檢測ONOO-的水溶性較好，在最短時(shí)間內(nèi)能夠快速響應(yīng)，表現(xiàn)出較高的選擇性和靈敏度，成為研究與神經(jīng)系統(tǒng)中ONOO-相關(guān)疾病的有用的成像工具。

2019年，F(xiàn)eng課題組設(shè)計(jì)合成了一種用于檢測生命系統(tǒng)中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO-的可靶向溶酶體的熒光探針[14]。該探針能夠快速響應(yīng)（25μs）、高靈敏度（檢測限為16nM）、高的選擇性和低毒性。更重要的是，該探針可靶向溶酶體，用于對活細(xì)胞中的溶酶體ONOO-成像。

2019 年，Liu 課題組基于苯并吡喃腈熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一種用于特異性檢測ONOO-的熒光探針[15]。探針在470nm 處有最大吸收峰，在630nm 處出現(xiàn)最大發(fā)射峰，同時(shí)具有較大的斯托克斯位移（160nm）。當(dāng)加入ONOO-后，探針中的酰胺鍵斷裂，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）和光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）過程增強(qiáng)，苯并吡喃腈的熒光被恢復(fù)。此外，該探針具有較好的生物相容性和選擇性，因此，可用于檢測內(nèi)源性O(shè)NOO-濃度并在巨噬細(xì)胞中進(jìn)行成像。

2 結(jié)語

近紅外熒光探針由于具有深層的組織穿透能力和對細(xì)胞損傷小的優(yōu)點(diǎn)，尤其是還可以檢測生物體內(nèi)的活性氮和活性氧。為此，已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。這篇文章基于優(yōu)異的熒光團(tuán)設(shè)計(jì)合成了低檢測限、高靈敏度和高選擇性的用于檢測ONOO-的近紅外熒光探針，所設(shè)計(jì)的這些探針已成功應(yīng)用于活細(xì)胞和組織中。另外，近紅外熒光探針成像技術(shù)已逐漸應(yīng)用到了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為今后開發(fā)用于體內(nèi)和體外檢測活性氮和活性氧的熒光探針的有利的工具。