張萌，孫芮，張楠，趙巖松

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，北京 102488

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種由內(nèi)源性基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，由約22個(gè)核苷酸組成。miRNA在動(dòng)植物以及一些病毒中普遍存在。miRNA作為一種導(dǎo)向分子，通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合，抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄后的剪切或翻譯，影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA在細(xì)胞分化、凋亡、增殖及腫瘤形成等不同調(diào)控途徑中發(fā)揮著重要作用[2-4]。近年來(lái)，有關(guān)動(dòng)物體miRNA，尤其是人體miRNA在疾病中的作用成為生命科學(xué)研究的焦點(diǎn)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，外源的植物miRNA在人體內(nèi)可穩(wěn)定存在[5]，也有研究發(fā)現(xiàn)，一些中藥中的miRNA具有一定的藥理活性[6]。近年來(lái)，中藥中所包含的植物miRNA成為新的研究關(guān)注點(diǎn)，本文對(duì)中藥miRNA的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 中藥中存在大量miRNA

自Lee等[7]首次在秀麗隱桿線蟲突變體中發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái)，人們對(duì)這種長(zhǎng)度為19～24 nt的非編碼單鏈RNA進(jìn)行了越來(lái)越多的研究。近年來(lái)成為各個(gè)學(xué)科研究的熱點(diǎn)內(nèi)容，從生命科學(xué)到臨床醫(yī)學(xué)，從植物培育再到食品安全等，miRNA廣泛存在于自然界的動(dòng)植物中。以動(dòng)植物為主要來(lái)源的中藥，其中也存在大量miRNA。近10年來(lái)，關(guān)于中藥miRNA的研究飛速發(fā)展，韋春香等[8]利用高通量測(cè)序及生物信息技術(shù)預(yù)測(cè)到黃芪中所含的miRNA及其靶基因，并驗(yàn)證得到miR2118和miR166可能參與了黃芪的干旱脅迫應(yīng)答；周懷香[9]利用高通量測(cè)序技術(shù)在不同品種天麻的箭麻與禾麻的花、莖、芽與塊莖4個(gè)組織中測(cè)得大量天麻miRNA；向靜等[10]也在甘草水煎劑中發(fā)現(xiàn)了豐富的甘草miRNA；馬月等[11]在地黃中測(cè)得大量miRNA；同時(shí)，人參、丹參、桑葉等中藥的miRNA也在研究中被發(fā)現(xiàn)[12-14]。

隨著研究的不斷推進(jìn)，這些在中藥中發(fā)現(xiàn)的miRNA與中藥藥效是否有關(guān)？miRNA廣泛參與調(diào)控生物體的機(jī)能，那么植物miRNA是否能跨物種進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，調(diào)控人和動(dòng)物的生理機(jī)能？其在人與動(dòng)物的生理病理過(guò)程中又發(fā)揮什么作用呢？這些問(wèn)題都值得深入研究與探討。

2 中藥miRNA可跨界進(jìn)入機(jī)體

植物miRNA通常經(jīng)過(guò)了甲基化修飾，較為穩(wěn)定，不易降解[15]。植物miRNA的結(jié)構(gòu)與人體miRNA的結(jié)構(gòu)非常相似，但不完全相同。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，外源性的植物miRNA可以通過(guò)消化系統(tǒng)或血液系統(tǒng)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，調(diào)節(jié)組織和細(xì)胞的功能[16]。

早在2011年，Zhang等[17]就發(fā)現(xiàn)了植物miRNA可跨界調(diào)控動(dòng)物的基因表達(dá)，他們采用solexa測(cè)序法檢測(cè)了人血漿中的miRNA，發(fā)現(xiàn)約有30～50條外源性的植物miRNA，其中miRNA-156a和miRNA-168a的豐度較高。隨后以玉米和大米等食物中廣泛存在的植物miRNA-168a為研究焦點(diǎn)，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-168a可通過(guò)腸道吸收并穩(wěn)定存在于哺乳動(dòng)物的不同組織與器官中。隨著研究的進(jìn)一步推進(jìn)，研究者發(fā)現(xiàn)，miRNA-168a可以通過(guò)與肝臟中相應(yīng)靶基因mRNA低密度脂蛋白受體蛋白1(low-density lipoprotein receptor adapter protein 1，LDLRAP1)的外顯子相互作用抑制其蛋白的翻譯，從而影響血脂代謝，此研究開辟了植物miRNA跨界調(diào)控動(dòng)物基因表達(dá)研究的新方向。此后，多項(xiàng)研究也證明，外源性的植物miRNA在動(dòng)物血液和組織中可被檢測(cè)到，并具有生物學(xué)功能[18-22]。

同樣的跨界現(xiàn)象在中藥研究中得以發(fā)現(xiàn)，這種跨界現(xiàn)象參與中藥藥效的發(fā)揮。王宇亮等[23]通過(guò)Northern印記雜交法驗(yàn)證丹參、生地黃水煎劑中miRNA的存在，并可經(jīng)通過(guò)口服經(jīng)消化道進(jìn)入人體血液中；Zhou等[24]在2015年發(fā)現(xiàn)，中藥金銀花中的miRNA2911能在水煎液中穩(wěn)定存在，并能夠被人體吸收；隨后Huang等[25]分別從10種中藥水煎劑(半枝蓮、柴胡、穿心蓮、紫花地丁、黃芩、金銀花、連翹、蒲公英、夏枯草、魚腥草)中提取出miRNA，同時(shí)提取了人服用中藥水煎劑后的血細(xì)胞和灌胃中藥水煎劑的小鼠肺組織中的miRNA序列，進(jìn)行大量生物信息學(xué)分析，計(jì)算發(fā)現(xiàn)其中有大量中藥來(lái)源的miRNA。同時(shí)Du等[26]在紅景天熬制的湯汁中提取鑒定了100多種脂質(zhì)，其中大部分脂質(zhì)也存在于中藥蒲公英、穿心蓮和金銀花中，選取其中2種磷脂酰膽堿，使之與中藥miRNA形成脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體可促進(jìn)紅景天等miRNA進(jìn)入人肺和胃腸道細(xì)胞。并且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明了從中藥煎煮液中提取的具有熱穩(wěn)定性的成分療效更好[27]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了中藥來(lái)源的miRNA通過(guò)脂質(zhì)復(fù)合物進(jìn)入人體的可能途徑。諸多中藥miRNA的研究結(jié)果也證明，中藥miRNA也是中藥的活性成分之一，其不同以往對(duì)中藥的研究及其進(jìn)入人體調(diào)節(jié)其他分子作用機(jī)制的研究，中藥miRNA可以直接調(diào)控人體靶基因mRNA的表達(dá)，這為中藥的現(xiàn)代研究提供了新的方向。

3 中藥miRNA對(duì)機(jī)體的作用

3.1 調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝

最早對(duì)中藥miRNA進(jìn)行研究的Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，存在于大米中的miR-168a可以從飲食中獲取進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并且在很多動(dòng)物的血清和組織內(nèi)均可檢測(cè)到。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大米中存在的植物miR-168a可以與小鼠和人的脂蛋白中密度低的受體蛋白(即接頭蛋白)的mRNA 結(jié)合，抑制肝臟中靶基因mRNA的表達(dá)，降低血漿中低密度脂蛋白的清除率，從而影響膽固醇的代謝。

3.2 調(diào)節(jié)免疫功能

邵紅偉等[6]采用通用植物miRNA快速提取試劑盒提取甘草水煎劑中的miRNA，所得miRNA經(jīng)DNaseⅠ處理后進(jìn)行電泳鑒定；分別利用甘草水提物、甘草酸、甘草次酸和甘草miRNA處理體外培養(yǎng)的健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，24 h后，發(fā)現(xiàn)從甘草水煎劑中確實(shí)能夠提取到miRNA，進(jìn)一步印證了miRNA的穩(wěn)定性。對(duì)體外培養(yǎng)PBMC作用結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，經(jīng)甘草miRNA刺激的PBMC發(fā)生了明顯的抱團(tuán)，細(xì)胞數(shù)量顯著增多。隨后，向靜等[10]將從甘草水煎劑中提出的miRNA與合成的甘草miRNA模擬物作用于PBMC，進(jìn)一步證明甘草的miRNA具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，隨后通過(guò)RT-PCR對(duì)其模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)基因及一部分轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)分子和細(xì)胞因子的基因表達(dá)變化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草的miRNA對(duì)人免疫細(xì)胞的基因表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用，能夠明顯抑制T細(xì)胞分化相關(guān)基因以及炎癥和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

3.3 抗病毒作用

2015年，Zhou等[24]在金銀花的miRNA中發(fā)現(xiàn)了具有直接針對(duì)廣譜的甲型流感病毒的miRNA2911。miRNA2911在金銀花煎劑中高度穩(wěn)定，連續(xù)飲用或灌胃給予金銀花煎劑導(dǎo)致小鼠外周血和肺中miRNA2911水平顯著升高。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示，miRNA2911可以靶向各種甲型流感病毒，包括甲型H1N1流感病毒、甲型H5N1流感病毒和甲型H7N9流感病毒。

3.4 抗炎癥作用

周懷香[9]發(fā)現(xiàn)，天麻中Gas-miR01和Gas-miR02能夠通過(guò)胃腸道進(jìn)入小鼠體內(nèi)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Gas-miR01和Gas-miR02可以靶向核因子激活的B細(xì)胞κ-輕鏈增強(qiáng)(NF-κB)信號(hào)通路上的3個(gè)關(guān)鍵炎癥相關(guān)基因A20、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)，表明天麻特有的2個(gè)miRNA分子可能是重要的植物miRNA，可以跨物種調(diào)控NF-κB信號(hào)通路上的相關(guān)基因，從而參與動(dòng)物的免疫和炎癥反應(yīng)等重要生理過(guò)程。

Li等[27]在蒲公英的水煎劑中提取了一種由脂質(zhì)、miRNA等組成的外泌體樣納米顆粒，命名為湯劑體。蒲公英湯劑體與蒲公英湯劑都降低了人非小細(xì)胞肺癌(A549)細(xì)胞中聚肌胞苷酸誘導(dǎo)的促炎因子生成。同時(shí)，由脂質(zhì)和蒲公英miRNA等組成的湯劑體抗炎作用比蒲公英湯劑更強(qiáng)。

3.5 抗纖維化作用

Du等[26]從紅景天的根部提取miRNA進(jìn)行研究。首先，對(duì)紅景天miRNA灌胃小鼠的肺組織進(jìn)行高通量測(cè)序，人工合成在小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的豐度最高的8條紅景天來(lái)源miRNA序列，并在細(xì)胞模型上進(jìn)行抗肺纖維化功能篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HJT-s RNA-m7是其中抗纖維化功能最顯著的miRNA。后續(xù)研究表明，HJT-s RNA-m7可以直接靶向肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、纖連蛋白(fibronectin)及Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)，并在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中被證明具有較好的療效。

3.6 調(diào)節(jié)腸道菌群

徐鵬程[28]對(duì)不同組小鼠在灌胃甘草水煎劑、灌胃甘草miRNA156和尾端注射甘草miRNA156后，取小鼠新鮮糞便提取基因組DNA進(jìn)行測(cè)序分析，其中甘草miRNA減少了擬桿菌門，增多了變形菌門，證明甘草miRNA156對(duì)小鼠腸道菌群和腸道組織免疫系統(tǒng)均發(fā)揮著顯著調(diào)節(jié)作用。

3.7 其他作用

Zhang等[29]在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，中藥冬蟲夏草中的miRNA及其靶基因的表達(dá)作用與冬蟲夏草的功效完全相同。該研究組采用高通量測(cè)序和生物信息學(xué)方法對(duì)冬蟲夏草中保守的miRNA和新型miRNA進(jìn)行鑒定。共鑒定出40個(gè)保守的miRNA，預(yù)測(cè)出31個(gè)新的miRNA和23個(gè)前體miRNA候選基因編碼。此外，還預(yù)測(cè)了其在人體內(nèi)的潛在靶基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行分析。生物信息學(xué)分析表明，保守型和新型miRNA的靶基因參與了發(fā)育、代謝和免疫的過(guò)程，起到抗腫瘤、降血壓、刺激免疫系統(tǒng)的作用，為冬蟲夏草的功效研究奠定了基礎(chǔ)。

4 中藥miRNA的研究意義

4.1 有利于進(jìn)一步闡明中藥作用機(jī)制

中藥miRNA作為新發(fā)現(xiàn)的中藥活性物質(zhì)之一，不同于以往研究中中藥有效成分的作用機(jī)制。中藥來(lái)源的miRNA可以直接調(diào)節(jié)動(dòng)物靶基因的表達(dá)，因此，對(duì)中藥miRNA跨界調(diào)控作用的研究將極大推動(dòng)中藥作用機(jī)制的研究，最終形成中藥miRNA-mRNA-蛋白質(zhì)-疾病治療的路線圖。

4.2 為發(fā)展現(xiàn)代中醫(yī)藥理論提供切入點(diǎn)

隨著現(xiàn)代科學(xué)研究方法不斷改進(jìn)，研究領(lǐng)域不斷擴(kuò)展，中醫(yī)藥理論也不斷豐富其內(nèi)涵。miRNA的發(fā)現(xiàn)更為現(xiàn)代中醫(yī)藥理論的發(fā)展提供了新的方向。中醫(yī)歸經(jīng)理論是中醫(yī)理論的重要組成部分，其是指中藥作用的選擇性和中藥作用的方向性，即中藥對(duì)人體不同部位的選擇性作用。也就是說(shuō)，某一種藥歸某一經(jīng)脈，意味著中藥有選擇地對(duì)其所屬的某一臟腑或經(jīng)脈的功能影響較大，但對(duì)其他臟腑或經(jīng)脈的功能影響很小或沒有影響[30]。那么中藥成分是如何在分子層面對(duì)疾病發(fā)揮作用的？不同中藥進(jìn)入人體后的靶點(diǎn)分布是怎樣的？這種分布與中藥的歸經(jīng)理論及對(duì)傳統(tǒng)中藥作用的認(rèn)識(shí)有怎樣的關(guān)聯(lián)？這些問(wèn)題都值得深入探索。中藥miRNA為中藥理論研究提供一種新穎的方法，也為揭開中藥藥理作用的微觀本質(zhì)，探索中藥歸經(jīng)理論實(shí)質(zhì)提供了新的研究思路和方法。

4.3 為中藥核酸制劑的開發(fā)提供依據(jù)

miRNA技術(shù)不僅可以研究發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制，還可以作為核酸制劑研究新的藥物。越來(lái)越多的研究表明，miRNA的模擬物或拮抗劑可以通過(guò)上調(diào)或下調(diào)機(jī)體中一些miRNA表達(dá)從而調(diào)控靶基因，以此來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，干預(yù)疾病發(fā)展[31-32]。隨著RNA技術(shù)的進(jìn)步及世界范圍內(nèi)第一個(gè)RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 藥物的誕生，加快我國(guó)中藥miRNA開發(fā)創(chuàng)新的研究勢(shì)在必行[33]。中藥屬天然藥物，不良反應(yīng)發(fā)生率低，具有較好的人體相容性，中藥miRNA作為口服基因靶向治療劑具有巨大潛力。同時(shí)，miRNA技術(shù)也是中藥基因組學(xué)的重要組成部分，為深入挖掘中藥的潛在功效提供有效的研究思路與技術(shù)手段。

5 問(wèn)題與展望

中藥是中華民族的瑰寶之一，但目前對(duì)于中藥的研究，主要集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究上，例如黃酮、皂苷等。對(duì)初級(jí)代謝產(chǎn)物的活性研究，例如核酸、蛋白質(zhì)等尚未引起廣大研究者重視。隨著miRNA作為中藥活性物質(zhì)可跨界調(diào)控機(jī)體功能被陸續(xù)證實(shí)，中藥miRNA技術(shù)為中藥活性成分及其對(duì)機(jī)體作用機(jī)制的研究提供了新的研究思路與方法。相信隨著中藥miRNA探究的繼續(xù)深入，更廣泛的中藥藥理作用會(huì)進(jìn)一步被揭示出來(lái)，未來(lái)中醫(yī)藥將更受世界矚目。