楊 帆，李石柱，秦志強(qiáng)

盡管寄生蟲(chóng)病的防治已取得了顯著成效，但欠發(fā)達(dá)國(guó)家仍有數(shù)以億計(jì)的人正遭受寄生蟲(chóng)病的危害。在缺乏有效疫苗的情況下，寄生蟲(chóng)病的防治主要依賴于檢測(cè)和治療以及媒介的控制[1]。目前，診斷寄生蟲(chóng)感染的金標(biāo)準(zhǔn)主要基于顯微鏡檢查的病原學(xué)方法，但病原檢測(cè)敏感性較低、容易漏檢、費(fèi)事費(fèi)力且對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，檢測(cè)結(jié)果易受制片質(zhì)量和主觀影響。因此，多年來(lái)人們一直探尋敏感性較高的免疫學(xué)和核酸檢測(cè)方法來(lái)應(yīng)用于寄生蟲(chóng)感染的臨床診治以及流行病學(xué)篩檢。此外，傳統(tǒng)的抗寄生蟲(chóng)藥物種類(lèi)較為單一，部分地區(qū)的寄生蟲(chóng)感染者也逐漸出現(xiàn)了抗藥性，因此亟需尋找新的藥物來(lái)控制寄生蟲(chóng)感染。核酸適配體作為一種穩(wěn)定、有效、經(jīng)濟(jì)的生物識(shí)別元件，有望發(fā)展用于寄生蟲(chóng)感染的檢測(cè)試劑和治療藥物。本文綜述了靶向瘧原蟲(chóng)(Plasmodiu m)、錐蟲(chóng)(Trypanosome)、利什曼原蟲(chóng)(Leishmania)等寄生蟲(chóng)的核酸適配體應(yīng)用研究，旨在為寄生蟲(chóng)感染的檢測(cè)和防治提供借鑒。

1 核酸適配體

核酸適配體是一類(lèi)長(zhǎng)度為20～100個(gè)核苷酸的單鏈DNA或RNA分子，可通過(guò)其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)與靶分子特異性結(jié)合，平衡解離常數(shù)(equilibriu m dissociation constants，Kd)介于納摩爾和皮摩爾范圍，具有與抗體相媲美的高親和力和特異性，被稱為“化學(xué)抗體”[2]。此外，核酸適配體可于室溫下生產(chǎn)和儲(chǔ)存，易于實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，可替代抗體成為診斷和治療的特定標(biāo)記物[3]。目前，核酸適配體已被應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)、診斷試劑、藥物遞送劑、生物成像劑等生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境和食品等領(lǐng)域[4]。

核酸適配體一詞最早由Ellington和Szostak[5]于1990年提出，用于描述特異性結(jié)合多種有機(jī)染料的RNA分子。同年，Tuerk和Gold[6]開(kāi)發(fā)了指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evol ution of ligands by exponential enrich ment，SELEX)技術(shù)，用于體外篩選特異性結(jié)合噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA。SELEX是對(duì)包含4n個(gè)獨(dú)立核酸序列的隨機(jī)文庫(kù)進(jìn)行迭代選擇，以獲取高親和力和特異性結(jié)合靶標(biāo)(候選核酸)的過(guò)程。SELEX主要包含核酸文庫(kù)與靶標(biāo)分子孵育結(jié)合、富集的復(fù)合物分離與洗脫和結(jié)合序列的PCR擴(kuò)增等步驟，通過(guò)不斷提高篩選條件的嚴(yán)格性，直至獲得高親和力結(jié)合序列。SELEX各輪次結(jié)束后，將富集的核酸序列克隆到合適載體中，進(jìn)行測(cè)序和鑒定[7]。迄今為止，基于SELEX方法，針對(duì)小分子、蛋白、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等多種靶標(biāo)，篩選獲得了數(shù)千個(gè)具有高親和力和特異性的核酸適配體[8-9]。理論上，可以針對(duì)無(wú)限范圍的靶標(biāo)選擇核酸適配體，包括不能被抗體識(shí)別的有毒和非免疫原性分子。與抗體(5～15 k Da、直徑約15 n m)相比，核酸適配體具有較低的相對(duì)分子質(zhì)量(6～30 k Da)和較小尺寸(直徑約2 n m)，可結(jié)合較小的靶標(biāo)或某些抗體無(wú)法抵達(dá)的隱藏結(jié)合域。此外，核酸適配體不存在免疫原性的限制[10]。核酸適配體需要在血管系統(tǒng)中存在足夠長(zhǎng)的時(shí)間，順利到達(dá)靶標(biāo)所在位置，通過(guò)與靶標(biāo)的相互作用，發(fā)揮疾病檢測(cè)、治療等作用[11-12]。截至目前，通過(guò)篩選獲得的核酸適配體中，哌加他尼(Macugen)已獲得了美國(guó)食品與藥品管理局的批準(zhǔn)，可應(yīng)用于臨床，作為聚乙二醇化修飾的RNA適配體，Macugen可用于治療黃斑變性和糖尿病黃斑水腫[13]。

2 靶向寄生蟲(chóng)的核酸適配體

目前，針對(duì)寄生蟲(chóng)感染的核酸適配體開(kāi)發(fā)策略主要有:①靶向宿主細(xì)胞基質(zhì)受體，阻礙寄生蟲(chóng)與宿主間的相互作用;② 抑制寄生蟲(chóng)細(xì)胞蛋白功能;③攻擊寄生蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)血紅素或干擾細(xì)胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)運(yùn);④ 靶向寄生蟲(chóng)細(xì)胞蛋白保守結(jié)構(gòu)域，用于寄生蟲(chóng)感染診斷和鑒定，或充當(dāng)抗寄生蟲(chóng)藥物的傳送載體。

2.1 靶向瘧原蟲(chóng)的核酸適配體 瘧疾是一種重要的熱帶病。2017年全球約有2.19億瘧疾病例，死亡人數(shù)約43.5萬(wàn)[14]。在已知感染人類(lèi)的5個(gè)瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)種中，惡性瘧原蟲(chóng)(P.f alciparum)和間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)最為常見(jiàn)。惡性瘧原蟲(chóng)紅細(xì)胞膜蛋白1(P.f alciparum erythrocyte me mbrane protein 1，Pf EMP1)在寄生蟲(chóng)致病性中發(fā)揮重要作用，可使被感染紅細(xì)胞黏附在血管內(nèi)皮層，未感染紅細(xì)胞形成“玫瑰花結(jié)”。“玫瑰花結(jié)”為毒力相關(guān)表型，由Pf EMP1的N末端達(dá)菲結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域(N-ter minal duff y-binding-like domain 1α，DBL1α)介導(dǎo)形成。因此，DBL1α有望成為治療瘧疾新藥和疫苗的候選靶標(biāo)，Barfod等[15]通過(guò)8輪SELEX從體外篩選獲了3個(gè)與Pf EMP1中半保守表位DBL1α結(jié)合的RNA適配體b02、d12和e05，具有定位受感染紅細(xì)胞的潛力，387 n mol/L的RNA適配體對(duì)“玫瑰花結(jié)”的破壞能力為100%。另外，有研究表明，阻斷惡性瘧原蟲(chóng)的血紅素降解，可以有效抑制其生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。Niles等[18]以能與血紅素卟啉結(jié)合的DNA適配體PS2 R和PS2 M Mod為研究對(duì)象，經(jīng)3′-反向脫氧胸苷修飾后，導(dǎo)入至紅細(xì)胞內(nèi)，證明了血紅素結(jié)合DNA適配體可抑制惡性瘧原蟲(chóng)血紅素的解毒途徑。

Lee等[19]報(bào)告了針對(duì)間日瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶(P.vivax lactate dehydrogenase，Pv LDH)和惡性瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶(P.f alciparum lactate dehydrogenase，Pf LDH)的 DNA 適配體——p L1，Kd依次為(16.8±0.6)n mol/L、(38.7±1.3)n mol/L。在此基礎(chǔ)上，該課題組開(kāi)發(fā)了一種基于p L1和陽(yáng)離子聚合物(聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚烯丙胺鹽酸鹽)介導(dǎo)的金納米顆粒聚集的瘧疾診斷生物傳感器，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)瘧疾患者陽(yáng)性血液樣本中的瘧原蟲(chóng)乳酸脫氫酶?；诰鄱┍谆然@和p L1的傳感器檢測(cè)限分別為80個(gè)間日瘧原蟲(chóng)/μL、92個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)/μL，基于聚烯丙胺鹽酸鹽和p L1的傳感器檢測(cè)限分別為74個(gè)間日瘧原蟲(chóng)/μL、97個(gè)惡性瘧原蟲(chóng)/μL[20]。Cheung等[21]描述了以高親和力和特異性結(jié)合Pf LDH的DNA適配體2008s的選擇和表征。2008s經(jīng)20輪SELEX篩選獲得，通過(guò)獨(dú)特的扭曲發(fā)夾結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)與靶標(biāo)的特異結(jié)合，Kd為42 n mol/L。隨后，基于2008s開(kāi)發(fā)了一種敏感的核酸適配體拴系酶捕獲(aptamer-tethered enzy me capt ure，APTEC)分析方法，該方法對(duì)惡性瘧血樣具有特異性，可以區(qū)分間日瘧血樣[22]。此外，報(bào)道顯示PLDH表面的抗原決定簇可作為識(shí)別瘧原蟲(chóng)屬的生物標(biāo)志物[23]。基于此，F(xiàn)rith等[24]以Pf LDH的表位寡肽為靶標(biāo)，使用SELEX策略篩選獲得的DNA適配體LDHp 11，也可用于區(qū)分惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)感染。

Singh等[25-26]基于以高親和力特異性結(jié)合惡性瘧原蟲(chóng)谷氨酸脫氫酶(P.f alciparum gl uta mate dehydrogenase，Pf GDH)的硫醇化DNA適配體NG3(Kd＝79 n mol/L)，開(kāi)發(fā)了可檢測(cè)血清樣品Pf GDH的電容式和場(chǎng)效應(yīng)晶體管傳感器，檢出限分別為0.77、48.6 p mol/L。

最近，Joseph等[27]利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)、核糖體譜分析和結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)高遷移率族Box 1蛋白(high mobility group box 1 protein，H MGB1)高表達(dá)于惡性瘧原蟲(chóng)的所有血液階段。他們以惡性瘧原蟲(chóng)的H MGB1為靶標(biāo)，進(jìn)行了14輪SELEX，從9個(gè)潛在的DNA適配體中確定了Pf R6，能以高親和力[Kd＝(65±15)n mol/L]與靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合。

2.2 靶向錐蟲(chóng)的核酸適配體 布氏錐蟲(chóng)(T.br ucei)引起的人類(lèi)非洲錐蟲(chóng)病(昏睡病)，是一種流行于撒哈拉以南非洲的人獸共患寄生蟲(chóng)病[28]。布氏錐蟲(chóng)系一種細(xì)胞外寄生蟲(chóng)，可在宿主的外周血、毛細(xì)血管和組織液中繁殖。血液階段的布氏錐蟲(chóng)表面約有1億個(gè)變異表面糖蛋白(variant surface glycoproteins，VSGs)在細(xì)胞膜上作快速橫向運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞膜上同時(shí)也存在不變表面糖蛋白(invariant surface glycoproteins，ISGs)、受體復(fù)合物、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子等其他表面分子。這些表面分子一部分嵌入VSGs層內(nèi)，分布在錐蟲(chóng)細(xì)胞體表面(包括鞭毛)，另一部分分布于鞭毛袋中，通過(guò)鞭毛基部周?chē)|(zhì)膜的內(nèi)陷發(fā)揮胞吞和和胞吐作用。錐蟲(chóng)可通過(guò)DNA同源重組的方式改變VSGs的抗原特性，逃脫宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。錐蟲(chóng)基因組約編碼1 000個(gè)不同的vsg基因，但特定時(shí)間段內(nèi)僅表達(dá)1個(gè)VSG，1種VSG變體轉(zhuǎn)換為另1種VSG變體的頻率約10-2～10-7/每代細(xì)胞，屬于隨機(jī)事件，VSGs的抗原可變特性使宿主無(wú)法有效清除感染，同時(shí)加大了抗錐蟲(chóng)疫苗的研發(fā)難度[29]。

Ho mann等[30]以布氏錐蟲(chóng)細(xì)胞系 MITat 1.2(表面穩(wěn)定表達(dá)VSG221)和MITat 1.4(表面穩(wěn)定表達(dá)VSG117)為靶標(biāo)，進(jìn)行了12輪SELEX篩選。MITat 1.2、MITat 1.4可作為血液階段布氏錐蟲(chóng)的代表，在60 min的孵育期內(nèi)完成與RNA的結(jié)合。構(gòu)建的RNA適配體庫(kù)無(wú)法區(qū)分MITat 1.2和MITat 1.4(提示RNA適配體可能與VSG的恒定結(jié)構(gòu)域或其他保守表面分子相互作用，不依賴于錐蟲(chóng)表面表達(dá)的特定VSG)，也無(wú)法識(shí)別昆蟲(chóng)階段的布氏錐蟲(chóng)(結(jié)合效率≤0.1%)。核酸適配體庫(kù)中結(jié)合能力最強(qiáng)的RNA適配體為2-16，與靶標(biāo)的親和力為(60±17)n mol/L，結(jié)合位點(diǎn)是鞭毛袋中42 k Da蛋白，具有將宿主免疫系統(tǒng)重定向至錐蟲(chóng)表面的潛力。適配體2-16與鞭毛袋中42 k Da蛋白結(jié)合后，會(huì)降解為含50個(gè)核苷酸的核心序列，通過(guò)特異性受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的溶酶體[31]。為使2-16轉(zhuǎn)化為熱穩(wěn)定、血清穩(wěn)定的RNA適配體，Adler等[32]通過(guò)化學(xué)修飾制備了2′-脫氧-2′-氟、2′-脫氧2′-氨基-尿苷、2′-脫氧2′-氨基-胞苷取代的 RNA。結(jié)果顯示，2-16被2′-脫氧2′-氨基-尿苷、2′-脫氧2′-氨基-胞苷取代后，活性喪失，僅2′-脫氧-2′-氟取代的2-16保留了與活錐蟲(chóng)鞭毛袋結(jié)合的能力(氟修飾前后的Kd分別為10、45 nmol/L)，具有熱穩(wěn)定性(Tm＝75℃)，與10 k Da的聚乙二醇結(jié)合后，在血清中的半衰期可達(dá)3.4 d，且保留了較高的生物學(xué)活性。Ho mann等[33]還報(bào)道了1種具有穩(wěn)定G四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的RNA適配體——N2，經(jīng)13輪SELEX選擇獲得，與MITat 1.2的親和力為(70±15)n mol/L。用嘧啶堿基的2′-氨基取代2′-羥基后，N2在人血清中的半衰期可超過(guò)30 h。該N2的結(jié)合僅限于布氏錐蟲(chóng)細(xì)胞體和鞭毛之間的鞭毛附著區(qū)，可能具有干擾鞭毛附著的潛力。此外，Lor ger等[34]以MITat 1.2和MITat 1.4的VSG保守結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)，經(jīng)9輪SELEX篩選獲得的RNA適配體——cl.57，與靶標(biāo)的親和力分別為(0.3±0.05)、(0.4±0.02)n mol/L，結(jié)合位點(diǎn)可能為VSG保守結(jié)構(gòu)域的N末端。實(shí)驗(yàn)顯示，未修飾的原始cl.57在血清中的半衰期為10 s，經(jīng)2′-氟修飾后，其半衰期可達(dá)15 h。Zelada-Guillén等[35]基于cl.57開(kāi)發(fā)了電位碳納米管核酸適配體傳感器，可對(duì)血液中低至10 p mol/L濃度的VSG作出實(shí)時(shí)響應(yīng)，分析時(shí)間為2～10min。

克氏錐蟲(chóng)(T.cr uzi)引起的美洲錐蟲(chóng)病(恰加斯病)是西半球最重要的寄生蟲(chóng)病，心臟受累是最常見(jiàn)的特征，30%～40%的感染者會(huì)出現(xiàn)心肌病[36]。已知宿主細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素、纖連蛋白、層粘連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白在介導(dǎo)克氏錐蟲(chóng)黏附和入侵宿主過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在此基礎(chǔ)上，Ulrich等[37]以硫酸乙酰肝素、纖連蛋白、層粘連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白為靶標(biāo)，通過(guò)8輪SELEX篩選，獲得了4個(gè)RNA適配體——HS6、F4、L28和T6，對(duì)靶標(biāo)的親和力依次為40、124、209和400 n mol/L。實(shí)驗(yàn)顯示，1μmol/L RNA適配體即可抑制克氏錐蟲(chóng)對(duì)LLC-MK2猴腎細(xì)胞的體外入侵，抑制率約50%～70%。

Nagar katti等[38]利用全細(xì)胞SELEX策略開(kāi)發(fā)了與克氏錐蟲(chóng)鞭毛體結(jié)合的血清穩(wěn)定RNA適配體——Apt16、Apt 25、Apt 68和Apt 79，Kd分別為(22.96±1.6)、(22.12±3.9)、(7.62±1.63)和(29.92±5.62)n mol/L，可特異性捕獲血流階段的克氏錐蟲(chóng)。實(shí)驗(yàn)顯示，包被Apt 68的磁珠可用于檢測(cè)低至5個(gè)克氏錐蟲(chóng)/15 mL濃度的全血樣品。此外，克氏錐蟲(chóng)作為一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，其分泌的分泌抗原(T.cr uzi excreted secreted antigens，TESA)也可作為檢測(cè)其感染的特異性標(biāo)志物，Nagar katti等[39]經(jīng)過(guò)10輪SELEX處理，篩選到可特異性識(shí)別TESA的RNA適配體Apt-L44，成功檢測(cè)了急性期(7～28 d)和慢性期(55～230 d)感染小鼠血漿中的TESA。

2.3 靶向利什曼原蟲(chóng)的核酸適配體 利什曼原蟲(chóng)引起的利什曼病是一種廣泛分布于亞洲、非洲、歐洲和中南美洲的寄生蟲(chóng)病，每年全世界約有70萬(wàn)～100萬(wàn)的報(bào)告病例[40-41]。利什曼原蟲(chóng)組蛋白與高等真核生物核心組蛋白的序列相似性主要位于球狀區(qū)域，二者N末端和C末端結(jié)構(gòu)域中的高度差異序列具備開(kāi)發(fā)為疾病診斷、治療靶標(biāo)的潛力。已有研究顯示，H2 A蛋白可作為犬內(nèi)臟利什曼病血清學(xué)診斷工具[42-43]。Ramos等[44]以嬰兒利什曼原蟲(chóng)組蛋白H2 A(L.infantu m histone H2 A，Li H2 A)為靶標(biāo)，經(jīng)3輪SELEX篩選，成功分離了一個(gè)名為SEL H2 A的DNA序列庫(kù)，Kd為(2.065±0.652)n mol/L。SEL H2 A能與Li H2A特異性結(jié)合，通過(guò)酶聯(lián)寡核苷酸檢測(cè)和鑒定H2 A抗原的最低檢測(cè)限為50 ng。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，SEL H2 A可從低背景的寄生蟲(chóng)蛋白總裂解物中鑒別天然H2 A。該實(shí)驗(yàn)室后續(xù)從SEL H2A的DNA序列庫(kù)中進(jìn)一步分離出與Li H2 A親和力最高的2個(gè)DNA適配體——Apt Li H2 A#1和Apt Li H2 A#2，Kd分別為(0.96±0.17)、(1.16±0.28)n mol/L。2個(gè)DNA適配體可從10 000個(gè)嬰兒利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體裂解物中檢出Li H2A[45]。此外，該課題組以嬰兒利什曼原蟲(chóng)組蛋白H3(Li H3)為靶標(biāo)，篩選獲得了可與靶標(biāo)特異性結(jié)合的DNA適配體庫(kù)SELH3，Kd為(0.94±0.19)n mol/L[46]。

動(dòng)基體膜蛋白11(kinetoplastid membrane protein-11，K MP-11)是動(dòng)基體寄生蟲(chóng)細(xì)胞膜的主要成分，為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，可能與細(xì)胞遷移或鞭毛結(jié)構(gòu)有關(guān)[47]。嬰兒利什曼原蟲(chóng)的 K MP-11(Li KMP-11)為階段特異性表達(dá)，不同生命周期階段的Li K MP-11豐度和位置不同，鞭毛體階段的Li KMP-11表達(dá)水平顯著下調(diào)[48]。研究顯示，利什曼原蟲(chóng)的K MP-11可作為自然感染過(guò)程中有效的抗體刺激劑和免疫動(dòng)物T淋巴細(xì)胞增殖刺激劑[49-50]。Moreno等[51]在SELEX程序中使用膠體金來(lái)選擇針對(duì)Li KMP-11的高親和力DNA適配體，膠體金與Li K MP-11結(jié)合后可賦予其更高的質(zhì)量，有利于進(jìn)一步離心純化。10輪SELEX選擇后獲得了DNA適配體庫(kù)SELK10，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，SELK10能從嬰兒利什曼原蟲(chóng)裂解物中鑒定出天然Li K MP-11，可作為抗Li K MP-11的多克隆化學(xué)抗體。基于此，以SELK10為識(shí)別元件，開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)Li K MP-11的電化學(xué)核酸適配體傳感器，可 檢 測(cè) 到 25 μg/μL(2.27 μmol/L)的Li K MP-11[52]。

真核生物的poly A結(jié)合蛋白(poly A binding protein，PABP)與mRNA的3′末端的poly A結(jié)合，參與翻譯起始、終止和mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[53-54]。Guerra-Pérez等[55]以嬰兒利什曼原蟲(chóng)poly A結(jié)合蛋白(Li PABP)為靶標(biāo)，通過(guò)4輪SELEX，構(gòu)建了DNA適配體庫(kù)SELLi PABP，Kd為(3.87±0.67)n mol/L。隨后，從SELLi PABP群體中分離了3個(gè)高親和力DNA適配體——Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11，可從2 500個(gè)嬰兒利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體裂解物中檢測(cè)到Li PABP。Ap PABP#3、Ap PABP#7和Ap PABP#11的Kd分別為(5.4±1.1)、(6.0±2.6)和(10.8±2.7)n mol/L，均可在低納摩爾濃度范圍內(nèi)特異性識(shí)別Li PABP，50 n mol/L DNA適配體可檢測(cè)6.25 ng Li PABP。研究顯示，3個(gè)DNA適配體均可實(shí)現(xiàn)對(duì)利什曼原蟲(chóng)細(xì)胞裂解物中Li PABP的純化，與Ap-PABP#11相比(低于50%)，Ap PABP#3、Ap PA-BP#7純化效率達(dá)75%以上。然而，僅Ap PABP#11能破壞Li PABP與poly A的結(jié)合，可作為影響利什曼原蟲(chóng)翻譯的潛在抑制劑，適用于前鞭毛體和鞭毛體2個(gè)階段的Li PABP。

Bhattacharyya等[56]以熱帶利什曼原蟲(chóng)(L.tropica)線粒體為靶標(biāo)篩選獲得的核酸適配體序列含有t RNA的反密碼子臂、D臂，VT區(qū)和受體莖等序列基序，可影響線粒體介導(dǎo)的t RNA運(yùn)輸，以此干擾熱帶利什曼原蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.4 靶向其它寄生蟲(chóng)的核酸適配體 Long等[57]利用蟲(chóng)卵SELEX技術(shù)篩選獲得了特異性結(jié)合日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma j aponicu m)蟲(chóng)卵的2個(gè)DNA適配體——LC6和LC15，結(jié)合率分別為83.6%和70.2%，但僅LC15可以識(shí)別和捕獲肝組織中的日本血吸蟲(chóng)卵，檢出率為80.5%。

切割因子的25 k D亞基(cleavage f actor I m 25，CFIm25)是一種能與poly A聚合酶相互作用的RNA結(jié)合蛋白，對(duì)寄生蟲(chóng)毒力和存活至關(guān)重要，CFIm25的沉默可降低寄生蟲(chóng)的活動(dòng)性并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。Ospina-Villa等[58]通過(guò)7輪SELEX開(kāi)發(fā)了針對(duì)溶組織阿米巴(Entamoeba histol ytica)的CFI m25的RNA適配體——C4和C5，可通過(guò)改變募集、切割和聚腺苷酸化反應(yīng)，影響溶組織阿米巴滋養(yǎng)體的增殖、存活和毒力特性。

3 展 望

核酸適配體是利用核苷酸之間嚴(yán)格的識(shí)別能力和親和力而設(shè)計(jì)的人工合成寡核苷酸，靶標(biāo)范圍廣泛，已被應(yīng)用于識(shí)別各種靶標(biāo)分子。核酸適配體既具有檢測(cè)的潛在價(jià)值，也可作為抗寄生蟲(chóng)藥物的遞送載體，在寄生蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。經(jīng)典的SELEX方法已被證明是一種功能強(qiáng)大且有效的核酸適配體選擇程序，但仍需進(jìn)一步優(yōu)化以提高篩選效率。引入陰性SELEX有助于消除與環(huán)境成分結(jié)合的非特異性序列，尤其是與固相基質(zhì)結(jié)合的非特異性序列。基于固相基質(zhì)磁珠的SELEX策略，可在磁場(chǎng)作用下快速分離與靶標(biāo)結(jié)合的核酸適配體。利用高通量測(cè)序技術(shù)使每輪SELEX篩選可見(jiàn)，通過(guò)定量評(píng)估整個(gè)篩選周期中文庫(kù)組成的動(dòng)態(tài)變化，可更高效、省時(shí)地獲得高親和力核酸適配體[59]。將SELEX方法與毛細(xì)管電泳、微流控等技術(shù)聯(lián)合，可縮短篩選輪次和時(shí)間，降低篩選成本，提高核酸適配體的檢測(cè)靈敏度和對(duì)不同靶標(biāo)類(lèi)型的適用性[60]。需要注意的是，以純化蛋白為靶標(biāo)的SELEX策略不適用于不溶性蛋白、未知蛋白和僅以天然構(gòu)象發(fā)揮作用的蛋白。對(duì)于這些局限，基于全細(xì)胞的SELEX策略可作為一種合理的替代方案。以整個(gè)細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行篩選，可保持靶標(biāo)的天然構(gòu)象，不需要預(yù)先進(jìn)行靶標(biāo)序列分析和蛋白純化。但細(xì)胞SELEX技術(shù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，篩選過(guò)程中不可避免地會(huì)遇到細(xì)胞死亡，死細(xì)胞會(huì)與核酸適配體發(fā)生非特異性結(jié)合引起假陽(yáng)性，營(yíng)養(yǎng)不良和培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等不良培養(yǎng)條件可能使細(xì)胞表面生物學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而為下一輪選擇保留了無(wú)用的核酸序列[61]。綜上，改進(jìn)核酸適配體的篩選方法，將有望為進(jìn)一步鑒定出特異靶向寄生蟲(chóng)的分子和發(fā)展有效診斷試劑與藥物提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。