王敬亭，周長(zhǎng)慧，常 艷

（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203；2.上海中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203）

單細(xì)胞凝膠電泳，即彗星試驗(yàn)（comet assay），是一種在單細(xì)胞水平上定量評(píng)估DNA損傷和修復(fù)的方法［1］。彗星試驗(yàn)從產(chǎn)生到調(diào)整和應(yīng)用經(jīng)歷了30多年的歷程［2］。當(dāng)前，彗星試驗(yàn)已成為一種用途廣泛的檢測(cè)方法，可檢測(cè)到由衰老、疾病和暴露導(dǎo)致的各種生物體、組織和細(xì)胞的DNA損傷，廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、環(huán)境遺傳學(xué)和生命科學(xué)等科學(xué)研究。

近年來(lái)，彗星試驗(yàn)在遺傳毒性檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。2014年，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）批準(zhǔn)了用于化學(xué)物質(zhì)遺傳毒性試驗(yàn)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)堿性彗星試驗(yàn)的指導(dǎo)原則（指南TG489）。目前，人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Phar?maceuticals for Human Use，ICH）有關(guān)遺傳毒性指導(dǎo)原則S2（R1）已將肝彗星試驗(yàn)列為第2個(gè)體內(nèi)試驗(yàn)。體外彗星試驗(yàn)雖還未被監(jiān)管機(jī)構(gòu)正式認(rèn)可，但歐盟《化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制》法規(guī)（Regis?tration，Evaluation，Authorization and Restriction of Chemicals，REACH）技術(shù)指導(dǎo)文件中建議將體外彗星試驗(yàn)作為可使用的測(cè)試方法［1］。體外彗星試驗(yàn)還廣泛用于篩選新型化妝品（僅允許進(jìn)行體外試驗(yàn)）和候選化合物中。

過(guò)去10年中，需要進(jìn)行彗星試驗(yàn)評(píng)價(jià)遺傳毒性的化合物日益增多。然而，目前彗星試驗(yàn)還存在檢測(cè)有效信息較少、體外彗星試驗(yàn)假陽(yáng)性率高和試驗(yàn)步驟繁瑣等不足。為解決當(dāng)前存在的問(wèn)題以滿足遺傳毒性檢測(cè)的需要，彗星試驗(yàn)作為一種遺傳毒性測(cè)試工具正在進(jìn)一步升級(jí)，許多新型技術(shù)被嘗試在彗星試驗(yàn)中應(yīng)用，如將彗星試驗(yàn)各個(gè)步驟優(yōu)化并集成到一組彗星芯片平臺(tái)中，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)單和快速的彗星試驗(yàn)方法；使用更接近人體細(xì)胞的三維（three dimensional，3D）組織模型降低體外檢測(cè)的假陽(yáng)性率；開(kāi)發(fā)新型的人源化動(dòng)物模型減少不同物種帶來(lái)試驗(yàn)結(jié)果的差異，提高預(yù)測(cè)人體遺傳毒性的能力。

1 用于彗星試驗(yàn)的3D組織模型

過(guò)去10年，在毒理學(xué)研究中，越來(lái)越多地使用3D細(xì)胞或組織等作為新的非臨床試驗(yàn)系統(tǒng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的替代方法。如何使用3D組織進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)，以及如何將其納入遺傳毒性試驗(yàn)策略已成為遺傳毒性的重要發(fā)展方向。目前，3D皮膚模型已進(jìn)入驗(yàn)證階段，而基于肝和氣道模型的新型3D模型在遺傳毒性檢測(cè)方面顯示出了新的希望［3］。因此，本文重點(diǎn)介紹采用3D皮膚模型、3D肝模型以及3D氣道模型的彗星試驗(yàn)。

1.1 3D皮膚模型

1.1.1 3D皮膚模型的結(jié)構(gòu)和功能

當(dāng)前，彗星試驗(yàn)驗(yàn)證階段使用2種全皮皮膚模型：Phenion?Full-Thickness（FT）皮膚組織和EpiDerm FT?皮膚組織。這2種重建的3D人體表皮皮膚模型均由原發(fā)的和p53感受態(tài)的人類細(xì)胞組成，除了具有DNA修復(fù)能力外，還保留了正常的細(xì)胞周期控制能力，消除了物種屏障問(wèn)題。3D皮膚模型不僅形態(tài)與人類皮膚相似，具有功能的角質(zhì)層作為化學(xué)物質(zhì)吸收的屏障人類皮膚相似，還具有與人類皮膚相似的代謝能力［4］。

1.1.2 3D皮膚模型彗星試驗(yàn)

2017年11月，在東京舉行的第7屆國(guó)際遺傳毒性試驗(yàn)工作組（International Workshop on Genotoxicity Testing，IWGT）會(huì)議研討會(huì)表明，3D皮膚模型經(jīng)過(guò)10多年的發(fā)展已達(dá)到了驗(yàn)證的高級(jí)階段［3］。在驗(yàn)證階段，來(lái)自歐洲和美國(guó)的實(shí)驗(yàn)室參與了30種化學(xué)品的盲法測(cè)試。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)分析顯示，與體內(nèi)彗星試驗(yàn)結(jié)果相比，3D皮膚彗星試驗(yàn)結(jié)果總體準(zhǔn)確性（一致性）為80%（敏感性73%，特異性87%）。在IWGT會(huì)議之后，為增3D皮膚慧星試驗(yàn)加與3D皮膚微核試驗(yàn)中受試物的重合度，進(jìn)一步進(jìn)行了盲法化合物測(cè)試?；衔飵?kù)擴(kuò)增后，3D皮膚彗星試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力得到提高，總體準(zhǔn)確率可達(dá)到83%（靈敏度77%，特異性88%）［3，5］。

3D皮膚模型的優(yōu)點(diǎn)是允許局部應(yīng)用化合物，可評(píng)估配方制劑和難溶性化合物，以及檢測(cè)局部毒理效應(yīng)，并且使用與人體相似皮膚組織提高彗星試驗(yàn)的預(yù)測(cè)能力，減少假陽(yáng)性結(jié)果。目前，3D皮膚模型作為動(dòng)物模型的有效替代，主要應(yīng)用于化妝品遺傳毒性評(píng)價(jià)中。

1.2 3D肝模型

體外遺傳毒性試驗(yàn)的主要問(wèn)題之一是藥物代謝酶的表達(dá)不足。為解決體外試驗(yàn)系統(tǒng)中因藥物代謝酶表達(dá)不足難以檢測(cè)到需代謝活化化合物遺傳毒性的問(wèn)題，1991年，NATARAJAN和DARROUDI［6］發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞能在不加任何外源性代謝活化系統(tǒng)的條件下，檢測(cè)不同機(jī)制的化合物遺傳毒性。之后隨著科學(xué)的發(fā)展，人源化肝細(xì)胞的使用可替代在體外試驗(yàn)中常規(guī)添加的外源性代謝活化系統(tǒng)，這一假設(shè)得到認(rèn)證［7］。較多研究證明，相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)，3D細(xì)胞培養(yǎng)可在一定程度上增強(qiáng)肝細(xì)胞的肝表型、代謝活性和培養(yǎng)穩(wěn)定性［8］。因此，3D肝模型可以更好地用于遺傳毒性化合物的評(píng)價(jià)，尤其是需要代謝活化物質(zhì)的毒性評(píng)價(jià)。

1.2.1 肝細(xì)胞系的選擇

3D肝模型主要采用的人源化肝細(xì)胞為HepG2細(xì)胞和HepaRG細(xì)胞。HepG2細(xì)胞是目前彗星試驗(yàn)研究中使用最為廣泛的人源化肝細(xì)胞系，具有研究數(shù)據(jù)最充分、可檢測(cè)多種模型化合物、易獲得和低維護(hù)成本等諸多優(yōu)點(diǎn)。但HepG2細(xì)胞體外彗星試驗(yàn)的結(jié)果具有明顯的實(shí)驗(yàn)室間差異［7］。而且盡管體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞具有一定程度的肝代謝能力，但其藥物代謝酶的活性和基因表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人原代肝細(xì)胞［9］。HepaRG細(xì)胞也是來(lái)源于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞系。因?yàn)橐逊只腍epaRG細(xì)胞可表達(dá)高水平的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶，因此已分化HepaRG細(xì)胞可作為人肝細(xì)胞的可靠替代物［10］。在體外遺傳毒性評(píng)價(jià)方面，與微核試驗(yàn)結(jié)果相比，采用已分化的HepaRG細(xì)胞開(kāi)展的彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示出更高的特異性，但靈敏度較低。不過(guò)，盡管HepaRG細(xì)胞具有較高的藥物代謝酶水平，但與已有細(xì)胞系如HepG2細(xì)胞相比，使用HepaRG細(xì)胞的彗星試驗(yàn)對(duì)模型化合物篩選的靈敏度較低［11］。

1.2.2 3D培養(yǎng)方式的選擇

近年來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)、微觀工程和材料科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展，3D肝模型有了較大的發(fā)展，出現(xiàn)了不同種類的肝模型：無(wú)支架球體、微型圖像共培養(yǎng)、中空纖維生物反應(yīng)器、肝芯片和生物打印等［12］。已有研究將無(wú)支架肝球體用于體外彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)［13-15］，其余模型尚未應(yīng)用于遺傳毒性評(píng)價(jià)。無(wú)支架肝細(xì)胞球體是肝細(xì)胞在懸浮液中自聚集形成的3D細(xì)胞聚集體，也可加入一些底物促進(jìn)細(xì)胞的聚集。無(wú)支架肝球體可在幾天時(shí)間內(nèi)形成具有一定大小的3D細(xì)胞球體，可在倒懸液滴中形成，也可在具有超低附著表面的多孔板中形成［12］。相較其他培養(yǎng)方式，無(wú)支架球體培養(yǎng)方式具有培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單、培養(yǎng)條件易于標(biāo)準(zhǔn)化和可實(shí)現(xiàn)高通量分析等優(yōu)點(diǎn)，適合藥物研發(fā)早期化合物的篩選。

1.2.3 3D肝模型彗星試驗(yàn)

3D肝模型可用于檢測(cè)無(wú)需代謝活化的遺傳毒性化合物。ELJE等［13］構(gòu)建的3D-HepG2肝細(xì)胞球經(jīng)甲基磺酸甲酯（methylmethanesulfonate，MMS）50 μmol·L-1處理24 h后，發(fā)現(xiàn)DNA損傷顯著增加，但略高于2D細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而在MANDON等［14］的研究中，在暴露24 h條件下，MMS 45 μmol·L-1處理的3D已分化HepaRG細(xì)胞DNA損傷也顯著增加。其余2種無(wú)需代謝活化化合物，僅4-硝基喹啉檢測(cè)出DNA損傷，而依托泊苷在最高濃度下未檢測(cè)出DNA損傷。

3D肝模型最大的優(yōu)點(diǎn)是可用肝細(xì)胞自身代謝活化能力去檢測(cè)需代謝活化的遺傳毒性化合物。MANDON等［14］采用3D已分化HepaRG球體，并將暴露時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，共檢測(cè)出6種需代謝活化的遺傳毒性化合物〔苯并芘20 μmol·L-1、環(huán)磷酰胺1000 μmol·L-1、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并［4，5-b］吡啶40 μmol·L-1、丙烯酰胺500 μmol·L-1、7，12-二甲基苯并（a）蒽20 μmol·L-1、2-乙酰氨基芴50 μmol·L-1〕分別在相應(yīng)濃度下顯著誘導(dǎo)HepaRG球體的DNA損傷。3種需代謝活化的遺傳毒性化合物2-氨基-3-甲基咪唑［4，5-f］喹諾酮、依托泊苷和2，4-二氨基甲苯則未檢測(cè)出DNA損傷。

1.3 3D氣道模型

1.3.1 3D氣道模型的結(jié)構(gòu)和功能

目前使用的商業(yè)化的重建人3D氣道模型主要為EpiAirway?模型和MucilAir?模型，可在短、長(zhǎng)期培養(yǎng)中表現(xiàn)出與人氣道組織相似的形態(tài)和代謝特征。MucilAir?模型是以人鼻腔或支氣管活組織切片細(xì)胞重組的3D氣道模型，可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持恒定的培養(yǎng)狀態(tài)，最長(zhǎng)可達(dá)1年。并且MucilAir?模型外源性代謝基因表達(dá)與正常人肺有很強(qiáng)的相似性，可維持表達(dá)水平6個(gè)月不變［16］。EpiAirway?模型由正常人氣管和支氣管上皮細(xì)胞組成，分化為含有纖毛和分泌黏液的杯狀細(xì)胞的假層狀三維組織。因此，該模型與呼吸道的細(xì)支氣管上皮非常相似，體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月。在誘導(dǎo)分化后的EpiAirway?氣道模型中可檢測(cè)到CYP1A1的活性，但未發(fā)現(xiàn)CYP2D6，3A4，2C9和2E1的活性［16］。

1.3.2 3D氣道模型彗星試驗(yàn)

在EpiAirway?模型中使用遺傳毒性陽(yáng)性化合物如MMS處理后，可在體外彗星試驗(yàn)得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的、濃度依賴的尾DNA百分比增加結(jié)果［17］。另外，由于納米材料的人體關(guān)鍵吸收途徑是吸入途徑，因此與人體氣道環(huán)境相似的3D氣道模型可更好模擬吸入納米材料在人體中的作用。EpiAirway?模型還可以體外彗星試驗(yàn)法評(píng)價(jià)納米材料的遺傳毒性，共檢測(cè)出5種納米材料即納米氧化鋅（ZnO-NP）、50 nm檸檬酸納米銀（Ag-NP.50.citrate）、未修飾納米二氧化硅（SiO2-NP.unmodifed）、磷酸鹽納米二氧化硅（SiO2-NP.phosphate）和三氧雜癸酸納米二氧化鋯（ZrO2-NP.TODS）的遺傳毒性［18］。其中，在暴露時(shí)間為60 h的處理?xiàng)l件下，使用EpiAirway?3D模型檢測(cè)出的ZnO-NP和Ag-NP.50.citrate，這2種納米材料為遺傳毒性強(qiáng)陽(yáng)性。而不溶性SiO2-NP，SiO2-NP.phosphate和ZrO2-NP.TODS的遺傳毒性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但僅在最小值之上且未觀察到細(xì)胞毒性。

近日，美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局國(guó)家毒理研究中心使用自主開(kāi)發(fā)的人氣液界面氣道培養(yǎng)系統(tǒng)開(kāi)展了4-（甲基亞硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮的彗星試驗(yàn)，也報(bào)道了其對(duì)DNA損傷的陽(yáng)性反應(yīng)［19］。早先也有采用人鼻上皮器官培養(yǎng)模型進(jìn)行彗星試驗(yàn)的研究，驗(yàn)證了N-亞硝基二乙胺、重鉻酸鈉和N′-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍的遺傳毒性［20］。

1.4 3D重建人角膜上皮模型

局部眼科用藥（如滴眼液）是直接作用于眼部，其局部給藥特點(diǎn)是作用時(shí)間短和暴露濃度高。因此，在評(píng)估局部眼科藥物的潛在遺傳毒性時(shí)，針對(duì)藥物的作用特點(diǎn)，可使用3D重建人角膜上皮模型對(duì)該類藥物進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)。3D重建人角膜上皮模型由正常的人角膜上皮細(xì)胞組成，通過(guò)在特殊基質(zhì)上培養(yǎng)方式使細(xì)胞在空氣-液體界面上培養(yǎng)13 d，完成具有完全分化的角膜上皮多層結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，具有正常人類角膜上皮組織的特征［21］。

TAHARA等［22］使用3D重建人角膜上皮模型檢測(cè)了7種陽(yáng)性模型化合物的遺傳毒性，并用單層培養(yǎng)的永生化人角膜上皮細(xì)胞HCE-T細(xì)胞暴露在相同的化學(xué)物質(zhì)中進(jìn)行比較。在暴露時(shí)間為1 min的試驗(yàn)條件下，3D角膜上皮模型和HCE-T細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性模型化合物的靈敏性分別為86%和71%。在3D角膜上皮模型中，DNA損傷的最低濃度大約是HCE-T細(xì)胞中的100倍。由于3D重建人角模上皮模型在形態(tài)上與人體角膜組織相似，具有多層細(xì)胞并且有緊密的連接，因此化合物的滲透率低于單層培養(yǎng)細(xì)胞，但檢測(cè)陽(yáng)性化合物的靈敏性高于單層HCE-T細(xì)胞。因此，使用3D重建人角膜上皮模型的彗星試驗(yàn)可能比使用單層培養(yǎng)的HCE-T細(xì)胞更能反映體內(nèi)條件。

2 彗星芯片

標(biāo)準(zhǔn)的彗星試驗(yàn)方法在重復(fù)性和通量方面存在一定的局限性。彗星芯片的開(kāi)發(fā)使得高通量、快速分析化合物對(duì)DNA的損傷成為可能，適用于大規(guī)模篩選和研究遺傳毒性化合物，以及與DNA損傷和修復(fù)相關(guān)的人類流行病學(xué)研究。

2.1 彗星芯片的組成

目前彗星芯片的開(kāi)發(fā)包括一整套玻片及儀器和軟件平臺(tái)，用于體外彗星試驗(yàn)的高通量檢測(cè)［23］。最新的彗星芯片平臺(tái)包括96孔彗星芯片、專用的硬件平臺(tái)和專用的數(shù)據(jù)處理軟件。彗星芯片的96孔板中瓊脂糖平板具有微陣列的結(jié)構(gòu)，每孔中具有400～500個(gè)的微孔，比傳統(tǒng)的基于玻片的彗星檢測(cè)手段增加了約200倍的容量，具有高通量的特征。彗星芯片內(nèi)的瓊脂糖微圖可使細(xì)胞裝載到單獨(dú)的微孔中，在同一平面上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的均勻分布，再通過(guò)專用的硬件平臺(tái)和專用的數(shù)據(jù)處理軟件，使單一彗星圖片的分析成為可能，極大提高了試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，并且不重合的彗星圖像簡(jiǎn)化了后續(xù)圖像收集的難度，捕獲和分析圖片的時(shí)間從7～10 d縮短至90 min，大大提高了試驗(yàn)效率。

2.2 彗星芯片的應(yīng)用

彗星芯片不僅可進(jìn)行引起DNA損傷物質(zhì)的常規(guī)鑒定，還可通過(guò)分析外周血單個(gè)核細(xì)胞來(lái)評(píng)估人群對(duì)遺傳毒性暴露的易感性，從而為流行病學(xué)研究提供參考依據(jù)［23］。

將彗星芯片技術(shù)加以改良，可以實(shí)現(xiàn)在檢測(cè)DNA損傷的同時(shí)提供更多被檢測(cè)物質(zhì)有效信息。如將彗星芯片進(jìn)行改良后開(kāi)發(fā)出的一種EpiComet芯片［24］可同時(shí)分析DNA損傷和甲基化水平，實(shí)現(xiàn)高通量、快速、便捷的檢測(cè)。EpiComet芯片的檢測(cè)過(guò)程中使用的甲基化特異性內(nèi)切酶McrBC，可將無(wú)法檢測(cè)到的DNA甲基化轉(zhuǎn)化為單鏈斷裂，并用彗星試驗(yàn)方法和系統(tǒng)進(jìn)行定量。EpiComet芯片對(duì)63種化合物DNA甲基化檢測(cè)的準(zhǔn)確率分別為：?jiǎn)螛颖靖呒谆?.5倍）為87%，低甲基化（1.25倍）為100%，假陰性率為4%，假陽(yáng)性率為10%，具有高準(zhǔn)確性、低假陰性率和假陽(yáng)性率的特點(diǎn)［24］。

將彗星芯片與新型人源化肝細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行彗星試驗(yàn)，可用于需要代謝活化的遺傳毒性物質(zhì)的檢測(cè)。SEO等［25］將高通量高內(nèi)涵彗星芯片技術(shù)應(yīng)用于代謝能力強(qiáng)的HepaRG細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，以評(píng)估一組已知的不同遺傳毒性和致癌性的28種化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性。使用HepaRG和HepG2細(xì)胞進(jìn)行的彗星芯片試驗(yàn)，檢測(cè)需要代謝活化的遺傳毒性致癌物的靈敏度分別為80%和40%。HepaRG彗星芯片法檢測(cè)潛在遺傳毒性致癌物的總靈敏度和特異性分別為67%和100%。還有研究將DNA修復(fù)合成抑制劑羥基脲（hydroxyurea，HU）和1-β-D-阿糖腺苷胞嘧啶（1-β-D-arabinofuranosyl cytosine，AraC）與具有代謝活性的人源化細(xì)胞系HepaRG?相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種用于高通量遺傳毒性檢測(cè)的彗星芯片平臺(tái)［26］。該平臺(tái)通過(guò)對(duì)已知的9種體內(nèi)遺傳毒性物質(zhì)進(jìn)行小范圍篩選，證明了該平臺(tái)與傳統(tǒng)試驗(yàn)相比具有更高的敏感性，可檢測(cè)到傳統(tǒng)彗星試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)到的可能致癌的大面積加合物。

3 動(dòng)物模型

目前，動(dòng)物試驗(yàn)被認(rèn)為是評(píng)估人類用藥風(fēng)險(xiǎn)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于物種差異，很難從這些動(dòng)物模型中推斷出人類用藥風(fēng)險(xiǎn)。

最近，人肝細(xì)胞嵌合小鼠的使用提供了一種使用人肝細(xì)胞作為體內(nèi)靶細(xì)胞，以維持人體內(nèi)肝細(xì)胞原有的特性，用于遺傳毒性評(píng)價(jià)的新思路。人肝細(xì)胞嵌合小鼠是將供體肝細(xì)胞移植入免疫缺陷的uPA/SCID小鼠或cDNA-uPA/SCID小鼠體內(nèi)。經(jīng)過(guò)數(shù)周培養(yǎng)后，小鼠70%的肝細(xì)胞被人肝細(xì)胞替代，并且保留了人代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性［27］。但根據(jù)人肝細(xì)胞嵌合小鼠對(duì)2個(gè)遺傳毒性模型化合物N-乙基-N-亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）與黃曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）體內(nèi)彗星試驗(yàn)結(jié)果顯示，ENU可顯著誘導(dǎo)肝彗星及骨髓微核的形成，而AFB1未誘導(dǎo)肝彗星與骨髓微核的形成［28］。雖然人肝細(xì)胞嵌合小鼠具有人肝細(xì)胞代謝功能，但是并未檢測(cè)出需代謝活化的AFB1的遺傳毒性，再加上人肝細(xì)胞嵌合小鼠昂貴的造模成本使得試驗(yàn)樣本數(shù)量有限，人肝細(xì)胞嵌合小鼠在遺傳毒性檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步評(píng)估。

此外，轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的產(chǎn)生和發(fā)展也推動(dòng)了遺傳毒性研究的進(jìn)展。近年來(lái)相繼開(kāi)發(fā)了一些轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠模型如Big Blue小鼠/大鼠、Muta小鼠/大鼠和GPT delta小鼠/大鼠。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型可評(píng)估多個(gè)器官的遺傳毒性，在化學(xué)制劑及納米材料暴露后的體內(nèi)遺傳毒性效應(yīng)和修復(fù)機(jī)制研究方面具有很大的價(jià)值［29］。

4 展望

結(jié)合上述幾種用于體內(nèi)和體外彗星試驗(yàn)的新方法，可以看到隨著相關(guān)科學(xué)研究的深入及一些新方法的逐步應(yīng)用，彗星試驗(yàn)正在進(jìn)一步升級(jí)。目前的發(fā)展方向主要有以下幾種：①開(kāi)發(fā)新型體外組織模型和動(dòng)物模型。3D組織模型不僅具有模擬人體細(xì)胞組織的結(jié)構(gòu)和功能，還具有與人體器官如皮膚、肝相近的代謝能力，可降低體外試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性率，解決目前體外彗星試驗(yàn)結(jié)果存在的假陽(yáng)性率較高的問(wèn)題。另外，使用3D組織模型進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)可減少動(dòng)物的使用，更加符合3R原則的要求，且開(kāi)發(fā)新型動(dòng)物模型可減少種屬差異所致的與人體不相關(guān)的遺傳毒性問(wèn)題。②開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的高通量彗星試驗(yàn)方法。彗星試驗(yàn)的分析方法相對(duì)簡(jiǎn)單、靈敏度高，但檢測(cè)的通量較低，重現(xiàn)性差，成像分析方法較為繁瑣。未來(lái)可繼續(xù)提高彗星試驗(yàn)的自動(dòng)化程度，將彗星試驗(yàn)的各個(gè)步驟集成到一個(gè)自動(dòng)化彗星芯片的處理單元中，開(kāi)發(fā)一種更為簡(jiǎn)單和快速的評(píng)分方法。③擴(kuò)大彗星試驗(yàn)的檢測(cè)終點(diǎn)。彗星試驗(yàn)條件的一個(gè)主要缺點(diǎn)是只能檢測(cè)直接影響DNA遷移的DNA鏈斷裂，而不能檢測(cè)堿基修飾或大量DNA加合物。因此，可使用一些手段擴(kuò)大檢測(cè)到彗星試驗(yàn)的損傷范圍（如利用特異功能酶和DNA修復(fù)合成酶抑制劑），為化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)提供更多有效的遺傳損傷信息。

隨著細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，彗星試驗(yàn)技術(shù)將持續(xù)改進(jìn)，并擴(kuò)大新技術(shù)新方法在彗星試驗(yàn)中的驗(yàn)證，使其更廣泛、更有效地應(yīng)用于藥物、化妝品、環(huán)境和生態(tài)等領(lǐng)域的遺傳毒性評(píng)價(jià)和研究。