畢可然，李銀，韓凱凱，趙冬敏，劉青濤，劉宇卓，黃欣梅，楊婧

鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體制備

畢可然1,2，李銀1，韓凱凱1，趙冬敏1，劉青濤1，劉宇卓1，黃欣梅1，楊婧1

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇海洋大學(xué)，江蘇連云港，222005）

【】已有研究獲得鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白（oligoadenylate synthase-like protein，OASL）基因全長，并且證明其可以抑制鴨坦布蘇病毒復(fù)制。因此在通過原核表達(dá)和多克隆抗體制備技術(shù)獲得帶有GST標(biāo)簽的鴨寡腺苷酸合成酶樣融合蛋白和該融合蛋白的特異性抗體，為進(jìn)一步明確鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白抑制病毒復(fù)制分子機(jī)制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)前期研究已經(jīng)獲得的鴨OASL基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R。利用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取健康櫻桃谷鴨幼鴨脾臟總RNA；通過RT-PCR，利用隨機(jī)引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增獲得鴨脾臟cDNA，以cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)合成的pGEX-OAS-F和pGEX-OAS-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后將片段大小與目的條帶大小相同的PCR產(chǎn)物切膠純化，純化后的產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體，挑取單克隆菌落送基因公司測序，測序驗(yàn)證正確的PCR純化產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶HI和I酶切連接至帶GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4t-1。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（PLYSS）TM，經(jīng)終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后檢測該融合蛋白的表達(dá)情況。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌菌液，進(jìn)行超聲波破碎處理，收集上清及沉淀，采用SDS-PAGE和Western-blotting分析融合蛋白的表達(dá)。利用GST柱親和純化上清中的可溶性融合蛋白，經(jīng)20 mmol·L-1Tris-HCL和0.10 mol·L-1NaCL溶液透析后獲取純化的融合蛋白，采用SDS-PAGE分析純化的融合蛋白。采用皮下多點(diǎn)注射方法免疫新西蘭白兔，經(jīng)3次免疫后制備多克隆抗血清，采用SDS-PAGE和間接免疫熒光檢測抗體的純度和效價(jià)?？寺y序結(jié)果表明，設(shè)計(jì)合成的鴨OASL基因全長擴(kuò)增引物pGEX-OAS-F 和 pGEX-OAS-R能夠從櫻桃谷鴨脾臟中獲得鴨OASL基因ORF序列，并且序列組成與前期研究結(jié)果一致。被擴(kuò)增的序列經(jīng)酶切后，鴨OASL基因能夠與pGEX-4t-1載體成功連接，IPTG誘導(dǎo)后可以在大腸桿菌BL21（PLYSS）TM中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blotting分析顯示，融合蛋白大小約為84 kD，主要以可溶性蛋白形式表達(dá)，在包涵體中也有少量表達(dá)。經(jīng)GST親和層析純化上清中的可溶性鴨OASL融合蛋白，得到0.5 mmol·L-1純度抗原蛋白。經(jīng)3輪免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，純化后ELISA結(jié)果顯示鴨OASL蛋白抗體具有較好的靈敏度，最高效價(jià)為1:512 000，SDS-PAGE結(jié)果顯示抗體大小為55 kD，與ORF理論值相同，且抗體純度為90%以上。設(shè)計(jì)合成的引物能夠成功地獲得鴨脾臟OASL基因ORF序列，該ORF能夠在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白通過免疫新西蘭兔能夠獲得高純度和高效價(jià)的鴨OASL多克隆抗體，研究成果為后續(xù)深入研究鴨OASL蛋白抑制病毒復(fù)制分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

鴨寡腺苷酸合成酶；原核表達(dá)；多克隆抗體

0 引言

【研究意義】養(yǎng)鴨業(yè)是我國的特色產(chǎn)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的提高，各種病害頻繁發(fā)生，病毒病是危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白（duck oligoadenylate synthetase-like protein，DuOASL）是寡腺苷酸合成酶家族蛋白的一種，已有研究表明OAS家族蛋白是一種具有廣譜的抗病毒活性蛋白，當(dāng)人被病毒感染后，人OASL蛋白快速通過C端泛素化區(qū)與視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）的CARDs結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而激活RIG-I信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞檢測病毒RNA的能力，繼而激活機(jī)體免疫系統(tǒng)來感知病毒并且抑制病毒復(fù)制[1]。因此，基于筆者前期的研究結(jié)果，通過原核表達(dá)和多克隆抗體制備技術(shù)獲得帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)蛋白和多克隆抗體對(duì)深入探討鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白抑制病毒復(fù)制分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)物質(zhì)基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】在禽類中，日本學(xué)者首次證實(shí)雞體內(nèi)OAS 家族蛋白為OASL蛋白，該蛋白可以抑制黃病毒屬的西尼羅河病毒復(fù)制[2]；最近，Tag-EL-Din-Hassan等[3-4]進(jìn)一步證實(shí)，雞OASL蛋白不僅具有重要的抗病毒特性，而且該蛋白的抗病毒特性不依賴于2—5寡腺苷酸合成酶。我國學(xué)者楊超等也報(bào)道鵝體內(nèi)僅有OASL蛋白，過表達(dá)鵝OASL能抑制新城疫病毒在鵝胚成纖維細(xì)胞中的復(fù)制[5]。韓凱凱等基于鴨卵泡組織差異蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)鴨OASL蛋白在鴨坦布蘇病毒感染組和未感染組表達(dá)存在差異，在病毒感染組中表達(dá)明顯增強(qiáng)[6]。前期研究首次獲得了鴨OASL基因全長，蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，鴨OASL蛋白N端具有寡腺苷酸合成酶樣結(jié)構(gòu)域，C端具有泛素化樣結(jié)構(gòu)域，并且寡腺苷酸合成酶樣結(jié)構(gòu)域中具有保守的寡腺苷酸合成酶活性位點(diǎn)，預(yù)測可能具有寡腺苷酸合成酶的特性[7]。Hassan 等[8]2018年對(duì)鴨、鵝和鴕鳥的OAS基因進(jìn)行了功能分析，結(jié)果證實(shí)鴨、鵝和雞的OASL一樣，既具有寡腺苷酸合成酶特性，又具有不依賴于寡腺苷酸合成酶的抗黃病毒特性；而鴕鳥的OASL只具有抗黃病毒特性，不具有OAS1蛋白的寡腺苷酸合成酶特性。在哺乳動(dòng)物OAS家族蛋白抗病毒研究中，一些學(xué)者證實(shí)OAS蛋白可以激活受體內(nèi)切核糖核酸酶L（Endoribonuclease L，RNase L），二者結(jié)合后可以通過OAS/RNaseL途徑實(shí)現(xiàn)抗病毒的作用，進(jìn)而降解感染細(xì)胞中的RNA，有效阻止RNA病毒的復(fù)制（圖1）[9]，該信號(hào)通路在宿主控制黃病毒、呼腸孤病毒、腦心肌炎病毒和流感病毒的先天性免疫反應(yīng)中起重要作用[10-12]。此外，鴨OASL蛋白C端泛素化樣結(jié)構(gòu)域與人OASL蛋白相似性高達(dá)96.2%[13]，而人OASL蛋白C端泛素化結(jié)構(gòu)域是RIG-I信號(hào)通路激活的關(guān)鍵區(qū)域（圖2）[14]。2015 年，Ibsen等[15]證實(shí)人OASL 蛋白C端泛素化結(jié)構(gòu)域可以取代K63連接的多泛素化鏈與RIG-I蛋白的CARDs結(jié)構(gòu)域結(jié)合，N端寡腺苷酸合成酶樣結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)結(jié)合dsRNA的凹槽，二者協(xié)同作用不僅可以檢測病毒RNA，還可以激活RIG-I信號(hào)通路，對(duì)病毒RNA具有監(jiān)測和抑制作用。之后，Alcorn 等[16]也證實(shí)哺乳動(dòng)物OASL蛋白具有抵抗流感病毒NS1 蛋白介導(dǎo)的免疫逃逸潛力，同時(shí)，不像RIG-I蛋白，過表達(dá)的OASL蛋白不會(huì)激活干擾素因子，進(jìn)而不會(huì)產(chǎn)生對(duì)宿主有毒副作用的其他產(chǎn)物。Dhar等[17]也發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物OASL蛋白能夠克服呼吸道合胞體病毒NS1介導(dǎo)的免疫逃逸，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒復(fù)制的抑制。BI等[13]通過鴨OASL蛋白過表達(dá)和干擾表達(dá)在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)其可以抑制鴨坦布蘇病毒的復(fù)制。HU等[18]通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中已有動(dòng)物OAS家族蛋白序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，即使沒有dsRNA刺激，古老的OAS蛋白也具有2—5和3—5寡腺苷酸合成酶特性。然而受進(jìn)化壓力影響，高等后生動(dòng)物OAS蛋白與dsRNA的親和能力增強(qiáng)并且僅具有2—5寡腺苷酸合成酶特性，研究結(jié)果為后生動(dòng)物體內(nèi)OASs的功能研究提供新的思路。Wang等[19]通過分子克隆技術(shù)獲得了豬OASL基因全長，序列分析表明，該基因C端不具有泛素化區(qū)域。通過RNAi沉默和過表達(dá)表明，豬OASL基因N端31—60氨基酸序列是抗病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域。Yao等[20]通過分子克隆技術(shù)獲得了樹鼩OAS家族全部基因，分析表明樹鼩OAS家族有OAS1、OAS2、OASL1和OASL2四個(gè)基因，OAS1和OAS2具有抗病毒特性，而OASL1和OASL2不具有抗病毒特性。【本研究切入點(diǎn)】盡管從分子生物學(xué)角度掌握了鴨OASL蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)其有抗病毒復(fù)制的特性，但其抗病毒分子機(jī)制仍然是一片空白，而且在其它禽類研究中也無相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究基于前期獲得的OASL基因全長，通過RT-PCR擴(kuò)增、載體構(gòu)建和蛋白純化等方法獲得帶有GST標(biāo)簽的OASL融合蛋白，并通過免疫方法獲得鴨OASL蛋白多克隆抗體，為進(jìn)一步研究鴨OASL蛋白抗病毒復(fù)制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

圖1 OAS蛋白介導(dǎo)的OAS/RNase L抗病毒途徑

圖2 OASL蛋白介導(dǎo)的RIG-I信號(hào)通路的增強(qiáng)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

動(dòng)物總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，櫻桃谷鴨幼鴨、含有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4t-1和大腸桿菌BL21（PLYSS）TM為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家禽重大疫病防控項(xiàng)目組保存提供；限制性內(nèi)切酶H I和I購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA聚合酶購自日本Toyobo公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質(zhì)粒試劑盒、無縫克隆試劑盒、鼠源GST標(biāo)簽抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和ECL發(fā)光液均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；新西蘭白兔購自江蘇省農(nóng)科院種兔場；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所有試驗(yàn)均在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家禽重大疫病防控研究室完成。

1.2 PCR擴(kuò)增

2017年4月，根據(jù)已經(jīng)獲得的鴨OASL基因ORF序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)PCR擴(kuò)增引物pGEX-OAS-F:5′-G GATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGAGCTGTGGA ACGTGTC-3′和pGEX-OAS-R: 5′-CAGTCACGATGC GGCCGCTCGAGTCAGGAGGACGGGCAGCCG-3′，以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所動(dòng)物房養(yǎng)殖的櫻桃谷鴨幼鴨脾臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系50 μL：33 μL 滅菌水，5 μL 10×Buffer，5 μL dNTPs（2 mmol·L-1），3 μL Mg2+，1 μL 脾臟cDNA，1 μL正反向引物，1 μL KOD-Plus-neo。PCR條件：94 ℃ 2min；98 ℃ 10 s、68 ℃ 1min（30個(gè)循環(huán)）；68℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，然后利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

將目的條帶和帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4t-1載體分別用H I和I雙酶切，酶切產(chǎn)物用無縫克隆試劑盒37℃反應(yīng)45 min，轉(zhuǎn)化到BL21（PLYSS）TM感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4t-1-OASL。經(jīng)菌落PCR鑒定后，挑選陽性重組表達(dá)質(zhì)粒送上海英俊公司測序。

1.4 OASL融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白分析

鑒定過的重組表達(dá)菌株接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1氨芐霉素）中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取50 μL接種于5 mL的LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1氨芐霉素）中，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液濃度OD600達(dá)0.4—0.7左右時(shí)，取出1 mL作對(duì)照，剩余部分加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后收菌液，誘導(dǎo)后的菌液分別經(jīng)12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用菌體裂解液垂懸，超聲波破碎30 min，取50 μL破碎混合液后剩余液體12 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，沉淀用PBS重懸，誘導(dǎo)前混合液、誘導(dǎo)后破碎混合液、上清和沉淀分別與4×蛋白電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min后經(jīng)SDS-PAGE和Western-bloting檢測蛋白表達(dá)情況。

1.5 OASL融合蛋白的純化

鑒定過的重組表達(dá)菌株接種于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1氨芐霉素）中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取50 μL接種于5 mL的LB培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1氨芐霉素）中，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液濃度OD600達(dá)0.4—0.7左右時(shí)，取出1 mL作對(duì)照，剩余部分加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h后收菌液，超聲破碎，將上清用0.45 μm濾膜過濾后加入GST親和層析柱中，洗脫液洗脫后將收集的蛋白溶液加入透析袋中，對(duì)未純化的蛋白、透出液及洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析，檢測目的蛋白的純化效果，并用BCA法測定純化蛋白的濃度。

1.6 OASL融合蛋白多克隆抗體的制備

用純化和測定的OASL 重組蛋白先后3次皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。第一次免疫采用弗氏完全佐劑和蛋白樣品按1﹕1混合，超聲破碎儀乳化后免疫，蛋白免疫量為每只400 μg。二周以后二免，純化的蛋白與不完全弗氏佐劑等量乳化后免疫，間隔一周后加強(qiáng)免疫，最后一次免疫后的14 d，心臟采血收集血清。

1.7 OASL融合蛋白多克隆抗體的純化與鑒定

將蛋白OASL與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱，將所得抗血清與PBS等量混合后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，即得到所需純化抗體，立即在PBS溶液中進(jìn)行4℃透析過夜，隔日通過ELISA檢測純化抗體的效價(jià)，利用BCA 法測定純化蛋白的濃度，通過SDS-PAGE電泳觀察純化抗體的純度。

2 結(jié)果

2.1 鴨全長OASL基因擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX- 4t-1-OASL的鑒定

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在溴化乙錠染色后的凝膠上清晰可見1 500 bp左右的單一條帶（圖3），與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定后，8個(gè)菌落中有3個(gè)含有目的基因，在接近2 000 bp處有明亮且單一的條帶（圖3）。3個(gè)菌落轉(zhuǎn)移至LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液經(jīng)小量提取質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒DNA，上海英俊公司測序后確定序列全長為1 512 bp，與目的條帶大小一致。證明OASL基因成功連接到pGEX-4t-1載體上，并且篩選出的菌株為陽性菌株。

2.2 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白分析

SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后融合蛋白主要在上清液中表達(dá)，蛋白分子量大小與理論分子量大小83.58 kD相同，IPTG誘導(dǎo)前未見該蛋白條帶（圖4-A）。Western blotting分析結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果一致，IPTG誘導(dǎo)前沒檢測到融合蛋白，IPTG誘導(dǎo)4 h后，混合液中融合蛋白含量最高，上清次之，沉淀最少（圖4-B），進(jìn)一步證明GST標(biāo)簽的鴨OASL蛋白主要以可溶性形式存在，但也有少數(shù)的包涵體蛋白。

M：左Left：Trans5K DNA marker，右Right：Trans2K DNA marker; 1:RT-PCR; 2-9:菌落PCR Colony PCR

M：蛋白marker；1：IPTG誘導(dǎo)前；2：IPTG誘導(dǎo)后全菌；3：IPTG誘導(dǎo)后沉淀；4：IPTG誘導(dǎo)后上清

2.3 融合蛋白的純化

鑒定過的重組表達(dá)菌株經(jīng)過擴(kuò)大體積培養(yǎng)后，將所獲菌體進(jìn)行超聲破碎，離心后取上清液，用GST標(biāo)簽親和層析柱對(duì)上清液中的可溶性目的蛋白進(jìn)行富集，多次洗滌除去多余雜蛋白，最后用GST Elution- Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，50 mmol·L-1GSH，0.15 mol·L-1NaCl，pH8.0）以1 mL·min-1流速洗脫目的蛋白，收集流出液，上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mmol·L-1Tris-HCl，0.10 mol·L-1NaCl，pH8.0進(jìn)行透析過夜，經(jīng)12%的SDS-PAGE 膠電泳檢測，在83 kD附近獲得一條明顯條帶，其分子量大小與理論值相符，同時(shí)洗脫液中蛋白所含雜帶較少，說明獲得純度較高的目的蛋白（圖5）。將目的蛋白用BCA法測定其濃度達(dá)0.5 mg·mL-1，作為免疫動(dòng)物的抗原。

M：蛋白marker; 1:未純化重組蛋白；2：流出液；3：洗脫液

2.4 多克隆抗體的鑒定

OASL蛋白通過抗原親和純化層析柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE檢測可見55 kD左右有一明亮單一的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖6）。結(jié)果表明，純化后的多克隆血清純度較高。ELISA 方法檢測結(jié)果顯示，重組OASL蛋白濃度為5 μg·mL-1時(shí)，OASL家兔多克隆血清效價(jià)為1:512 000。

圖6 抗體SDS-PAGE檢測

3 討論

寡腺苷酸合成酶（oligoadenylate synthase，OAS）是干擾素誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的一種重要抗病毒蛋白，在宿主先天性免疫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要的作用。該酶最早在干擾素處理后的人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，而后在哺乳動(dòng)物、鳥類和低等生物如海綿動(dòng)物體內(nèi)也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道[21-22]。OAS家族蛋白包括OAS1、OAS2、OAS3和OASL等4個(gè)成員，OAS1、OAS2、OAS3和OASL均有核苷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（nucleotidyl transferase，NTase），但各有1、2、3和1個(gè)OAS 結(jié)構(gòu)域，OASL比起其他3個(gè)成員在C 端多了兩個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-like，UBL）（圖7）[23]，該泛素化區(qū)可以與RIG-I蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活RIG-I信號(hào)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒增殖的抑制，該結(jié)果已經(jīng)在人、鼠和豬OASL蛋白研究中證實(shí)[24-27]。OAS2和OAS3蛋白僅分布在哺乳動(dòng)物中，OAS1和OASL蛋白廣泛分布于各種動(dòng)物體內(nèi)[28]。人的OASL基因和雞的OASL基因有很高的同源性，但是雞的OASL蛋白卻具有很強(qiáng)的酶活性[29]。前期的研究表明，鴨OASL蛋白與其他已報(bào)到的禽類OASL蛋白具有很高的同源性，N端的NTase結(jié)構(gòu)域和寡腺苷酸合成酶樣結(jié)構(gòu)域都有保守的P-loop、D-box、LIRL、YALELLT、RPVILDPADP區(qū)及關(guān)鍵的賴氨酸和精氨酸，這些序列保守區(qū)對(duì)寡腺苷酸合成酶活性的發(fā)揮起著決定性作用[13]。在細(xì)胞學(xué)水平，通過體外試驗(yàn)證實(shí)鴨OASL蛋白能夠抑制鴨坦布蘇病毒的復(fù)制，但在體內(nèi)，由于缺少相應(yīng)蛋白的特異性抗體，所以，當(dāng)鴨被病毒感染后，無法從蛋白質(zhì)水平對(duì)DuOASL進(jìn)行監(jiān)測和分析。本試驗(yàn)基于前期獲得鴨脾臟cDNA文庫，利用RT-PCR方法將鴨OASL基因成功克隆到高效表達(dá)載體pGEX-4t-1中進(jìn)行表達(dá)，通過改變誘導(dǎo)劑IPTG 的用量和誘導(dǎo)時(shí)間找到表達(dá)量最高的條件，對(duì)OASL蛋白進(jìn)行分離純化，免疫家兔，獲得抗OASL的多克隆血清，經(jīng)間接ELISA 鑒定，多抗血清抗體效價(jià)較高，同時(shí)，原核表達(dá)的OASL融合蛋白具有GST標(biāo)簽抗體，為今后從DuOASL蛋白水平監(jiān)測鴨被病毒感染狀況和從蛋白水平篩選與DuOASL蛋白互作的病毒蛋白奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖7 OAS 家族的保守蛋白結(jié)構(gòu)域和保守氨基酸區(qū)域

4 結(jié)論

通過原核表達(dá)技術(shù)獲得了帶有GST標(biāo)簽的鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白融合蛋白，蛋白純度是0.5 mg·mL-1。通過免疫學(xué)方法獲得了鴨寡腺苷酸合成酶樣蛋白多克隆抗體，抗體效價(jià)為1:51 200。

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Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Duck Oligoadenylate Synthase-Like Protein

BI KeRan1,2, LI Yin1, HAN KaiKai1, ZHAO DongMin1, LIU QingTao1, LIU YuZhuo1, HUANG XinMei1, YANG Jing1

(1Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014;2College of Marine Life and Fisheries, Jiangsu Ocean University, Lianyungang 222005, Jiangsu)

【】In previous study, we have obtained the full-length gene of duck oligoadenylate synthase-like protein (duOASL) and confirmed that duOASL could inhibit DTMUV replication. To further investigate the inhibitory effect of duOASL on DTMUV replication, the recombinant protein (pGEX-OASL) with GST tag and polyclonal antibody of duOASL protein was obtained by prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation technology. These results would lay a foundation for performing further studies to determine mechanism(s) underlying the antiviral activity duOASL at the molecular level. 【】Primers were designed based on the ORF sequence of duOASL gene from healthy Cherry Valley ducks. Total RNA was extracted from the spleen tissues of duckling by using HP Total RNA kits. The cDNA was synthesized using random primers and M-MLV reverse transcriptase. Full-length of duOASL gene was obtained by synthesising pGEX-OAS-F and pGEX-OAS-R primers by using the cDNA. The PCR results were detected by 1.5% agarose electrophoresis. The sequences of the same size as the target band were purified and cloned to pEASY-T1 vector. The cloned gene ORF was inserted into the expression vector pGEX-4t-1 with GST tag and byH I andI digestion. The recombinant plasmid was transformed intoBL21 and expressed under the induction with 0.5 mmol·L-1IPTG for 4 h. The expression of the fusion protein was detected by SDS-PAGE and Western-blotting. Then the polyclonal antibody was obtained from rabbits which had immunized by the purified duOASL recombinant protein. The purity and titer of the polyclonal antibody were determined by SDS-PAGE and ELISA.【】The recombinant protein was a soluble protein and the molecular weight was 84 kD. The purity was 0.5 mg·mL-1. The antibody titer of polyclonal antibodies was 1:512 000.【】Above results would lay a foundation for further studies of duOASL inhibiting DTMUV replication.

OASL; prokaryotic expression; polyclonal antibody

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.23.024

2019-04-23；

2019-07-22

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFD0500800）、江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20160064）、國家博士后基金項(xiàng)目（2016M590430）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(15)1008）

畢可然，Tel：15896101504；E-mail：bikeran@126.com。

李銀，Tel：13512510567；E-mail：muziyin08@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）