蔡黎明，張巧妮，李勇男，黃永胡，吉冰洋

體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）是體外循環(huán)技術(shù)在臨床使用上的延伸和擴展，其本質(zhì)是一種人工心肺機，通過部分替代心臟和肺臟的功能以減輕患者本身心肺壓力從而獲得恢復(fù)時機的原理來達到治療目的。相關(guān)臨床數(shù)據(jù)顯示，ECMO的使用從最初患者并無明顯受益且并發(fā)癥發(fā)生率高到現(xiàn)在的臨床治療效果顯著，ECMO技術(shù)的使用在臨床上發(fā)揮著重要作用［1］。但是相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生機制及干預(yù)措施仍有待進一步研究，因此一個成熟穩(wěn)定的動物模型的建立對ECMO技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用十分重要。

對于ECMO的機制探討及研究已經(jīng)成為時下熱點問題，相關(guān)大動物模型的建立和研究也備受關(guān)注［2-3］。但是傳統(tǒng)的大動物模型人力、物力成本大，不適宜開展大樣本的研究，而大鼠價格低廉，具有與人類相似的心血管系統(tǒng)及大量豐富的基礎(chǔ)研究技術(shù)手段。本課題組在傳統(tǒng)體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)等大鼠模型的建立上經(jīng)驗豐富［4-9］，因此，本研究在對已有的體外生命支持動物模型學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上進一步改良，建立了大鼠外周靜脈-動脈（veno-artery，V-A）ECMO模型，同時就建立過程中的關(guān)鍵問題展開討論。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 本實驗經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（2014-5-30-GZR）。選取成年健康雄性SD大鼠5只，體重350～500 g（由本院動物中心提供）。

1.2 麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備 隨機選取實驗大鼠，于術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。稱重后4%～6%七氟烷誘導(dǎo)麻醉10～15 min后，四肢固定于實驗操作臺。使用16 G特殊用靜脈留置針（Becton Dickinson公司）經(jīng)口氣管插管，隨后連接小動物呼吸機（上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司）進行機械通氣（60%氧氣與40%氮氣的混合氣體作為氣源），2%～3%七氟烷維持麻醉，呼吸頻率設(shè)定為70～80次／min，潮氣量6～8 ml／kg，呼吸機參數(shù)根據(jù)動脈血氣結(jié)果進行調(diào)整。監(jiān)護儀溫度探頭經(jīng)石蠟油潤滑后置入肛門3～5 cm實時監(jiān)測體溫。

1.3 外科準(zhǔn)備 手術(shù)部位備皮、消毒，精細(xì)游離雙側(cè)股動脈并穿刺置管。雙側(cè)股動脈使用22 G一次性使用靜脈留置針（蘇州林華醫(yī)療器械股份有限公司），并經(jīng)左側(cè)股動脈通路給予500 U／kg肝素抗凝，連接監(jiān)護儀（PHILIPS）進行血流動力學(xué)監(jiān)測；右側(cè)股動脈穿刺置管成功后連接ECMO動脈灌注端；精細(xì)游離右側(cè)頸靜脈并外科切開置管送入自置靜脈引流管，尖端至下腔靜脈入右心房水平，隨后連接至ECMO靜脈引流端。以上所有血管遠(yuǎn)端絲線結(jié)扎，近端絲線固定，以防止置管部位出血和插管脫出。

1.4 ECMO管路及設(shè)備 ECMO系統(tǒng)組成（如圖1）包括:蠕動泵（常州普瑞流體技術(shù)有限公司）及配套硅膠軟管，10 ml注射器，特制小動物膜式氧合器（東莞科威醫(yī)療用品公司）。ECMO系統(tǒng)預(yù)充排氣，采用8 ml 6%羥乙基淀粉進行無血預(yù)充。

圖1 大鼠ECMO系統(tǒng)組成

1.5 轉(zhuǎn)流過程 所有血管置管結(jié)束后與ECMO管路動、靜脈端連接，保證管路通暢。尾靜脈取血監(jiān)測活化凝血時間（activated clotting time，ACT），ACT 達400 s以上時開始ECMO運轉(zhuǎn)，根據(jù)引流情況調(diào)整蠕動泵轉(zhuǎn)速及靜脈插管位置，確保注射器液面穩(wěn)定。膜式氧合器以氧氣和氮氣的混合氣體作為氣源，氣流量的大小根據(jù)實際血氣結(jié)果進行調(diào)節(jié)，以維持pH值和二氧化碳分壓（PCO2）等相關(guān)指標(biāo)的穩(wěn)定。實驗中實時監(jiān)測并記錄平均動脈壓及心率，若出現(xiàn)血壓明顯下降，及時調(diào)整流量，必要時給予血管活性藥物維持血壓。ECMO運轉(zhuǎn)時間為2 h，轉(zhuǎn)中流量為10～15 ml／（kg·min）。

1.6 數(shù)據(jù)采集 各實驗動物均于術(shù)前、術(shù)中1 h、2 h三個時間點抽取動脈血氣分析，記錄各時間點血氣數(shù)值，并于術(shù)中實時監(jiān)測記錄平均動脈壓及心率。

1.7 統(tǒng)計處理 應(yīng)用SPSS 23.0軟件處理和統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用正態(tài)分布數(shù)據(jù)的兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

5只大鼠均順利完成實驗并于術(shù)后麻醉狀態(tài)下立即處死。所有實驗大鼠基本資料、血流動力學(xué)指標(biāo)及血氣分析結(jié)果見表1。結(jié)果提示:ECMO開始運轉(zhuǎn)后紅細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）由術(shù)前0.292下降至 0.236；血紅蛋白（hemoglobin，Hb）濃度由術(shù)前 99.4 g／L 下降至 79.6 g／L；K＋濃度由術(shù)前 4.72 mmol／L 上升至 5.38 mmol／L；其他血氣參數(shù)均可維持在正常范圍。ECMO運轉(zhuǎn)時間為2 h，轉(zhuǎn)中流量為10～15 ml／（kg·min）。

表1 基本資料、血流動力學(xué)及血氣分析結(jié)果數(shù)據(jù)（n=5，±s）

表1 基本資料、血流動力學(xué)及血氣分析結(jié)果數(shù)據(jù)（n=5，±s）

注:P值為術(shù)中2 h與術(shù)前的數(shù)據(jù)間的比較；TCO2:二氧化碳結(jié)合力。

參數(shù) 術(shù)前 術(shù)中1 h 術(shù)中2 h P值體重（g） 407±16.43體溫（℃） 35.23±0.32 31.18±0.45 33.87±0.13 0.0125平均動脈壓（mm Hg） 103.25±13.24 87.52±15.46 95.74±12.68 0.0240心率（次／min） 368±21.57 329±25.74 353±23.12 0.0132 pH 7.508±0.57 7.406±0.90 7.367±0.33 0.0060 PCO2（mm Hg） 24.54±5.43 40.06±5.42 40.30±3.82 0.1518 PO2（mm Hg） 109.80±33.01 188.80±85.98 238.80±57.25 0.2256 BE（mmol／L） -3.6±2.9 -1.4±2.6 -1.4±2.3 0.2639 HCO3-（mmol／L） 19.3±3.0 23.5±2.9 24.1±1.8 0.0701 TCO2（mmol／L） 20.0±2.9 26.4±3.7 25.4±1.8 0.0754 SO2（%） 98.4±1.1 99.2±1.1 100.0±0.0 0.0051 Na＋（mmol／L） 136.0±12.1 138.0±3.9 135.8±2.8 0.0005 K＋（mmol／L） 4.72±1.85 4.74±0.63 5.38±0.20 0.0415 Ca2＋（mmol／L） 1.07±0.08 1.46±0.18 1.42±0.10 0.0889 HCT 0.29±0.04 0.24±0.01 0.26±0.01 0.0418 Hb（g／L） 99.4±13.0 79.6±5.4 87.0±3.7 0.0423

3 討 論

ECMO是搶救生命垂危患者的新的體外生命支持技術(shù)，根據(jù)輔助支持臟器的不同可分為V-V ECMO和V-A ECMO，前者主要用于呼吸支持，后者既可以用于呼吸支持，又可以用于心臟支持。當(dāng)患者的心肺功能嚴(yán)重受損時，ECMO技術(shù)的應(yīng)用為患者的生存帶來希望。有研究顯示V-A ECMO可以改善難治性心源性休克或心臟驟?；颊叩纳媛?，但同時其治療過程中的并發(fā)癥也是不可忽視的問題［10］。建立簡單易行的動物模型對ECMO過程中相關(guān)問題進行研究成為時下熱點問題，國內(nèi)外均有關(guān)于ECMO動物模型的報道，但是已發(fā)表的小動物模型并不能完全模擬ECMO的病理生理［11-12］，而傳統(tǒng)大動物模型的科研局限性較大。本課題組前期已成功建立傳統(tǒng)體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)等大鼠模型［4-9］，在模型建立方面積累了豐富經(jīng)驗，本研究在已有動物模型的基礎(chǔ)上，進行一定程度的技術(shù)改進，成功建立大鼠V-A ECMO模型，使ECMO期間血流動力學(xué)及器官損傷等問題的研究成為可能。

3.1 模型建立方法

3.1.1 充足的靜脈引流是ECMO管理的關(guān)鍵問題之一，本實驗采用自制靜脈引流管可以保證良好的靜脈引流量，靜脈引流管軟硬度適中，靜脈內(nèi)不易打折且對血管壁損傷小，并且將靜脈引流管置于右心房水平，保證了充分且穩(wěn)定的引流。

3.1.2 ECMO作為一種密閉的體外循環(huán)系統(tǒng)，在臨床中大量應(yīng)用于心肺功能衰竭患者的治療［13-15］。但是ECMO相關(guān)問題的機制研究并不十分明確，而現(xiàn)存的帶有回流室裝置的動物模型并不能完全模擬ECMO的病理生理過程，本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上進行改進，去除回流室裝置，進一步優(yōu)化系統(tǒng)，使其更加貼近臨床ECMO的過程。去除回流室后的完全密閉的ECMO系統(tǒng)，其系統(tǒng)內(nèi)壓力的監(jiān)測是成功的關(guān)鍵，在動物實驗中由于實驗條件受限，很難實時進行系統(tǒng)內(nèi)壓力監(jiān)測，因此，通過改良管路，在靜脈引流端連接10 ml注射器，注射器內(nèi)用膠體預(yù)充以隔絕空氣，ECMO運行期間通過觀察注射器內(nèi)液面的變化情況來監(jiān)測系統(tǒng)內(nèi)壓力，及時進行調(diào)整，且過程中不會發(fā)生由于靜脈引流管貼壁引起體外循環(huán)管路進氣等狀況。在該實驗中用蠕動泵代替?zhèn)鹘y(tǒng)的滾壓泵，可以更加精細(xì)的進行流量調(diào)節(jié)，且方便操作，進一步減少系統(tǒng)預(yù)充量，達到無血預(yù)充，對大鼠的創(chuàng)傷小，也使得ECMO的過程更加平穩(wěn)，易于管理的同時也大大提高了實驗的成功率。

3.2 實驗結(jié)果分析 所有大鼠均順利完成實驗。表1數(shù)據(jù)顯示ECMO開始運轉(zhuǎn)后實驗大鼠的體溫、平均動脈壓及心率均有明顯下降，考慮原因為V-A ECMO模型并不能完全模擬生理過程，會對大鼠機體帶來一定程度的影響，雖然統(tǒng)計學(xué)意義顯著，但是數(shù)據(jù)的絕對值變化并無明顯臨床意義。表2血氣分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，ECMO的運轉(zhuǎn)以及膜式氧合器的使用為非生理狀態(tài)，因此會對機體酸堿平衡帶來一定程度的影響。由于本實驗采用無血預(yù)充，ECMO運轉(zhuǎn)過程中血液稀釋較為明顯，導(dǎo)致離子濃度、HCT、Hb等指標(biāo)的改變。ECMO運行期間靜脈端注射器液面平穩(wěn)，無明顯下降，提示系統(tǒng)內(nèi)未出現(xiàn)負(fù)壓過大的情況；而鉀離子濃度呈現(xiàn)上升趨勢，考慮與血液破壞有關(guān)，可能是由于該實驗使用的膜式氧合器并未達到臨床ECMO要求的低阻力膜式氧合器的工藝標(biāo)準(zhǔn)，需要進一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝以減少血液破壞。

3.3 實驗存在不足 由于本實驗屬于V-A ECMO大鼠模型的初步探索，因此ECMO運轉(zhuǎn)時間較短，選用的是健康大鼠，與實際臨床應(yīng)用仍存在不同，為更好探索ECMO對臟器帶來的影響，需要進一步延長ECMO運轉(zhuǎn)時間，在大鼠疾病模型上進行ECMO的研究，使得大鼠ECMO期間的病理生理改變更加接近臨床。本實驗采用蠕動泵代替?zhèn)鹘y(tǒng)滾壓泵，流量更加精細(xì)可控，但是與臨床應(yīng)用的離心泵原理不同，膜式氧合器也不能完全達到臨床上的使用標(biāo)準(zhǔn)，因此對系統(tǒng)的進一步改良，使該模型對臨床問題更加具有指導(dǎo)意義是接下來的研究和探索重點所在。

4 結(jié) 論

本實驗在保證充分的引流量和灌注流量的情況下，對原有動物模型進行進一步改良，成功建立了大鼠外周V-A ECMO模型。該動物模型在系統(tǒng)組成方面十分接近ECMO的臨床應(yīng)用，因此尤其適用于V-A ECMO期間血流動力學(xué)相關(guān)研究。該模型操作簡單，成功率高，術(shù)中麻醉深度可控，大鼠生命體征平穩(wěn)，為ECMO期間的病理生理學(xué)研究、臟器損傷研究，以及干預(yù)治療措施的探討奠定基礎(chǔ)。