麻俊勝，茍雅玲，王興潤(rùn)，楊蘇才*，程言君，宋云

1.輕工業(yè)環(huán)境保護(hù)研究所 2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院

多環(huán)芳烴(PAHs)具有致畸、致癌、致突變性[1]。PAHs污染土壤的修復(fù)已成為研究熱點(diǎn)[2- 3]，過氧化氫氧化是其常用的修復(fù)方法之一[4- 6]。但單獨(dú)使用過氧化氫氧化通常需要大量的氧化劑和多次注入才能達(dá)到修復(fù)目標(biāo)[7]，使修復(fù)成本大幅提高；而修復(fù)成本低、二次污染小的微生物修復(fù)技術(shù)也受限于其較長(zhǎng)的修復(fù)周期。為了克服單一修復(fù)技術(shù)的局限性，已研發(fā)出多種基于過氧化氫氧化的微生物修復(fù)技術(shù)[4,8]。化學(xué)氧化處理后土壤中微生物的數(shù)量會(huì)減少，微生物的生長(zhǎng)環(huán)境也會(huì)改變，如土壤有機(jī)質(zhì)減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，pH變化等[3,9]，使后續(xù)的微生物降解變得困難，但化學(xué)氧化后的土壤經(jīng)過一定時(shí)間的好氧培養(yǎng)后微生物數(shù)量能夠得到恢復(fù)[4,9- 10]。如Chen等[9]發(fā)現(xiàn)過氧化氫處理后的土壤，在好氧培養(yǎng)前5 d細(xì)菌數(shù)量不斷減少，但經(jīng)過120 d的培養(yǎng)后細(xì)菌數(shù)量從1.1×104CFU/g(以土壤質(zhì)量計(jì)，全文同)增加到1.0×108CFU/g。有關(guān)化學(xué)氧化與微生物聯(lián)合降解土壤中PAHs的研究得到了廣泛的開展[4,10- 11]，但目前已有的研究多集中于化學(xué)氧化與好氧微生物聯(lián)合降解土壤中的PAHs，與缺氧微生物聯(lián)合降解的應(yīng)用鮮有報(bào)道。這可能是因?yàn)槿毖?厭氧微生物降解PAHs的效率遠(yuǎn)低于好氧降解[12]。據(jù)Rockne等[13]報(bào)道，缺氧/厭氧微生物降解PAHs的速率比好氧降解低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。但深層土壤中PAHs的原位生物修復(fù)往往與缺氧或厭氧條件有關(guān)[14]。由于深層土壤中微生物數(shù)量比表層土壤低1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，且在缺氧條件下微生物的呼吸和代謝速率均比好氧條件下低[15]，因此，化學(xué)氧化后深層土壤中PAHs的缺氧降解難度較大。隨著受污染土壤治理需求的加大，近年來(lái)深層土壤中PAHs的化學(xué)氧化與缺氧微生物聯(lián)合降解的研究越來(lái)越受到關(guān)注。筆者以華北某PAHs污染場(chǎng)地土壤為研究對(duì)象，通過分析缺氧培養(yǎng)前后土壤中微生物數(shù)量及PAHs濃度的變化，考察化學(xué)氧化后土壤中微生物恢復(fù)情況，探討化學(xué)氧化后土壤中PAHs缺氧降解的規(guī)律，并對(duì)其原因進(jìn)行解析，以期為PAHs污染土壤原位修復(fù)提供方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與藥品

試驗(yàn)所用土壤采集自華北某PAHs污染場(chǎng)地地下3～4 m處。土壤樣品過2 mm篩并混合均勻，密封保存于-20 ℃條件下備用。試驗(yàn)所用正己烷和二氯甲烷(均為色譜級(jí))購(gòu)于美國(guó)的J T Baker公司；包含16種PAHs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和包含5種PAHs氘代物的混合內(nèi)標(biāo)液購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司；過氧化氫購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鈉購(gòu)自北京化工廠，在450 ℃烘烤6 h后用作干燥劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1土壤化學(xué)氧化處理

將100 g土壤樣品和150 mL濃度為10%的過氧化氫先后加入1 L燒杯中，用磁力攪拌器攪拌4 h進(jìn)行氧化。攪拌結(jié)束后靜置4 h，再將燒杯中泥漿進(jìn)行抽濾分離，得到氧化后的土壤樣品(oxidized soil，OS)。將OS分成兩部分，一部分密封保存于-20 ℃條件下備用，另一部分用于接種微生物。

1.2.2氧化后土壤接種微生物

參照文獻(xiàn)[16]的方法，在100 g OS中添加10 g未氧化的土壤(untreated soil，US)，用磁力攪拌器攪拌2 h。攪拌結(jié)束后靜置4 h，再將燒杯中泥漿進(jìn)行抽濾分離，得到氧化后接種的土壤(inoculated soil，IS)，密封保存于-20 ℃條件下備用。

1.2.3土壤缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)

選擇配有聚四氟乙烯襯里的丁基橡膠塞和鋁制密封蓋的50 mL血清瓶進(jìn)行缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)。所有培養(yǎng)試驗(yàn)的操作均在充滿氮?dú)獾娜毖跏痔紫渲型瓿?。采用IS和OS 2種土壤進(jìn)行缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)。每種土壤均設(shè)置以下4個(gè)處理：1)僅添加去離子水作為對(duì)照處理(CK)；2)僅添加營(yíng)養(yǎng)鹽(CY)；3)僅添加2 000 mg/kg硫酸鹽作為電子受體(CS)；4)添加營(yíng)養(yǎng)鹽和2 000 mg/kg硫酸鹽(YS)。每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，在每個(gè)血清瓶中裝入30 g土壤樣品，并添加7 mL硫酸鹽、營(yíng)養(yǎng)鹽或去離子水，使土壤含水率超過100%土壤持水能力。其中，營(yíng)養(yǎng)鹽配制：K2HPO4,1 g/L；KH2PO4,1 g/L；NH4Cl, 1 g/L；CaCl2,0.02 g/L；MgCl2,0.2 g/L；FeCl3,0.05 g/L。密封完成的血清瓶轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中恒溫30 ℃避光培養(yǎng)。每個(gè)處理分別在第0天和第180天隨機(jī)抽取3個(gè)樣品進(jìn)行土壤中微生物和PAHs測(cè)試。

1.3 分析與檢測(cè)方法

1.3.1PAHs提取及檢測(cè)

土壤樣品中PAHs提取和測(cè)試方法參照文獻(xiàn)[17]。取2 g冷凍干燥后的土壤放入40 mL聚四氟乙烯離心管中，分別加入正己烷和二氯甲烷各15 mL，利用超聲清洗機(jī)萃取土壤中PAHs。超聲萃取土壤中PAHs回收率試驗(yàn)結(jié)果：除了萘的回收率為56.9%外，其他15種PAHs的回收率為86.3%～112.6%。測(cè)試所用氣相色譜- 質(zhì)譜儀為安捷倫7890B- 5977A型，儀器狀態(tài)：載氣為高純氦氣；進(jìn)樣口溫度為290 ℃，分流進(jìn)樣，分流比為10∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL；起始溫度為40 ℃，進(jìn)樣后保持2 min，隨后以10 ℃/min升至240 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至320 ℃，保持10 min。

1.3.2DNA提取與微生物數(shù)量分析

土壤DNA用Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories，USA)試劑盒提取，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。以16S rDNA基因作為靶基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因拷貝數(shù)(N)，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[17],細(xì)菌數(shù)量以lgN計(jì)。

1.3.3理化性質(zhì)檢測(cè)

土壤總有機(jī)碳、總氮、速效磷、速效鉀、硝酸鹽氮、氨氮濃度與pH檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)氧化對(duì)土壤中PAHs濃度、理化性質(zhì)和微生物數(shù)量的影響

2.1.1PAHs濃度

化學(xué)氧化前后土壤中PAHs濃度變化如表1所示。由表1可知，化學(xué)氧化后，土壤中16種PAHs均發(fā)生了明顯的降解，降解率為33.3%～95.9%。這可能是因?yàn)檫^氧化氫強(qiáng)烈的氧化性能夠非選擇性地破壞土壤中有機(jī)物[19]。過氧化氫分解過程中產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)能將大分子的有機(jī)污染物分解為小分子有機(jī)物，最終氧化為二氧化碳和水，總化學(xué)反應(yīng)方程式：有機(jī)污染物+·OH→CO2+H2O[20]。2環(huán)和3環(huán)PAHs降解率較高，而4環(huán)、5環(huán)和6環(huán)PAHs的降解率則相對(duì)較低，這與Jonsson等[2]報(bào)道的Fenton氧化后2環(huán)和3環(huán)PAHs的降解率分別為89%和59%，而4環(huán)、5環(huán)和6環(huán)PAHs降解率低于38%研究結(jié)果一致。其他學(xué)者也有類似報(bào)道[21]。表明低分子量的2環(huán)和3環(huán)PAHs比高分子量的4環(huán)、5環(huán)和6環(huán)PAHs更易降解。

表1 化學(xué)氧化前后、氧化后接種土壤中16種PAHs濃度

2.1.2理化性質(zhì)

化學(xué)氧化前后土壤理化指標(biāo)變化見表2。由表2可知，化學(xué)氧化后土壤理化性質(zhì)發(fā)生了較大改變。土壤中總有機(jī)碳濃度從初始值5.04 g/kg下降至2.15 g/kg；土壤中氨氮和速效磷濃度有所上升，但是總氮、硝酸鹽氮和速效鉀濃度下降較多。這可能是由于過氧化氫氧化過程中產(chǎn)生的·OH在氧化污染物的同時(shí)非選擇性地破壞了土壤有機(jī)組分(有機(jī)碳、有機(jī)氮等)。Sutton等[19,22]報(bào)道化學(xué)氧化可以非選擇性地破壞土壤中大部分有機(jī)物，且氧化過程會(huì)導(dǎo)致土壤中的碳、氮向水溶液中釋放。

表2 化學(xué)氧化前后土壤理化指標(biāo)變化

注：pH為無(wú)量綱。

2.1.3微生物數(shù)量

化學(xué)氧化前后土壤中細(xì)菌數(shù)量見圖1。由圖1可知，化學(xué)氧化前土壤中細(xì)菌數(shù)量的lgN為8.8，化學(xué)氧化后減至5.3，表明過氧化氫氧化在降解PAHs的同時(shí)也對(duì)土壤中微生物產(chǎn)生了不利影響。這與已有研究的報(bào)道類似，如Lu等[11]發(fā)現(xiàn)類Fenton氧化后土壤中細(xì)菌數(shù)量從3.45×106CFU/g下降至4.21×103CFU/g，Gong[23]報(bào)道Fenton處理后土壤中細(xì)菌數(shù)量從1.38×108CFU/g下降至1.62×106CFU/g。除過氧化氫外，向土壤中施用其他氧化藥劑(如過硫酸鹽、臭氧和Fenton試劑)后，土壤中細(xì)菌數(shù)量也會(huì)下降[24- 26]。

注：圖上字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)；字母相同表示處理間差異不顯著(P>0.05)。圖1 US、IS、OS及IS、OS不同處理的土壤樣品中細(xì)菌數(shù)量Fig.1 Number of bacterial in the soil of US, IS, OS, and different treatments of IS and OS

2.2 化學(xué)氧化后缺氧培養(yǎng)對(duì)土壤中微生物數(shù)量的影響

化學(xué)氧化后IS和OS及其不同處理的細(xì)菌數(shù)量見圖1。由圖1可知，IS、OS細(xì)菌數(shù)量的lgN分別為7.5和5.3，經(jīng)過180 d的缺氧培養(yǎng)，不同處理的細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。IS和OS的CK、CS中細(xì)菌數(shù)量沒有明顯增加，但是CY中細(xì)菌數(shù)量明顯增加。可見，添加營(yíng)養(yǎng)鹽或接種微生物都可以增加微生物數(shù)量，添加營(yíng)養(yǎng)鹽后，IS、OS中微生物數(shù)量都能明顯增加。此外，YS中微生物數(shù)量增長(zhǎng)最多，其細(xì)菌數(shù)量的lgN也較高，IS、OS的YS處理分別為8.9和6.5。特別是IS的YS處理，其細(xì)菌數(shù)量甚至可以恢復(fù)到比氧化前土壤更高的水平。結(jié)合表2可知，化學(xué)氧化導(dǎo)致土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)明顯減少，因此在后續(xù)缺氧培養(yǎng)過程中提供微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是必要的。

可見，在缺氧條件下，盡管微生物恢復(fù)相比于好氧條件需要更長(zhǎng)時(shí)間，但如果能夠提供適宜的條件，如添加營(yíng)養(yǎng)鹽和電子受體等，化學(xué)氧化后土壤中微生物數(shù)量在缺氧條件下也能得到較好恢復(fù)。

2.3 化學(xué)氧化后缺氧培養(yǎng)對(duì)土壤中14種PAHs降解的影響

2.3.114種PAHs降解情況

注：圖上字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)；字母相同表示處理間差異不顯著(P>0.05)。圖2 IS、OS不同處理培養(yǎng)180 d后土壤中3環(huán)PAHs保留率Fig.2 Percentages of 3- rings PAHs remaining in soil after 180 days by different treatments of IS and OS

注：圖上字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)；字母相同表示處理間差異不顯著(P>0.05)。圖3 IS、OS不同處理培養(yǎng)180 d后土壤中4環(huán)PAHs保留率Fig.3 Percentages of 4- rings PAHs remaining in soil after 180 days by different treatments of IS and OS

注：圖上字母相同表示處理間差異不顯著(P>0.05)。圖4 IS、OS不同處理培養(yǎng)180 d后土壤中5環(huán)和6環(huán)PAHs保留率Fig.4 Percentages of 5- and 6- rings PAHs remaining in soil after 180 days by different treatments of IS and OS

化學(xué)氧化后，土壤中萘和苊烯的濃度非常低(表1)，故后續(xù)的缺氧培養(yǎng)試驗(yàn)中不再考察這2種PAHs的降解情況。其余14種PAHs的降解情況如圖2～圖4所示。由圖2～圖4可知，CK中14種PAHs均沒有發(fā)生明顯的降解。這表明化學(xué)氧化后，若不采取任何措施增加微生物數(shù)量或提供電子受體等，土壤中的PAHs在較短的時(shí)間內(nèi)(如180 d)很難缺氧降解。IS、OS分別單獨(dú)施用營(yíng)養(yǎng)鹽或電子受體對(duì)14種PAHs僅起到較弱的降解作用。

2.3.2原因解析

由2.3.1節(jié)可知，單獨(dú)施用硫酸鹽電子受體或營(yíng)養(yǎng)鹽不能促進(jìn)PAHs的降解，但同時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)鹽和電子受體能促進(jìn)PAHs的降解。在同時(shí)添加電子受體和營(yíng)養(yǎng)鹽時(shí)，接種微生物的處理中3環(huán)和部分4環(huán)PAHs(熒蒽和芘)的降解率普遍高于未接種微生物的處理。這可能是因?yàn)槲⑸?、營(yíng)養(yǎng)鹽和電子受體都是PAHs微生物降解過程中不可缺少的因素[27- 28]。在缺氧條件下，電子受體是微生物降解PAHs所必需的[1,27]，但由于土壤中電子受體數(shù)量往往不能滿足微生物的需求，需要在土壤中添加更多的電子受體來(lái)提高微生物降解PAHs的效率[17,29]。由于化學(xué)氧化后土壤中微生物(圖1)和營(yíng)養(yǎng)鹽(表2)都明顯減少，氧化后接種土壤中的lgN比未接種土壤中高2.4(圖1)，而微生物數(shù)量是PAHs降解過程中的關(guān)鍵因素。因此，化學(xué)氧化后土壤中PAHs若要在缺氧條件下降解，接種一定數(shù)量的微生物是必要措施。

由2.3.1節(jié)可知，接種微生物、添加營(yíng)養(yǎng)鹽和電子受體均不能促進(jìn)4環(huán)(除了熒蒽和芘)、5環(huán)和6環(huán)PAHs的降解，可能是這些PAHs自身的物理化學(xué)性質(zhì)(高分子量、低水溶性、高辛醇- 水分配系數(shù)和復(fù)雜的苯環(huán)排列方式)所致[30]。此外，PAHs通常會(huì)吸附在土壤有機(jī)碳或礦物質(zhì)表面導(dǎo)致其生物可利用性降低，而土壤中PAHs較低的生物可利用性是其降解緩慢的主要原因之一[5]。在缺氧條件下，微生物對(duì)不同PAHs降解的難易程度不同，其降解途徑也存在較大差別。對(duì)于萘、芴、菲等小分子PAHs，缺氧微生物可以直接對(duì)其進(jìn)行降解，而對(duì)于高環(huán)PAHs，缺氧微生物往往需要以共代謝的方式對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化[31]。近年來(lái)，研究者對(duì)萘、菲等低環(huán)PAHs的缺氧微生物降解途徑有了較清楚的了解，而對(duì)于4環(huán)及4環(huán)以上PAHs的降解途徑研究較少。缺氧微生物對(duì)萘的降解根據(jù)起始反應(yīng)差異分為羧基化和甲基化2種途徑[31]。然而，近期的研究發(fā)現(xiàn)萘的降解途徑只有羧基化[32]。Davidova等[33]研究發(fā)現(xiàn)，菲的缺氧降解途徑可能與萘的缺氧降解途徑相似。

2.4 化學(xué)氧化后缺氧培養(yǎng)對(duì)PAHs的降解效果

圖5 IS、OS不同處理時(shí)化學(xué)氧化和缺氧微生物對(duì)PAHs的降解貢獻(xiàn)率Fig.5 Removal efficiency of total PAHs by chemical oxidation and anoxic biodegradation in different treatments of IS and OS

IS和OS不同處理時(shí)化學(xué)氧化和缺氧微生物對(duì)土壤中PAHs降解貢獻(xiàn)率如圖5所示。由圖5可知，化學(xué)氧化降解了大約50%的PAHs，經(jīng)過180 d缺氧培養(yǎng)后，PAHs降解率進(jìn)一步提高。其中，IS在YS的強(qiáng)化處理時(shí)，對(duì)PAHs的降解率在化學(xué)氧化的基礎(chǔ)上提高了15%左右。IS在YS處理時(shí)化學(xué)氧化和缺氧微生物對(duì)14種PAHs的降解貢獻(xiàn)率見圖6所示。由圖6可知，3環(huán)PAHs表現(xiàn)出明顯的微生物降解，其降解貢獻(xiàn)率為12.8%～19.7%；4環(huán)PAHs芘的微生物降解貢獻(xiàn)率也較高，大于20%；但5環(huán)和6環(huán)PAHs未能發(fā)生明顯的微生物降解，其降解貢獻(xiàn)率小于6.2%?？梢姡瘜W(xué)氧化與缺氧微生物聯(lián)合降解用于修復(fù)PAHs污染土壤是可行的。

圖6 IS的YS處理時(shí)化學(xué)氧化和缺氧微生物對(duì)14種PAHs的降解貢獻(xiàn)率Fig.6 Removal efficiency of 14 PAHs by chemical oxidation and anoxic biodegradation in YS treatments of IS

3 結(jié)論

(1)過氧化氫氧化對(duì)土壤中16種PAHs均表現(xiàn)出較好的去除效果，但同時(shí)也造成土壤中有機(jī)碳、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和微生物數(shù)量減少。對(duì)過氧化氫氧化后的土壤采取一定的措施(添加營(yíng)養(yǎng)鹽和電子受體/接種微生物)且缺氧培養(yǎng)180 d后，土壤中微生物數(shù)量可以得到較好的恢復(fù)。

(2)過氧化氫氧化后的土壤缺氧培養(yǎng)180 d后，單獨(dú)添加電子受體或營(yíng)養(yǎng)鹽未能明顯提高PAHs的降解率，但同時(shí)添加電子受體和營(yíng)養(yǎng)鹽能夠促進(jìn)PAHs的微生物降解。

(3)添加電子受體和營(yíng)養(yǎng)鹽后，接種微生物的處理中3環(huán)和部分4環(huán)(熒蒽和芘)PAHs可以發(fā)生明顯的降解，且其降解率明顯高于未接種微生物的處理?；瘜W(xué)氧化與缺氧微生物聯(lián)合降解土壤中PAHs是可行的。