韓遠(yuǎn)豪 杜亞格 竇昊穎 王曉玲 汪濤

白血病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤和骨髓增生異常綜合征等惡性血液病具有發(fā)病率高、治療難度大和預(yù)后較差等特點(diǎn)，一直威脅著人類的生命和健康[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，臨床上對(duì)于惡性血液病的治療主要以化學(xué)治療、激素治療、免疫抑制劑治療以及使用富含造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的骨髓移植等為主要治療手段。但化療藥物、免疫抑制劑等緩解疾病發(fā)展的同時(shí)也會(huì)造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如嘔吐、毛發(fā)脫落、食欲缺乏、手腳麻木、免疫力降低等。骨髓移植作為根治惡性血液病的唯一方法，尋找與患者配型相同的骨髓費(fèi)時(shí)費(fèi)力，花費(fèi)昂貴，且其中所含干細(xì)胞數(shù)量有限，大大限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用，成為血液病治療中的難題。肌源性干細(xì)胞(MDSCs)是一種來(lái)源于骨骼肌中具有自我更新、多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在無(wú)誘導(dǎo)因素作用下可定向分化為骨骼肌細(xì)胞，在特定條件下不僅能分化為中胚層細(xì)胞類型，如成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血譜系，還可以打破胚層的限制分化為外胚層和內(nèi)胚層的細(xì)胞類型[2,3]。研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs能夠表達(dá)HSCs的標(biāo)志物Sca-1和CD34，在造血微環(huán)境下可以促進(jìn)造血重建，通過移植到小鼠內(nèi)產(chǎn)生的造血活性要強(qiáng)于骨髓移植，且MDSCs系自體來(lái)源，具有取材容易、利于體外培養(yǎng)擴(kuò)增、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，因此將成為重建造血最有希望的種子細(xì)胞來(lái)源之一[4-6]。本文將對(duì)近年來(lái)課題組關(guān)于MDSCs造血分化過程中機(jī)制的研究現(xiàn)狀、存在的問題以及應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 MDSCs的概述

1.1 MDSCs的分離 MDSCs可來(lái)源于骨骼肌、心肌和平滑肌[7]。但目前文獻(xiàn)中報(bào)道較多的方法均采用來(lái)自骨骼肌的組織進(jìn)行分離培養(yǎng)。從解剖學(xué)的角度來(lái)看，肌肉中存在兩種類型的干細(xì)胞，其中位于肌纖維基板和質(zhì)膜之間的是衛(wèi)星細(xì)胞(也稱為肌肉干細(xì)胞)，可以與受損的肌原纖維融合，再生肌纖維。另一種細(xì)胞是MDSCs，它不位于衛(wèi)星細(xì)胞壁龕中，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以定向分化為不同的細(xì)胞譜系[8,9]。這在其他研究中也得到了證實(shí)，例如，Jackson等[10]在1999年從小鼠的骨骼肌中分離出一種干細(xì)胞，它與衛(wèi)星細(xì)胞明顯不同且表達(dá)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)的表面標(biāo)志Sca-1和c-Kit，通過將培養(yǎng)的干細(xì)胞移植入受致死劑量輻照的受者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的造血活性是整個(gè)骨髓的10～14倍，具有強(qiáng)大的造血分化能力，這說明衛(wèi)星細(xì)胞與MDSCs是兩種不同的細(xì)胞。

目前大多數(shù)獲取MDSCs的方法都涉及肌肉活檢。例如利用小鼠的骨骼肌分離MDSCs，取4～5日齡的乳鼠，分離骨骼肌，剔除脂肪、筋膜、神經(jīng)和血管等，通過機(jī)械剪切方式將骨骼肌剪碎，后采用膠原酶和胰蛋白酶等分步消化，可使80%～90%的MDSCs從肌肉組織的不同解剖位置釋放出來(lái)[11-13]。但是，在使用酶消化法分離MDSCs時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格掌握酶消化的時(shí)間，消化時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致MDSCs的過度消化，影響其生長(zhǎng)狀態(tài)，若消化時(shí)間過短，則無(wú)法充分分解蛋白，會(huì)使獲得的MDSCs數(shù)量減少[14]。酶消化法的另一個(gè)缺點(diǎn)是對(duì)組織有較大的破壞性，會(huì)影響細(xì)胞的增殖與分化活性[7]。文獻(xiàn)表明，目前最常用于分離MDSCs的方法是preplate技術(shù)[15]，但是此方法在應(yīng)用過程中較復(fù)雜和耗時(shí)。因此，Xu等[16]對(duì)preplate技術(shù)進(jìn)行了改良，以開發(fā)一種更有效的獲取和培養(yǎng)MDSCs的方法。在結(jié)合了多步酶消化法和preplate技術(shù)的基礎(chǔ)上，還改良了培養(yǎng)基和培養(yǎng)器具，結(jié)果顯示，改良方法可顯著縮短MDSCs的分離過程，是一種快速、有效的從小鼠骨骼肌中分離和純化MDSCs的方法。

1.2 MDSCs的純化 由于肌肉組織中含有的MDSCs較少，酶消化法分離獲得的MDSCs中?；煊醒軆?nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，并非單純的MDSCs，因此，建立一種高效的MDSCs純化方法尤為必要，也是當(dāng)前研究中需要克服的難題之一。目前MDSCs的純化方法包括差速貼壁法，密度梯度離心法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠法。流式細(xì)胞術(shù)雖然能獲得高純度的MDSCs，但因其實(shí)驗(yàn)要求過高，且成本昂貴，因此并不作為首選方法。目前最常用的方法是根據(jù)MDSCs的物理特性，即差速貼壁法進(jìn)行MDSCs純化[7]。

差速貼壁法的原理是，非MDSCs成分貼壁能力較MDSCs強(qiáng)，貼壁時(shí)間較短。利用此特點(diǎn)通過預(yù)貼壁和轉(zhuǎn)瓶換液的方式將未貼壁的MDSCs細(xì)胞懸液移至新瓶，重復(fù)操作即可完成MDSCs的純化。此方法的優(yōu)勢(shì)是獲得細(xì)胞的純度可高達(dá)90%，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小，缺點(diǎn)是操作步驟較繁瑣，細(xì)胞污染的概率增加[2]。丁維進(jìn)等[17]利用改良的差速貼壁法從3～5日齡的C57小鼠骨骼肌中分離純化得到了高純度的MDSCs，且MDSCs可以保持較好的細(xì)胞形態(tài)的增殖能力，這表明差速貼壁法是一種高效的MDSCs純化技術(shù)。

較為理想的純化方法是根據(jù)細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物進(jìn)行篩選。磁珠分選法是近年來(lái)新興起的一種細(xì)胞篩選技術(shù)，應(yīng)用抗原-抗體反應(yīng)的原理對(duì)具有特定標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分選，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，獲得目標(biāo)細(xì)胞純度高且不會(huì)破壞細(xì)胞活力。但目前尚未發(fā)現(xiàn)MDSCs的特異性標(biāo)志物，HSCs標(biāo)志物Sca-1是目前公認(rèn)的MDSCs標(biāo)志物[18,19]。本課題組劉志強(qiáng)等[20]利用磁珠篩選法獲得純度超過90%的Sca-1+MDSCs，且保持了一定的細(xì)胞活力。不足的是，篩選后獲得的細(xì)胞數(shù)量，可能是在實(shí)驗(yàn)過程中損失了部分細(xì)胞。因此，在今后的研究中，不斷完善MDSCs的純化過程，提高純化效率依然是我們科研工作者的重要任務(wù)。

1.3 MDSCs與HSCs的關(guān)系 MDSCs與HSCs有著密切的關(guān)系，在細(xì)胞來(lái)源、增殖分化以及蛋白表達(dá)方面有著異同點(diǎn)。二者同屬于干細(xì)胞范疇，具有干細(xì)胞自我更新、高度增殖、多向分化的潛能。MDSCs主要存在于骨骼肌組織，但也可從平滑肌中分離獲取。HSCs是各類血細(xì)胞的始祖細(xì)胞，存在于骨髓之中。當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，其中一部分分化為成熟血細(xì)胞，另一部分進(jìn)行分裂增殖，以維持HSCs的數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，維系著造血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡[21]。而MDSCs與HSCs的增殖分化方式有著相似之處，經(jīng)激活之后其中一個(gè)子細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞，另一個(gè)則通過復(fù)制形成新的MDSCs[22]。此外，在目前的研究中，二者共同表達(dá)的蛋白包括CD34，CD45，Sca-1等，不同的是，HSCs表達(dá)c-kit、Try1、Ly6G、CD3、CD4、CD5等成熟造血細(xì)胞標(biāo)志物，而MDSCs則表達(dá)desmin、MyoD等肌源性標(biāo)志物[23]。因此，明確MDSCs與HSCs之間存在的關(guān)聯(lián)對(duì)于今后的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

2 MDSCs的造血分化

2.1 造血微環(huán)境在造血過程中的重要作用 造血微環(huán)境又稱為造血細(xì)胞龕(niche)，根據(jù)位置和功能的不同將其分為兩大類，即骨內(nèi)膜微環(huán)境和血管微環(huán)境。造血微環(huán)境主要是由骨髓中鄰近HSCs的支持細(xì)胞構(gòu)成，包括成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、CAR細(xì)胞、nestin+細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和施萬(wàn)細(xì)胞等[24]。這些細(xì)胞對(duì)維持HSCs的自我更新及增殖分化起著關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)，造血微環(huán)境中的多種骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)在正常生理狀態(tài)下主要通過分泌細(xì)胞因子、白介素或其他活性物質(zhì)等調(diào)控造血干/祖細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育，例如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)[25]。Ding等[26]利用基因敲除技術(shù)在各BMSCs中特異性敲除SCF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除內(nèi)皮細(xì)胞中SCF時(shí)骨髓內(nèi)HSCs數(shù)量下降明顯，不僅證明了SCF對(duì)HSCs增殖分化的重要性，同時(shí)也提供了內(nèi)皮細(xì)胞作為SCF主要來(lái)源的證據(jù)。此外，趨化因子12(CXCL12)是也造血過程中一種必不可少的細(xì)胞因子，而富含CXCL12的網(wǎng)狀細(xì)胞(CXCL12 abundant reticular cell，CAR細(xì)胞)則是構(gòu)成造血細(xì)胞龕的重要組成細(xì)胞，在整個(gè)造血活動(dòng)中扮演著重要角色[27]。

此外，造血微環(huán)境中還存在著多種信號(hào)通路，如Wnt信號(hào)通路，Notch信號(hào)通路，BMP/TGF-β信號(hào)通路以及JAK2-STAT5信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路與BMSCs共同參與HSCs的自我更新和定向分化，維持造血微環(huán)境的穩(wěn)定。一旦造血微環(huán)境紊亂，就會(huì)引發(fā)諸如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征甚至是白血病等惡性血液病[28]，因此，造血微環(huán)境的穩(wěn)定對(duì)HSCs的增殖分化至關(guān)重要，明確造血微環(huán)境的細(xì)胞組成和分子機(jī)制對(duì)于了解血液病發(fā)病機(jī)制和臨床治療有重要意義。

2.2 BMSCs對(duì)MDSCs的造血分化的誘導(dǎo)作用 成骨細(xì)胞是構(gòu)成骨內(nèi)膜微環(huán)境的主要組成細(xì)胞。Calvi等[29]應(yīng)用甲狀旁腺激素相關(guān)肽(parathyroid hormone related peptide，PTHrP)刺激經(jīng)基因改造產(chǎn)生成骨細(xì)胞特異性活化的PTH/PTHrP受體(PPRs)4的小鼠，結(jié)果顯示成骨細(xì)胞的數(shù)目增加，而HSCs的數(shù)目也隨之增加。Galán-Díez等[30]發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞已成為HSCs增殖的有效調(diào)節(jié)細(xì)胞，既可以調(diào)節(jié)HSCs的募集，又可根據(jù)其分化階段，沿著淋巴系、髓系和紅細(xì)胞系增殖分化。此外，成熟成骨細(xì)胞突變還可誘發(fā)髓系惡性腫瘤。表明了成骨細(xì)胞對(duì)HSCs具有一定的調(diào)節(jié)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞是血管微環(huán)境的主要組成細(xì)胞。張瀅等[31]通過輸注內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)聯(lián)合小鼠異基因骨髓移植(allo-BMT)，觀察經(jīng)60Co照射后小鼠骨髓內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的修復(fù)情況,并進(jìn)一步觀察其對(duì)造血重建的影響。免疫組化及血液指標(biāo)檢測(cè)的結(jié)果表明，EPC輸注聯(lián)合allo-BMT組骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)及造血功能的恢復(fù)情況要好于單獨(dú)移植組，表明了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持造血微環(huán)境的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用。

而MDSCs在造血分化過程中同樣受到BMSCs的影響。本課題組王曉玲等[32]通過模擬體外造血微環(huán)境，探討經(jīng)典藥方當(dāng)歸補(bǔ)血湯于造血微環(huán)境中對(duì)MDSCs造血分化的影響，首先將培養(yǎng)3 d的MDSCs進(jìn)行當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清和經(jīng)當(dāng)歸補(bǔ)血湯干預(yù)后的BMSCs條件培養(yǎng)基干預(yù)，然后鑒定肌源性的標(biāo)志蛋白desmin，并進(jìn)行抗CD45的免疫組化染色與圖像分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)原始的MDSCs其CD45表達(dá)的量要多，而隨著細(xì)胞分化成熟，desmin表達(dá)的量增多，CD45表達(dá)的量開始減少，呈下降趨勢(shì)。并且以含當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清和BMSCs的培養(yǎng)基培養(yǎng)的MDSCs，CD45表達(dá)量要高于正常血清組及單純載藥血清干預(yù)組。而CD45是目前造血細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、活化及凋亡過程中起重要調(diào)控作用且具有相對(duì)特異性的造血細(xì)胞標(biāo)志物，這表明BMSCs對(duì)MDSCs的造血分化起促進(jìn)作用，且在中藥干預(yù)下，隨劑量的增加MDSCs向造血分化的現(xiàn)象更加明顯。此外，課題組劉志強(qiáng)等[33]為探究BMSCs對(duì)MDSCs體外造血分化的影響，利用混合酶消化聯(lián)合磁珠分選法分離出更加純化的MDSCs，通過Transwell小室將BMSCs和MDSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，模擬造血微環(huán)境，并通過Western Blot方法檢測(cè)造血細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45的表達(dá)含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示共培養(yǎng)體系中MDSCs的CD34和CD45表達(dá)量要明顯高于MDSCs單獨(dú)培養(yǎng)組。另外，當(dāng)MDSCs單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞呈梭形和紡錘形，并逐漸融合，形成多核肌管。而共培養(yǎng)組除少量貼壁細(xì)胞呈梭形或菱形外，還出現(xiàn)大量懸浮的小圓型細(xì)胞，表現(xiàn)出克隆性生長(zhǎng)的特點(diǎn)。這表明MDSCs在無(wú)誘導(dǎo)條件下易向成肌方向分化。而在造血微環(huán)境中，MDSCs表現(xiàn)出造血特性，從而說明了BMSCs對(duì)MDSCs的造血分化具有誘導(dǎo)作用，但其中的具體機(jī)制尚未明顯，仍需要在今后的實(shí)驗(yàn)中不斷探索。

2.3 信號(hào)通路對(duì)MDSCs造血分化的調(diào)控作用 在醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)日益發(fā)達(dá)的今天，對(duì)各類疾病發(fā)生發(fā)展的過程及臨床診療過程中存在的機(jī)制研究已經(jīng)成為眾多醫(yī)學(xué)科研工作者研究的方向，其中信號(hào)通路的研究則是當(dāng)下的熱門。而HSCs的生長(zhǎng)發(fā)育、自我更新及分化過程不僅需要造血微環(huán)境中BMSCs和細(xì)胞因子的干預(yù)，還需要依靠多種信號(hào)通路的調(diào)控作用以達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

研究表明，Notch信號(hào)通路在HSCs中高度活化，而分化之后如在成熟的血細(xì)胞和外周淋巴器官中很少被檢測(cè)到，并且在骨髓和外周血中也檢測(cè)到Notch信號(hào)通路的活性在造血分化時(shí)下調(diào)。此外，當(dāng)阻斷Notch信號(hào)時(shí)可以發(fā)現(xiàn)體外HSCs分化加速且體內(nèi)的干細(xì)胞數(shù)量減少[34]。Wnt信號(hào)通路中經(jīng)典的Wnt3a/β-catenin的激活有利于保持HSCs的活性、自我更新與增殖分化能力；而如果抑制非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的Wnt5a，則可通過進(jìn)一步抑制細(xì)胞內(nèi)Cdc42等其他分子的活性蛋白活化等，并間接激活經(jīng)典的Wnt3a/β-catenin，共同減緩HSCs的衰老，維持其年輕態(tài)[35]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)通路由一類可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的多肽生長(zhǎng)因子亞家族組成，這些家族成員的結(jié)構(gòu)、功能具有一定的相關(guān)性，主要包括TGF-β、激活素、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)等。在造血方面，TGF-β具有重要的負(fù)性調(diào)控作用，尤其是維持HSCs的靜息和自我更新，一旦TGF-β表達(dá)及受體水平缺陷都可以導(dǎo)致造血細(xì)胞的惡性增殖，從而引發(fā)惡性血液腫瘤[36]。劉俊志等[37]發(fā)現(xiàn)激活Janus激酶2-信號(hào)傳導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子5(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK2-STAT5)信號(hào)通路可以促進(jìn)造血生長(zhǎng)因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)等的表達(dá)，從而促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖和分化，證明了JAK2-STAT5 信號(hào)通路在造血過程中也發(fā)揮了重要作用。

此外，Hedgehog、Tie2/Ang-1等信號(hào)通路也是維持HSCs正常發(fā)育和分化的重要調(diào)控因子?？傊谠煅h(huán)境中存在著大量的信號(hào)通路，他們共同維系著HSCs的穩(wěn)定。而在過去幾年的研究中，本課題組主要對(duì)MDSCs造血分化過程中Wnt和Notch兩條信號(hào)通路的調(diào)控作用進(jìn)行了初步研究。

2.3.1 Notch信號(hào)通路:Notch信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，影響著細(xì)胞正常形態(tài)發(fā)生的多個(gè)過程。它是一種膜蛋白受體，由Notch受體、Notch配體(DSL蛋白)及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子(CSL-DNA結(jié)合蛋白)三部分組成。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要有Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4 五種配體，Notch1～Notch4四種受體以及CBF1/RBP-Jκ轉(zhuǎn)錄因子。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過連續(xù)水解，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合,形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而激活HES等基因表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。早在20世紀(jì)90年代，Notch信號(hào)通路的受體就在造血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，且在調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中扮演著重要的角色[38]。當(dāng)Notch信號(hào)通路被阻斷時(shí)，HSCs的分化率升高，從而影響了HSCs的未分化狀態(tài)，提示活化Notch信號(hào)通路能抑制HSCs分化，維持其多向分化的潛能性，并進(jìn)一步促進(jìn)其增殖[39]。宋波等[40]運(yùn)用Notch信號(hào)通路阻斷劑DAPT阻斷其激活，發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESCs)易于分化為造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞(HSCs/HPCs)，且當(dāng)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)協(xié)同使用時(shí)，該現(xiàn)象更加明顯，證明了Notch信號(hào)通路在VEGF促ESCs分化為HSCs/HPCs中起抑制作用。

MDSCs在造血分化過程中同樣受到Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用。本課題組竇昊穎等[11-13]以不同劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，又通過尾靜脈注射的方式將MDSCs移植到受致死劑量照射的動(dòng)物模型中，研究在小鼠造血重建過程中Notch信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)情況，以及當(dāng)歸補(bǔ)血湯和MDSCs對(duì)造血重建的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠的骨髓細(xì)胞中，Notch2、Notch3和 Notch4受體與Delta4配體受體在MDSCs向造血方向分化、增殖的過程中發(fā)揮著不同作用。其中，MDSCs 移植鼠骨髓中Notch2、Notch4和Delta4的mRNA的表達(dá)增加，Notch3的mRNA的表達(dá)減少。當(dāng)加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯時(shí)，可以促進(jìn)Notch2、Notch3和Delta4的表達(dá)，但對(duì)Notch4的作用不顯著。而Jagged2配體和Hes3靶基因既不參與HSCs向造血前體細(xì)胞分化過程，也不參與MDSCs向HSCs增殖、分化過程。而結(jié)果還表明，使用5倍劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯協(xié)同MDSCs對(duì)造血重建的恢復(fù)效果最佳。此外，脾臟B淋巴細(xì)胞是由HSCs分化而來(lái)。他們發(fā)現(xiàn)，在小鼠脾臟細(xì)胞中，MDSCs 移植早期，B淋巴細(xì)胞的分化發(fā)育過程中未見Notch2和Jagged2的參與，但在MDSCs 移植晚期，Jagged2的mRNA的表達(dá)增加，對(duì)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育過程起到了調(diào)控作用。而當(dāng)使用3倍劑量的當(dāng)歸補(bǔ)血湯時(shí)可在MDSCs移植早期通過調(diào)控Notch2和Jagged2進(jìn)而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的發(fā)育。

這些研究結(jié)果均證實(shí)了Notch信號(hào)通路在MDSCs向造血方向分化的過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，而且通過經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯進(jìn)行干預(yù)可以促進(jìn)其增殖和分化，為MDSCs的造血分化研究提供了重要的理論參考和新的研究思路。雖然課題組初步發(fā)現(xiàn)了Notch信號(hào)通路在MDSCs造血分化過程中的調(diào)控作用，但是MDSCs向造血方向分化具體的調(diào)控機(jī)制以及MDSCs移植入小鼠體內(nèi)其歸巢與轉(zhuǎn)歸機(jī)制仍不明晰，尚待進(jìn)一步深入探究。

2.3.2 Wnt信號(hào)通路:Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路，在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、干細(xì)胞自我更新和分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生理病理過程中，具有至關(guān)重要的作用。Wnt信號(hào)通路主要分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路、非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路。經(jīng)典 Wnt/β-catenin信號(hào)通路由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受體蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成。當(dāng)Wnt分泌蛋白與Frizzled受體蛋白發(fā)生結(jié)合時(shí)，Wnt信號(hào)通路的靶基因激活，開始表達(dá)。研究表明，激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以上調(diào)造血細(xì)胞生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和必需的特異性標(biāo)志物，也能促進(jìn)造血多潛能祖細(xì)胞的形成[41,42]。而非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號(hào)通路也參與了HSCs的增殖和分化，并可能是通過與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的相互作用共同維持造血的動(dòng)態(tài)平衡。

經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在MDSCs的分化中扮演著重要角色，參與調(diào)控MDSCs的多向分化，在造血發(fā)生和重建的過程中必不可少，而Wnt3、Wnt3a、Wnt5a和Wnt10b等是其中重要的造血基因[43,44]。課題組王麗帆等[45]構(gòu)建MDSCs與BMSCs共培養(yǎng)體系，以當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清進(jìn)行干預(yù)，并分別加入Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑和抑制劑，以研究在體外造血微環(huán)境中肌源性干細(xì)胞 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)情況及當(dāng)歸補(bǔ)血湯的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)劑組中與造血相關(guān)的Wnt3、Wnt3a、CD34等基因、Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因β-catenin、干細(xì)胞增殖分化關(guān)鍵因子C-myc以及細(xì)胞增殖因子CyclinD1的mRNA表達(dá)水平明顯高于抑制劑組，表明當(dāng)Wnt信號(hào)通路持續(xù)激活時(shí)，MDSCs 具有更強(qiáng)的增殖分化能力，顯現(xiàn)出較強(qiáng)的造血潛能，且當(dāng)加入當(dāng)歸補(bǔ)血湯載藥血清時(shí)，該現(xiàn)象更明顯。另外，課題組劉志強(qiáng)等[33]通過體外培養(yǎng)MDSCs，采用基因測(cè)序及PCR等技術(shù)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中的相關(guān)基因在MDSCs增殖分化過程中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)論是MDSCs單培養(yǎng)組還是MDSCs與BMSCs共培養(yǎng)組，具有造血意義的Wnt2、Wnt3以及Wnt5a的mRNA表達(dá)量均高于新鮮分離的MDSCs組，且共培養(yǎng)組的mRNA表達(dá)量更具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們認(rèn)為，Wnt信號(hào)通路可能參與了MDSCs的造血分化過程，但其中造血相關(guān)基因之間的相互關(guān)系仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

3 MDSCs在造血分化過程中存在的問題

筆者通過全面的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于MDSCs造血功能的研究較為有限。本課題組進(jìn)行了多年的研究，對(duì)其中的機(jī)制有了初步的了解，但MDSCs的造血分化并不是一個(gè)簡(jiǎn)單的過程，需要依靠眾多條件的共同干預(yù)作用，而其中存在許多較為復(fù)雜的問題。比如，MDSCs向造血方向分化，不僅需要依靠造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，也需要通過各信號(hào)通路的調(diào)控作用來(lái)維持造血分化的平衡，而我們尚未探究其中具體的骨髓基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子是如何影響MDSCs造血分化的。其次，盡管課題組初步發(fā)現(xiàn)了Notch和Wnt兩條信號(hào)通路在造血分化過程中起到了一定的調(diào)控作用，但在這過程中兩條通路是否存在串話關(guān)系以及其中具體的調(diào)控機(jī)制尚未明確，并且信號(hào)通路的調(diào)控作用可能會(huì)因?qū)嶒?yàn)方法的不同而產(chǎn)生不同甚至相反的作用。另外，造血微環(huán)境中存在多條通路，HSCs在增殖分化過程不僅受到Notch和Wnt兩條信號(hào)通路的調(diào)控，還受到BMP/TGF-β、JAK2-STAT5、Hedgehog等多條信號(hào)通路的調(diào)控，那么這些通路是否也參與調(diào)控MDSCs的造血分化過程都需要我們進(jìn)一步探索。

另外，我們發(fā)現(xiàn)模擬體外造血微環(huán)境中培養(yǎng)的MDSCs，仍然能向成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞等方向分化，顯現(xiàn)出干細(xì)胞強(qiáng)大的分化特性。因此，如何提高M(jìn)DSCs取材分離的純化率、提高造血誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中向造血細(xì)胞分化的效率，以及如何在保證MDSCs干細(xì)胞特性的前提下進(jìn)行體外擴(kuò)增以獲得大量細(xì)胞，這些都是需要在后期實(shí)驗(yàn)中不斷攻克的難關(guān)。此外，目前研究中尚未明晰MDSCs移植后在受體內(nèi)具體的遷移、歸巢途徑。在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們希望通過對(duì)MDSCs進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)進(jìn)行示蹤觀察，了解其運(yùn)動(dòng)軌跡，以便更好的分析MDSCs的造血分化過程以及對(duì)造血功能系統(tǒng)的影響。

4 展望

隨著醫(yī)學(xué)生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞治療和基因治療逐漸成為研究的熱點(diǎn)，醫(yī)學(xué)科研工作者通過大量的實(shí)驗(yàn)不斷探求疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以期找到多途徑、更有效的治療方法，攻克難治性疾病，促進(jìn)人類健康。而干細(xì)胞因其強(qiáng)大的無(wú)限自我更新、增殖分化的能力，可通過移植到靶器官中發(fā)揮相應(yīng)的作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。作為成體干細(xì)胞的一種，MDSCs不僅可以治療肌肉骨骼相關(guān)疾病，參與神經(jīng)損傷修復(fù)以及糖尿病的治療[46,47]，更因其造血分化的潛能不斷得到發(fā)掘，給惡性血液病的治療提供了新的思路。相比較HSCs移植的局限性，MDSCs具有取材容易、利于體外培養(yǎng)和免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，如果能夠在今后的研究中明確其在造血分化過程中的具體機(jī)制，即有望成為移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中新的種子細(xì)胞，為更多的血液病患者帶去新的希望。